1、流式细胞术免疫标记应用简介,上次流式细胞术讲座内容（概述）,流式细胞术的一般介绍流式细胞术在临床检测和科研中的应用,流式细胞仪可检测的细胞参数,细胞结构细胞大小细胞颗粒性程度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量,细胞功能细胞表面蛋白抗原细胞胞浆内蛋白性抗原细胞内细胞因子细胞增殖细胞内钙离子浓度,免疫标记技术,免疫标记技术（immunolabelling technique）:是指用荧光素、放射性同位素、酶、发光剂或电子致密物质等作为示踪剂，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。流式细胞术检测蛋白质分子：免疫荧光标记技术,FACSCalibur流式细胞仪能够检测的荧光（Fluoresc
2、ence）信号,FL1（第一荧光）-FITC(异硫氰酸荧光素）FL2（第二荧光）-PE（藻红蛋白）FL3（第三荧光）-PerCP,PeCy5等PL4（第四荧光）-APC（藻青蛋白）,双色直接染色,流式细胞术免疫荧光标记的应用,检测细胞表面蛋白抗原检测细胞胞浆内蛋白性抗原检测细胞内细胞因子优势：在同一细胞上同时检测多种标志,血液系统各型细胞免疫标志,CD34+抗原在早期造血祖细胞内呈高水平表达，随着细胞成熟其表达呈进化性下降，继而消失。CD38抗原是造血干细胞向多系定向分化的标志之一，并随一定的分化过程表达上调 最近发现CD90（Thy-1）是比CD34更早的干、祖细胞标志结合多种分化抗原的表达
3、可以作为造血细胞不同发育阶段的标志。如CD34+、CD33+细胞群为多能干细胞向髓系定向的标志；CD34+、CD19+多为多能干细胞向B系定向的祖细胞。CD34+、TdT+、CD10+、CD7+则被认为是向T系定向的祖细胞。,造祖/干细胞,T细胞及其亚群 T祖细胞（pro-T）的表型为CD34+、TdT+、CD10+、CD7+未成熟T细胞标志CD3、CD4和CD8。在T细胞发育过程中，CD7是最早出现的T细胞标志，且贯穿表达在整个T细胞分化发育过程中。胸腺细胞要分化发育为有功能的成熟T细胞，细胞表面标志需经历一定的变化过程。,T细胞标志,进入外周淋巴器官和血液，执行免疫功能,CD7+、CD2-
4、、CD3-、CD4-、CD8-、TCR-,CD7+、CD2+、CD3+、CD4-、CD8-、TCR-（即CD4、CD8双阴性）,CD7+、CD1+、CD2+、CD3+、CD4+、CD8+、TCR+（即CD4、CD8双阳性）,CD7+、CD2+、CD3+、CD4+、CD8-、TCR+,CD7+、CD2+、CD3+、CD4-、CD8+、TCR+,CD3+、CD4+、CD8-：T辅助/诱导细胞（Th/Ti），占T细胞总数的60%70%；CD3+、CD4-、CD8+：T抑制/杀伤细胞（Ts/Tc），20%30%；CD3+CD4+CD8+：1%3%；CD3+CD4-CD8-：1%10%。前三种表型细胞的
5、TCR主要为TCR，而CD4-CD8-T细胞主要表达TCR，他们都执行细胞免疫功能。,正常外周血中通常存在的T细胞亚群,CD2是绵羊红细胞受体和淋巴细胞功能相关抗原-2（LFA-2），表达于人95%T细胞、50%70胸腺细胞和大颗粒淋巴细胞（LGLNK）的表面。CD3是T细胞表面抗原，表达于成熟胸腺细胞、静息和激活的的外周血T细胞，是鉴定T细胞的重要标志，其胞浆和膜CD3是早期和普通型T细胞白血病的主要分型标记。,CD5、CD7是T细胞白血病较特异的标记，也是髓系白血病时最常见的伴随标记。CD45则是白细胞的共同标记抗体CD25和CD28主要分布于活化T淋巴细胞表面，为活化T淋巴细胞标志。胸腺
6、细胞、静止T细胞、静止B细胞以及NK细胞表面无表达。,末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）和II类人类白细胞抗原（HLA-DR）的阳性表达对早期T细胞白血病的诊断有重要价值。8090和95以上的NK细胞表达CD16和CD56。用CD3-CD16+CD56+可定义NK细胞。,B细胞标记,B细胞 B细胞的分化主要分为B祖细胞、前B细胞、未成熟B细胞、成熟B细胞、活化B细胞和浆细胞6个阶段。（1）B祖细胞（pro-B）：此期最早表达的B细胞特异性抗原是CD19，同时表达CD34、细胞核TdT、HLA-DR、CD40、CyCD22。（2）前B细胞（pre-B）：CD34和TdT消失，出现CyCD79、CD1
7、0、CD20、CD9、CDw78、CD74，c+（胞浆IgM重链）。,（3）未成熟（早期）B细胞（immature B cell）：CD9、CD10消失，出现 SIgM、CD22。CD20、CD24、CD40、CD72、CD74、CDw78、CD79表达增加。其他新的B抗原CD37、CD2、CDw75、CDw76相继出现。（4）成熟B细胞（mature B cell）：SIgM和IgD同时表达，并出现CR、FcR和丝裂原受体，上述B细胞抗原继续存在。,（5）活化B细胞（activated B cell）：成熟B细胞被抗原或丝裂原刺激后，成为活化B细胞，继之增生和分化。在此过程伴随表达B细胞激活
8、抗原CD23、CD77、CD80、CD86和其他激活相关抗原如CD25、CD26、CD30、CD69、CD70、CD71、CD38等。膜结合型Ig逐渐减少，分泌型Ig逐渐增加。（6）浆细胞（plasma cell）：激活B细胞进一步分化成为产生抗体的浆细胞，这时获得PC-1、PCA-1和CD138浆细胞特异抗原，CD85表达增加，CD38抗原再出现。而SIg和上述B抗原消失。CD79仍可存在于胞质中。,B细胞上的CD抗原分为：B细胞限制性（特异性）抗原：CD19、CD20、CD21、CD22、CD77 和CD79，它们的表达只限于B细胞上，在鉴别细胞系上是十分重要的标志。B细胞相关性抗原：CD
9、5、CD9、CD10、CD23、CD24、CD37、CD40、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CDw78、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD124和CD139。B细胞表面的受体SIg，是B细胞特异性识别抗原的受体，也是B细胞重要的特征标志。,CD19、CD20、CD21、CD22和CD24都是B细胞白血病和淋巴瘤最常用的标记抗体。对中国人而言，CD19是特异性和敏感性最高的。CD19是一种早期的、谱系特异的泛B细胞表面抗原，从最早期B细胞前体细胞阶段即表达，持续存在直至B细胞终末阶段外周血T细胞、单核细胞、粒细胞和血小板表面不表达C
10、D19。,髓系细胞标记,包括CD11b、CD13、CD14、CD15、CD33、CD36、CD45、CD68、CD41、CD42、CD61、CD63和CD117等。这些免疫标记种类繁杂，缺乏特异性和敏感性（与淋巴细胞标记抗体相比）。,3.髓系标记 从髓系祖细胞终末分化的成熟细胞（粒细胞、单核细胞、血小板和红细胞）间各阶段细胞特征性标志还不十分清楚。根据粒细胞和单核细胞上的髓系抗原表达试将其大致分为七种类型:（1）粒细胞和单核细胞上都有较强表达的抗原有：CD13、CDw17、CD32、CD87、CD88、CD89、CDw92、CD93、CD156、CD157、CD163。其中CD13在原粒细胞质
11、中表达比膜上早，在AML诊断上十分重要。（2）以粒细胞为主，但也存在于单核细胞的抗原有：CD15和CD65。CD65是特异性髓系抗原，强表达在成熟粒细胞，弱表达在单核细胞上。（3）基本表达在粒细胞上的抗原有：CD16b和CD66。,（4）以单核细胞为主，但也表达在粒细胞的抗原有：CD14和CD33。CD14主要强表达在单核-巨噬细胞，弱表达在粒细胞上。CD33抗原分布只限于造血系统内，表达在髓系祖细胞CFU-GEMM、CFU-GM、CFU-G、CFU-M以及相应的白血病细胞上。（5）基本只表达在单核细胞上的抗原有：CD16、CD64、CD68、CD91、CDw136和CD65。CD68是目前发
12、现可靠的检测造血系统内单核-巨噬细胞系统的特异标志。,（6）造血干、祖细胞抗原有：CD34和CD90。CD34除表达在早期造血干、祖细胞外，还表达在约40%的AML和60%的ALL上（7）其他髓系相关抗原：这些抗原主要存在于其他系细胞上，但在某些髓系细胞上也有表达，如：CD4、CD7、CD9、CD10、CD11b、CD11c、CD31、CD36、CD38等。,巨核细胞系 在巨核细胞系发育过程中依次出现PPO、CD41a（b/a）、CD41b（b）和CD61（a）、CD42（b）。还可表达CD36（强）。正常情况下血小板处于静止状态。目前研制出的抗血小板单抗如CD9、CDw17、CD31、CD3
13、6、CD41a、CD41b、CD42a、CD42b、CD61，主要都针对静止的血小板。当血小板被激活时，血小板中颗粒内容物释放，整合到活化的血小板质膜内，成为一些激活抗原，如CD62（P-选择素）、CD63及CD107a和CD107b。红细胞系 血型糖蛋白A、H。,流式细胞术免疫荧光标记抗体的选择,有特异性标志：选择一种即可，如CD3标记总T细胞；没有明显的特异性标志：可以采用不同抗体组合，标记某种细胞。如Treg细胞公认的标志为CD4+CD25+FoxP3+.表面分子标记可以与胞内分子标记相结合；免疫荧光标记也可以与其它的标记方法相结合：如与CFSE 进行不同细胞亚群增殖分析。,流式细胞术表
14、面分子免疫标记操作举例,淋巴细胞亚群检测操作程序,一、实验原理：人的淋巴细胞根据其生物功能和细胞表面抗原的表达可分为三大类：T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK自然杀伤细胞。T淋巴细胞表达CD3；B淋巴细胞表达CD19；NK自然杀伤细胞表达CD56或CD16，并且不表达CD3。利用各种单克隆抗体与淋巴细胞表面抗原结合，再配多色荧光染料，即可以把淋巴细胞区分为各种亚型。进面得到各亚群的比例。,二、主要试剂：MultiTEST IMK Kit(美国BD Biosciences公司；CAT:340503)，其中包括：1、CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PreCP/CD4-APC2、CD3-FITC
15、/CD16+56-PE/CD45-PreCP/CD19-APC3、FACSLysing Solution三、实验操作：1、标本采集：使用EDTA-K2抗凝真空采血管，抽取静脉血2ml。2、染色和固定细胞：标本管编号A，取两只流式专用管A1、A2。A1管加入CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PreCP/CD19-APC 20uL；A2管加入CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PreCP/CD4-APC 20Ul。A1、A2管中分别再加入全血100Ul，混均。置室温，避光孵育15min。加入FACSLysing溶血液2.0ml，置室温，避光孵育10min。300g离心5min，弃上清液。PBS洗涤细胞两次，300g离心5min，弃上清液。1%多聚甲醛0.5mL。3、上机检测；分析结果；打印实验报告。,流式细胞术胞内分子免疫标记操作流程,流式细胞术胞内分子免疫标记操作举例,B淋巴细胞胞内ZAP-70分子检测操作程序,主要试剂：,【临床意义】,
