1、生物化学实验理论知识考查题1.酶有什么不同于一般催化剂的特性？在酶的分离纯化过程中要注意哪些环节？1、高效性2、专一性3、条件温和 4、酶活性的可调控性 5、酶催化的活性与辅酶、辅基和金属离子有关6、不稳定易失活酶是一种特殊的蛋白质，在分离纯化过程中需要注意温度以及PH值等的控制，注意在纯化过程中所使用的缓冲溶液的离子强度的控制(常用PBS缓冲溶液)，在实际纯化过程中，一般要在低温冰箱中进行，缓冲溶液中注意加入EDTA二钠盐(1-5mM)螯和重金属离子一般避免酶失活。2.如何评价蛋白质纯化方法的优劣？判断分离提纯方法的优劣，一般用两个指标来衡量，一是总活力的回收；而是比活力的提高倍数。理想的分
2、离提纯方法希望比活力和总活力越高越好，但两者往往不可兼得。因此在考虑分离条件和方法时，需要在比活力多提高一些和总活力多回收一些作适当的选择。3、纯化蛋白质的层析方法有哪些？凝胶过滤层析；离子交换层析；疏水层析；亲和层析；聚焦层析；高效液相层析。4、请回答Q Sepharose-柱层析法纯化蔗糖酶的基本原理是什么？离子交换剂是以纤维索或葡聚糖凝胶等不溶性物质为母体，通过酯化、醚化或氧化等化学反应引入阳性或阴性离子基团的特殊制剂可与带相反电荷的化学物质进行交换吸附。Q Sepharose柱代表季氨基琼脂糖色谱，以琼脂糖作为不溶性母体引入季铵型基团，为强阴离子交换剂。酵母蔗糖酶的等电点为5.0左右，
3、在Tris-HCl缓冲液（pH 7.3）下带负电。在pH7左右，Q Sepharose凝胶带正电，与带负电的蔗糖酶结合。洗脱液中的离子基因与结合在离子交换剂上的蛋白质离子基团相竞争时亲合力小的蛋白质分子先被解吸而洗脱下来，而亲合力大者则后被解吸而后洗脱下来。因此依靠增加缓冲液的离子强度和(或)改变酸碱度即可改变蛋白质的吸附状态，使不同亲合力的蛋白质得以分离。5.什么是酶活力？根据实验体会，在进行酶活力测定时要注意哪些问题？什么是酶活力:酶活力也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的活力。测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度，一般采用测定酶促反应初速度的方法来测定酶活力。酶促反应速度可用单位时间内
4、、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。酶活力测定的注意事项:（1）量取时要用专门的移液管，每次加入新的试剂立即混匀。将各试管内液体混合均匀。震荡混匀。移液管使用方法，按减少量加入准确。（2）测吸光值要求：测定数据在（0.1-0.7A），波动可以到0.2-0.8，最小不能小于0.1，最大不能超过1.0。要求R2值接近1，至少0.999。（3）稀释样品要从低到高的顺序，即CBA，因为容量瓶用的同一个，防止污染使浓度有改变。（4）做酶水解蔗糖反应：稀释酶液和蔗糖反应前要在35度水浴锅预热，每个试管准确计时，每个单独反应单独结束。加入0.05毫升，
5、2mol/L NaOH/ml ，立即摇匀！（5）测反应液吸光度：从各水解反应液中取出适合量的体积（V测）。 用移液管量取每种反应液应先取对照后取反应液。 如果测得的OD 值结果不在标准曲线还原糖范围内，则可增加或减少取样量，加倍或减半，直到OD值在标准曲线范围内为止。P.S酶活力测定的注意事项给的答案跟老师PPT上的答案不一样，然后我选择了老师PPT上的答案。6.请回答酶活力、酶活力单位、酶的比活力的含义？酶活力也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的活力。测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度，一般采用测定酶促反应初速度的方法来测定酶活力。酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物
6、的增加量来表示。酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。酶活力单位是酶活力的度量单位。酶活力单位可以自己定义，1个酶活力单位是指在特定条件（25或其它最适条件）下，在单位时间内能将一定量底物转化成产物所用的酶量。国际酶学委员会于1961年规定,在确定的最适反应条件下,每分钟催化1mol底物转变成产物所需的酶量为一个酶活力单位,单位符号为IU或U。比活力(性)是酶纯度的量度,比活力指的是每毫克蛋白质所具有的酶活力单位数，一般用酶活力单位/mg蛋白质表示。酶的比活力在酶学研究中用来衡量酶的纯度，对于同一种酶来说，比活力越大，酶的纯度越高。利用比活力的大小可以用来比较酶制剂中单位质量蛋白质的催
7、化能力，是表示酶的纯度高低的一个重要指标。7、Folin-酚试剂法测定蛋白质浓度的基本原理是什么，此法有什么优缺点？此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深蓝色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。 Folin酚试剂中的磷钼酸盐磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基还原，产生深蓝色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比，这一蓝色溶液在750nm和660nm有较强的光吸收能力，固可用来测未知样品的蛋白质浓度。优点：灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多；缺点：
8、费时较长，要严格控制操作时间，蛋白质浓度和光吸收值线性关系不够严格，且专一性较差，干扰物质较多。凡干扰双缩脲反应的基团，如 -CO-NH2, -CH2-NH2, CS-NH2以及Tris缓冲液、蔗糖、硫酸铵、巯基化合物均可干扰Folin酚反应，而且对后者的影响还要大得多。此外，酚类、柠檬酸对此反应也有干扰作用。8、微量凯氏定氮法的基本原理是什么？操作时应注意哪些环节？原理：蛋白质与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量，即可计算出样品的含氮量，根据换算系数，即可计算出蛋白质的量。含氮量*
9、6.25=蛋白含量。 本法适于测定0.22.0mg的氮（老师PPT上 0.1-2.0mg）。操作时注意消化完全彻底（溶液澄清浅绿色），蒸馏的时候密封好减少氨的挥发这一部分损失，氨被硼酸全部吸收，滴定要准确。9、SDSPAGE测定蛋白质的相对分子量是根据什么原理？ SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除
10、了不同分子间的电荷差异和结构差异。此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子形状无关。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。10、常用沉淀蛋白质的方法有哪些？能否用其它沉淀法分离蔗糖酶？至少说出3种方法。中性盐沉淀（盐析法）、有机溶剂沉淀、选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）、等电点沉淀、有机聚
11、合物沉淀、重金属离子沉淀11.生物化学实验你学了多少种蛋白质含量测定方法？试比较优缺点。1、凯氏定氮 : 将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定。干扰少，用于标准蛋白质含量的准确测定。灵敏度低，适用于0.1-1.0 mg氮，费时3-4小时。2、双缩脲法（Biuret法):肽键碱性Cu2紫色络合物。灵敏度低 20 mg ，中速 2030分钟，干扰物多（硫酸铵，Tris缓冲液）。用于快速测定,但不太灵敏；不同蛋白质显色相似。3、紫外吸收法 :蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处有较大吸光值。较为灵敏 50100 mg， 快速 10分钟 ，各种嘌吟和嘧啶干扰结果，用于层析柱流出液的测定。4、Foli
12、n酚试剂法（Lowry法）:磷钼酸磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原。灵敏度高 5 mg ，较耗时，4060分钟， 干扰物多， 操作要严格计时，试剂配置较困难。5、考马斯亮蓝法(Bradford法) :考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时,其最大吸收光波长由465nm变为595nm。灵敏度最高 5mg ，快速515分钟 ，干扰物质少（去垢剂）；颜色稳定。12.考题：微量凯氏定氮实验中消化时所加的K2SO4、CuSO4各起什么作用？常量凯氏定氮与微量凯氏定氮在操作上有何不同？CuSO4的作用：催化剂K2SO4的作用：提高沸点，沸点由330提高到400加速了反应过程。不同：常量由于可以把全部消化液一同蒸馏测定
13、，故较适合蛋白质含量低的样品。微量差别在装置上，二者皆属于水蒸汽蒸馏操作，只是前者把蒸汽直接导入反应室内，后者把蒸汽导入反应室外加热，由于二者皆取消化液的一部份操作，可平行蒸馏操作，但检测限要较常量法高。考题：酶活力是怎么定义的？酶活测定中需要注意哪些？ 13，酶活力是怎么定义的？酶活测定中需要注意哪些？ 答：也称酶活性，是酶催化反应的能力。酶活力单位是一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物所需要的酶量。 注意事项：（1）仪器不清洁，含有其他物质，比如杂蛋白，抑制剂，及针对本次实验的其他还原性物质等 （2）底物受空气影响自然分解（3）绝大多数酶会因久置而活力降低存于4冰 箱中。 （4）
14、酶促反应过程中，只有最初一段时间内反应速度与酶浓度成正比，随着反应时间的延长，反应速度即逐渐降低（5）pH值和温度 （6）测定时的底物 （7）反应的时间 8）其他因素14，建立离子交换法纯化蛋白质的方法需要摸索哪些条件？答：（1）p H值，缓冲液的pH值对于蛋白结合离子交换层析有非常大的影响，需要先摸索出合适的pH值，既能保证蛋白结合上离子交换层析，又不会出现不稳定沉淀的情况。（2）盐浓度，盐浓度是离子交换层析洗脱的关键，需要摸索出蛋白能在什么样的盐浓度下被洗脱，且洗脱后纯度能够达到最初的要求。（3）柱体积，尽管各种离子交换层析均有理论结合蛋白量，但各种蛋白情况不一样，需要摸索出能够完全结合目
15、的蛋白合适的柱体积。既不会太大造成洗脱浓度过稀，也不会太小造成目标蛋白过载。（4）温度，温度可能会造成蛋白变性等等。15、Q Sepharose的母体是什么？其所带的活性基团又是什么？本实验为何采用该离子交换剂？Q Sepharose是以琼脂糖作为不溶性母体引入季铵型基团，为强阴离子交换剂，具有硬度大，性质稳定，凝胶后的流速好，分离能力强等优点。(1)提高实验效果。琼脂糖凝胶离子交换介质载量高，分离纯化蔗糖酶穿透峰小，分辨率高,回收率高。蔗糖酶与杂蛋白得到了很好的分离,提高纯度,真正体现离子交换色谱蛋白质纯化上的优越性,增强实验的意义。(2)缩短实验时间。减少不必要的实验重复，实验过程比较紧凑
16、。(3)节约实验支出。琼脂糖介质在分辨率、回收率、流速等具有优越性。且其化学稳定性极高，不易破碎，可以承受1MNaOH 的清洗，重生效果好,可以使用数百至上千次，因而降低了成本。16、胞内酶提取过程中需要破壁，常用破壁方法有哪些？机械方法：液氮研磨法、高压匀浆法、高速珠磨法、超声波破碎法非机械法：甲苯自溶法、化学渗透法、酶溶法、SDS抽提法、反复冻融法、低渗溶液法17、微量凯氏定氮实验中消化的作用是什么？SDS化学名是什么？作用：样品与浓硫酸共热,含氮有机物即分解产生氨（消化）SDS：十二烷基磺酸钠18、SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子量实验中SDS起什么作用？SDS是阴离子去污剂，作为变
17、性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。19.简述浓缩胶的浓缩效应。学长给的答案（感觉不是很好）上样孔里加样的时候，样品是有一定的高度的，样品里的蛋白没有站在一条起跑线上。浓缩胶的作用就是压缩样品中的蛋白质成为一条细线站在同一条起跑线上，这样影响蛋白迁移速率的因素就只有分子量的大小了，也就更有可比
18、性了。DNA电泳的驱动力靠DNA骨架本身的负电荷，蛋白质电泳的驱动力靠与蛋白质结合的SDS上所携带的负电荷。SDS将蛋白质变性成直线分子并紧密包裹于其上，使得其所携带的电荷与蛋白分子量成了一定的比例，所以当样品跑出浓缩胶后，剩下的就和核酸电泳一样了。生物化学上指在进行SDS-PAGE（SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳）中由于凝胶孔径的不连续性（2种孔径）、缓冲液离子成分的不连续性(2种缓冲体系)、PH值（3种PH）和电位梯度的不连续性使得蛋白质分子在浓缩胶和分离胶的界面处浓缩成一条狭小的缝带，成为浓缩效应。自己查的凝胶由两种不同的凝胶层组成，上层为浓缩胶，下层为分离胶。浓缩胶为大孔胶，缓冲液pH67
19、，分离胶为小孔胶，缓冲液pH8.9，这样便形成凝胶孔径和缓冲液ph值的不连续性。浓缩胶中HCl全部解离为Cl-，称为快离子，极少部分甘氨酸（等电点pI6.0）解离为Gly-，称为慢离子。有效泳动率依次为Cl-蛋白质Gly-。电泳开始后，快离子泳动到最前面，快慢离子之间形成一个离子浓度低的区域，即低电导区域，而电导与电压梯度成反比，因此低电导区有较高的电压梯度，驱使慢离子加速泳动。当快慢离子移动速率相等时，就建立一个不断向阳极移动的界面，蛋白质的泳动速度恰好介于快慢离子之间，因而被挤压在快慢离子之间形成一条窄带。这种浓缩作用可使蛋白质浓缩数百倍。另一方面，浓缩胶为大孔径凝胶，分离胶为小孔径凝胶，
20、待分离蛋白质在大孔凝胶中受到阻力小，移动速度快，泳动到小孔凝胶处时，阻力突然加大，速度变慢，这样就在两种凝胶的交界处使待分离样品的区带变窄，浓度升高。20.简述SDS-PAGE测定蛋白质分子量的基本原理。SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。此鉴定方法中，蛋白质的迁移
21、率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子形状无关。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。21、乙醇沉淀提取酶需要注意哪些事项？（1）必须缓慢加入（2）边加边搅拌（3）避免产生泡沫，使蛋白质的溶解度呈一个光滑的曲线（4）提取液和乙醇在混合时要采取冰浴，混合过程不少于35min。22、影响酶活力的因素有哪些？pH、温度、紫外
22、线、重金属盐、抑制剂、激活剂等23.柱平衡指的是什么，目的又是什么柱平衡指在柱的使用前用PH与样品相同的缓冲液对柱子进行冲洗。目的是使柱子上的基团都带有离子交换剂中的阳离子，并在柱内营造一个相同的外在环境，减少样品本身特性因素外其他因素的影响：PH、温度等24.凝胶过滤和SDS-PAGE均具有分子筛的作用，说明它们有何不同？为什么？ 过滤层析：当被分离物质的各成分通过凝胶时，小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼，并随着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动，从一个颗粒的网眼流出，又进入另一颗粒的网眼，如此连续下去，直到流过整个凝胶柱为止，因而流程长、阻力大、流速慢；大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻而不能进入
23、凝胶网眼，只能随流动相沿凝胶颗粒的间隙流动，其流程短、阻力小、流速快，先于小分子流出层析柱；分子大小介于两者之间的则居中流出。这样被分离物质即被按分子的大小分开。SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。分子量大的蛋白质跑得慢，分子量小的蛋白质的条带在前面。25.柱层析实验中洗穿透峰的目的是什么？穿透峰中含有哪些物质？用来洗掉缓冲液中未与交
24、换剂结合的蛋白质，使复杂的组份分离完全。穿透峰中包括大量未结合的游离蛋白如阳离子的杂蛋白、不带电荷的杂蛋白、带阴离子的杂蛋白。26、什么叫对照实验？如何做对照实验？对照组是在需要进行对比的科学实验中，起辅助、对比作用，以突出并有力支持从实验组所能得出结论的单组或多组实验。在比较性实验研究中，将实验对象分为二个或数个独立的组，其中一组施加实验因素，而另一组不施加或施加其他因素。前者称为实验组，后者即为对照组。对照又分为空白对照、自身对照、条件对照、相互对照等类型。对照组要尽可能消除无关变量。 如何做：设置对照组有4种方法：(1)空白对照(2)条件对照(3)自身对照(4)相互对照 所有用生物材料要
25、相同。即所用生物材料的数量、质量、长度、体积、来源和生理状况等方面特点要尽量相同或至少大致相同。 所用实验器具要相同。即试管、烧杯、水槽、广口瓶等器具的大小型号要完全一样。 所用实验试剂要相同。即试剂的成分、浓度、体积要相同。尤其要注意体积上等量的问题。 所用处理方法要相同。如：保温或冷却：光照或黑暗；搅拌或振荡都要一致。有时尽管某种处理对对照实验来说，看起来似乎是毫无意义的，但最好还是要作同样的处理。 27、用离子交换层析分离蛋白质，流动相的pH如何选择？对于阳离子交换剂一般是pH值从低到高洗脱，阴离子交换剂一般是 pH 值从高到低。如蔗糖酶的等电点为5.0，在pH为7时呈负电与结合剂结合。
26、洗脱液pH大于5.0，初始由pH7.3逐渐降低pH，使蔗糖酶带的阴离子逐渐减小，结合力减弱，即可将结合的蔗糖酶被洗脱下来28、离心机使用需要注意哪些？1、离心机要放在平坦和结实的地面或实验台上，不允许倾斜；2、通常离心机都会有登记表，请在使用前确实登记使用者、转头、转速、时间；3、离心管一定要用天平平衡重量（重量平衡），盖上离心管盖子并旋紧；4、把平衡好的离心管对称地放入离心陀中（位置平衡），盖上离心陀的盖子，注意有无旋紧；5、完成离心时，要等待离心机自动停止，不允许用手或其他物件迫使离心机停转，待转头完全静止后，才能打开舱门，请尽快取出离心管，先观察离心管是否完全，以及沉淀的位置，尽速把上清
27、倒出，小心不要把沉淀弄混浊。29.什么叫梯度洗脱？为什么要梯度洗脱？梯度洗脱又称为梯度淋洗或程序洗脱。在同一个分析周期中，按一定程度不断改变流动相的浓度配比，称为梯度洗脱。从而可以使一个复杂样品中的性质差异较大的组分能按各自适宜的容量因子k达到良好的分离目的。当被吸附的蛋白质的Kd值有差异时，降低pH值或提高离子强度均可使之洗脱下来，用含阴离子（如Cl-)的溶液洗柱，含电荷少的蛋白质首先被洗脱下来，增加Cl-浓度，含电荷多的蛋白质也被洗脱下来，于是两种蛋白质被分开。梯度洗脱的优点：1.缩短分析周期；2.提高分离能力；3.峰型得到改善，很少拖尾；4.增加灵敏度。但有时引起基线漂移。30.酶活测定
28、中需要控制反应时间，常用的有哪几种终止酶反应的方法？（1）温度调节：酶促反应一般都在一定的温度范围内有效，可以突然降低温度或者升高温度，使酶失去活性。 （2）pH调节：酶在一定的pH内具有活性，超出一定范围后降低或失去活性。 （3）加酶的抑制剂 (如底物类似物，某些金属离子等)，使得酶失去活力。 （4）大部分酶是蛋白质，可3加入有机溶剂使其变性。31、使用分光光度计的比色皿有哪几种？各在什么场合使用？按使用的波长范围可分为三大系列，即可见光系列（称玻璃比色皿），紫外可见光系列（称石英比色皿），红外光系列（称红外比色皿）测试在紫外区有吸收的样品时用石英比色皿，测试只在可见光区有吸收的样品时使用玻
29、璃比色皿，测试在红外区有吸收的样品时用红外比色皿32、为什么要做对照实验？凯氏定氮实验中用到的硫酸铜、硫酸钾各起什么作用？设置对照组的目的在于消除无关变量对实验结果的影响，增强实验结果的可信度。检验对比试验的效果。实验组和对照组之间仅有一个变量变化，结果不一样的地方一般认为就是由那个变量引起的。没有对照组，实验组的实验结果将会无法确定。33、酶反应需要控制哪些实验条件？如何控制？温度：对酶的作用具有双重影响，在较低的温度范围内，酶反应速度随温度升高而增大，但是超过一定温度后，反应速度反而下降。酶促反应的温度要尽量控制在恒定的最适温度下进行，温度波动要控制在1。该实验要将反应温度控制在35进行。
30、控制温度恒定的方法最常见的就是水浴加热保温，将两种或多种反应体系中的反应液分别在相同温度的水浴中进行预加热，然后在该温度下混合反应，准确测定反应时间后取出，测定酶活。 pH：在最适pH时，酶的活性最强，高于或低于最适pH，酶的活性都降低。该反应应控制pH为4.6左右。控制反应的pH可以通过加入一定量的缓冲液（例如PBS缓冲液、磷酸盐缓冲液、醋酸-醋酸盐缓冲液）缓冲液要有足够的缓冲容量，缓冲液的pKa与最适pH越接近，缓冲容量越大。有酸碱的产生或消耗的酶促反应，对缓冲容量的要求更高。通过pH计在显示器上实时反映体系中的pH值，用滴管滴加少量HCl或NaOH使反应体系的pH达到最适pH。 直接用缓
31、冲液 反应时间：酶活力测定时要控制好反应时间，并且各管的酶反应时间一定要一致。该反应规定蔗糖酶的活力单位是在3min内转化底物的酶量，所以应控制反应时间为准确的3min。将反应体系各溶液配制好或准备好后，分别在水浴中预热到最适温度，将最后一种反应物添加进去立刻摇匀后立刻用秒表等计时工具进行精确的计时。一定反应时间后，立刻加入终止反应的物质使反应停止，即可测定这段时间内的酶活力。 34、比色法测定时，OD值超过标准曲线线性范围时，为什么不能直接稀释已经显色的样品，而必须改变取样量重新显色，再测OD值？因为参加显色反应的物质浓度也影响了显色反应后OD值的线性。使得OD值超出线性范围的不是OD值本身
32、过高，而是加的反应物浓度太高或太低，不能正常显色（虽然颜色可能是对的），超出了显色反应的线性。测出的OD值数据就是不准的，需要重新取样使OD值在线性范围内。 35、丙烯酰胺聚合原理？凝胶孔径如何调节？聚丙烯酰胺聚合原理：聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（以后简称单体）在水溶液中聚合而成的亲水性高聚物，是一种透明而不溶于水并有韧性的凝胶。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。所以在凝胶电泳中除了具有电泳的分离外还具有分子筛
