1、试验教学内容 实验教学内容南方医科大学中医药学院中医诊断学教研室甲襞微循环检测实验【目的要求】1. 掌握不同中医证候甲襞微循环的改变情况及其对中医临床的指导意义。2. 熟悉甲襞微循环检测的方法和内容。3. 了解中医四诊客观化研究进展情况。【检测对象】正常人、血瘀证、血虚证、气虚证【检测内容】甲襞微循环【检测指标和方法】1.微血管形态2微血流动态3.微血管周围是否有渗出和出血现象,以反映微血管壁通透性和完整性的变化。【实验器材】1.显微镜：目前国内设计、制造的甲襞微循环显微镜大多是在体视显微镜的基础上配上适当光源组成。也可用普通生物显微镜代替。甲襞微循环观察都是在低倍率下进行，至少应备有8x物镜
2、、10x物镜和5x目镜各一个，最好采用平场消色差匀镜头，以减少因手表面球面差所致的成像模糊，如备有PK摄影镜则更好。2.光源：作为微循环检查用的光源要求能看清楚微血管、微血流和单个红细胞因此光源应具备3个条件：A强光L：由于观察视野的光线是以450角投照之折射光，要使视野清楚，光源强度至少应在5V、40W以上。但光线过强对观察者眼睛刺激太大，且使血管与底色之间反差减弱，也不适宜。B聚光：光源发出之光线应经透镜聚光，在观察甲襞处聚成一点，经调节后射在甲襞局部的光斑直径约0.5cm。C冷光：由于强光大多有热量发散，既会影响观察结果，又可能灼烧观察局部皮肤，因此常在聚光透镜前加上蓝绿色隔热玻璃片或滤
3、色膜。光源经此隔热滤光后，不仅使红细胞血流颜色加深，观察清晰，而且在光源的焦点上放一温度计，20分钟后最大温升不超过30C。此外，高压汞灯也能达到类似要求。如装有落射光源（内光源）的显微镜，则操作更为方便。3.目镜测微尺：这是安放在显微镜目镜内的一种测微标尺。固定式测微尺为一块圆形有机玻璃片，直径约15mm（图1-1-12）。在它的上面刻有直线标尺,分成510个大格又分成10小格，共计为50100不格。目镜测微尺在使用前必须经过标准的物镜测微器的校正，以求也每一小格刻度的实际长度。使用时将目镜测微尺安放在目镜的光阑上，再插入显微镜的目镜抽管中，即可进行测量。将每1个格的长度乘以所测量物（如毛细
4、血管的长度、宽度）的格数，即为景物的实际长度。目镜测微尺经校正后，该显微镜的目镜、物镜均应固定，如使用不同的显微镜或不同的目镜、物镜进行观测，则目镜测微尺需重新校正。4.手指固定架：甲襞微血管活体观测时，必须固定手指，消除颤动，常常使用石膏、有机玻璃或金属制的手指固定架，以方便观察或摄影。对于手指固定架，一般在求既能固定手指，又不能压迫观察局部的手指血管，手的姿势还应自然、舒适。5）香柏油：甲襞微血管位于手指甲襞皮肤之下，观察光源是以450角折射，因此观察局部必须涂上观察油其意在于：能透明皮肤；帮助光线折射。甲襞处涂油后，使皮肤光滑，当光线折射到此表面时，可消除皮肤凹凸不平而引起的光线漫反射，
5、而增加其透明度。所有的观察油最好能在达到无色、透明、有一定折光能力，其折射率应尽可能与皮肤相近，以免在观察油与皮肤之间形成界面。一般用香柏油、液状石蜡等均可。若配备有微循环显微镜的摄影装置、显微电视接收装置，或计算机显示、测量系统，则检测更为精确，甲襞微循环观察可在普通室内进行，室温最好控制在15250C之间。【实验过程】1实验准备2实验操作（1）中医诊断：按照传统中医辨证证的方法进行观察，并将结果记录相关表格之中。（2）检测表记录：（3）分析报告3实验报告（1）清点、整理并归还各种实验器材。（2）分析记录表，完成检测记录和实验报告，按时交任课老师。【注意事项】1. 室温适宜，室内光线要暗，受
6、检部位和探头加盖黑布，以防杂散光射入。2. 受检者体位要舒适、自然，休息30min后进行。 检测记录资料编号： 检测方法：实验仪器：检测内容：毛细血管袢周围的变化：a.清晰度 b.排列 c.外形 d.数目e.长度 f.管径 g.袢顶宽度 h.乳头下静脉丛i.管壁张力毛细血管袢内微血流的状态：a.血液流态 b. 袢顶血流 c.血流速度 d.血色毛细血管袢周围的变化：a. 袢周状况 b. 真皮乳头状态 毛细血管袢刺激试验：a. 冷刺激 b. 针刺激毛细血管袢功能测定：a. 微血管运动计数 b. 微血管压力测定检测结果：记录人： 检测日期： 年 月 日 实验报告资料编号： 实验时间：实验地点：实验目
7、的：实验方法：实验步骤：实验结果：结果分析：讨论：记录人： 检测日期： 年 月 日舌尖微循环检测实验【目的要求】1. 掌握不同中医证候舌尖微循环的改变情况及其对中医临床的指导意义。2. 熟悉舌尖微循环检测的方法和内容。3. 了解中医四诊客观化研究进展情况。【检测对象】正常人、血瘀证、血虚证、气虚证【检测内容】舌尖微循环【检测指标和方法】1.毛细血管袢的形态清晰：毛细血管袢轮廓清晰可见。模糊：毛细血管袢轮廓模糊不清。消失：甲襞乳头区内无微血管袢。方法：分类观察计数甲襞第一排管袢中10根毛细血管袢和清晰度，并计算百分比。正常参考值：85%以上微血管袢清晰。2排列整齐：毛细血管袢排列整齐。紊乱：毛细
8、血管袢排列不规则，甚至紊乱。方法：观察甲襞第一排列状况，每例检查10个视野，分类计算百分比。正常参考值：甲襞均排列整齐。3外形正常：毛细血管袢外形光滑，呈“发夹状”或“微弯交叉状”异常：除上述形状之外的其他管袢形状。方法：从甲襞第一排面）期_某一标致志微血管起，连续观察并分类计数10根毛细血管袢的外形，求出各类管袢的百分比。正常参考值：正常人随年龄增长异形管袢的比例有所增多。一般健康人正常管袢应占80%以上异常管袢超过30%才有意义。4数目：即每毫米长度内毛细血管的数目。甲襞微循环检查常直接计数与目镜测微尺刻度线相切的毛细积血管数，用“支/mm”表示。方法：将目镜测微尺的刻度线与甲襞第一排管袢
9、中央部相切，计数目镜测微尺内1mm长度中的毛细血管袢数，在不同视野内测三次，取平均值。【实验器材】1.显微镜：目前国内设计、制造的甲襞微循环显微镜大多是在体视显微镜的基础上配上适当光源组成。也可用普通生物显微镜代替。甲襞微循环观察都是在低倍率下进行，至少应备有8x物镜、10x物镜和5x目镜各一个，最好采用平场消色差匀镜头，以减少因手表面球面差所致的成像模糊，如备有PK摄影镜则更好。2.光源：作为微循环检查用的光源要求能看清楚微血管、微血流和单个红细胞因此光源应具备3个条件：A强光L：由于观察视野的光线是以450角投照之折射光，要使视野清楚，光源强度至少应在5V、40W以上。但光线过强对观察者眼
10、睛刺激太大，且使血管与底色之间反差减弱，也不适宜。B聚光：光源发出之光线应经透镜聚光，在观察甲襞处聚成一点，经调节后射在甲襞局部的光斑直径约0.5cm。C冷光：由于强光大多有热量发散，既会影响观察结果，又可能灼烧观察局部皮肤，因此常在聚光透镜前加上蓝绿色隔热玻璃片或滤色膜。光源经此隔热滤光后，不仅使红细胞血流颜色加深，观察清晰，而且在光源的焦点上放一温度计，20分钟后最大温升不超过30C。此外，高压汞灯也能达到类似要求。如装有落射光源（内光源）的显微镜，则操作更为方便。3.目镜测微尺：这是安放在显微镜目镜内的一种测微标尺。固定式测微尺为一块圆形有机玻璃片，直径约15mm（图1-1-12）。在它
11、的上面刻有直线标尺,分成510个大格又分成10小格，共计为50100不格。目镜测微尺在使用前必须经过标准的物镜测微器的校正，以求也每一小格刻度的实际长度。使用时将目镜测微尺安放在目镜的光阑上，再插入显微镜的目镜抽管中，即可进行测量。将每1个格的长度乘以所测量物（如毛细血管的长度、宽度）的格数，即为景物的实际长度。目镜测微尺经校正后，该显微镜的目镜、物镜均应固定，如使用不同的显微镜或不同的目镜、物镜进行观测，则目镜测微尺需重新校正。4.手指固定架：甲襞微血管活体观测时，必须固定手指，消除颤动，常常使用石膏、有机玻璃或金属制的手指固定架，以方便观察或摄影。对于手指固定架，一般在求既能固定手指，又不
12、能压迫观察局部的手指血管，手的姿势还应自然、舒适。5.香柏油：甲襞微血管位于手指甲襞皮肤之下，观察光源是以450角折射，因此观察局部必须涂上观察油其意在于：能透明皮肤；帮助光线折射。甲襞处涂油后，使皮肤光滑，当光线折射到此表面时，可消除皮肤凹凸不平而引起的光线漫反射，而增加其透明度。所有的观察油最好能在达到无色、透明、有一定折光能力，其折射率应尽可能与皮肤相近，以免在观察油与皮肤之间形成界面。一般用香柏油、液状石蜡等均可。若配备有微循环显微镜的摄影装置、显微电视接收装置，或计算机显示、测量系统，则检测更为精确，甲襞微循环观察可在普通室内进行，室温最好控制在15250C之间。【实验过程】1实验准
13、备2实验操作（1）中医诊断：按照传统中医辨证证的方法进行观察，并将结果记录相关表格之中。（2）检测表记录：（3）分析报告3实验报告（1）清点、整理并归还各种实验器材。（2）分析记录表，完成检测记录和实验报告，按时交任课老师。【注意事项】1. 室温适宜，室内光线要暗，受检部位和探头加盖黑布，以防杂散光射入。2. 受检者体位要舒适、自然，休息30min后进行。 检测记录资料编号： 检测方法：实验仪器：检测内容：舌乳头横经：舌乳头内微血管丛数和丛中管袢数：舌乳头内微血管丛形态：微血管袢周围状况：血流颜色：微血管袢淤血和扩张的舌乳头在总舌乳头数中的变化：血流速度：血流液态：检测结果：记录人： 检测日期
14、： 年 月 日 实验报告资料编号： 实验时间：实验地点：实验目的：实验方法：实验步骤：实验结果：结果分析：讨论：记录人： 检测日期： 年 月 日舌脱落细胞检测实验【目的要求】1. 掌握不同中医证候舌脱落细胞的变化及其临床意义。2. 熟悉舌脱落细胞的检测方法和操作。3. 了解舌脱落细胞在中医现代研究中的进展情况。【检测对象】正常人、湿热证、脾虚证、气虚证【检测内容】（一）正常脱落细胞1上皮细胞（1）复层鳞状上皮细胞1） 基底层细胞A内底层细胞：亦称生发层细胞，位于上皮的最深部，紧邻基膜，为单层立方形或柱状细胞，有旺盛的繁殖能力，复层鳞状上皮细胞均由上产生。在脱落细胞中，此层细胞呈圆形，直径约13
15、-15m。细胞核圆或椭圆，居中或略偏位，核染质均匀细致，呈现紫蓝色微细颗粒状（此为巴氏染色，下文未说明者均同）。细胞浆厚，量少，染色呈深蓝或灰蓝色。核浆比（其示意如图1-2-2）均匀1：0.5-1。此层细胞难于脱落，在舌脱落细胞片中较少出现。B外底层细胞：亦称深棘层细胞，位于内底层细胞之上，由2-3层细胞组成。在脱落细胞中呈圆形、卵圆形或不规则圆形，比内底层细胞大，直径约15m。细胞核圆或椭圆，居中位或轻度偏位，核染色质细而疏松。胞浆量增多，染色或淡绿色。核浆比为1：12。此层细胞在正常舌苔片中也不易见到，但在黏膜萎缩、糜料、溃疡等表面细胞脱落时可见。2）中层细胞：又称浅棘层细胞，紧接于外底层
16、之上，由外底层细胞发育而来。在脱落细胞中呈不夫则圆形、菱形或多边形，直径约3040m，细胞核相对较小，中心位。胞浆量多，半透明，染成淡蓝色或淡绿色，常卷曲，边缘皱折。核浆比为1：23。3）表层细胞：又称角质层细胞，位于上皮层的最表面。在脱落细胞中此类细胞体积较大，4060m，一般呈多角形，也有为圆形或卵圆核浆比为1：35。根据细胞的角化程度，表为过渡期细胞。这类细胞的外形、核浆比与不全角化细胞近似，但胞核稍大，圆或椭圆，核染色质疏松，核周亦常有透明的白晕圈，显示了不完全角化细胞逐渐退化的过程；胞浆色淡而纤细，有嗜酸性（粉红色）及嗜碱性（湖蓝色）两种特性。在计数时，胞浆粉红色者归属于不全角化细胞
17、，而湖蓝色者归属于角化前细胞。C完全角化细胞：又称超角化细胞。细胞极薄而有皱折状，胞浆呈可黄色或橘黄色，胞核已完全消失。（2）柱状上皮细胞因口腔及舌黏膜脱落细胞中少见，故此外从略。2非上皮细胞（1）白细胞白细胞较为常见，其大小较恒定，有时可用于做粗测其他细胸的大小。经巴氏染色，白细胞呈淡蓝色绿色，胞核染色成深蓝黑色。1）中性粒细胞：呈不规则圆形，制片干燥后直径1015m。经瑞氏染色呈粉红色，有许多细小均匀可见的紫红色性颗粒。细胞内有25个小分叶状核，小核间有核丝相连，染成深紫红色。当制片中出较多的中性粒细胞时，提示局部有感染或其他炎症，数量的多少常与感染或炎性反庆的程度一致。2）嗜酸粒细胞：圆
18、形，直径约1215m。胞核常分两叶，呈“眼镜”形。核染色质粗，呈紫红色。胞浆充满粗大、均匀、整齐的橘红色嗜酸性颗粒。此类细胞在涂片中较少见，但在痰液制片中有时可大量出现，提示与症、过敏反庆等因素有关。3）嗜碱粒细胞：圆形，直径约10m。胞核常被颗粒遮盖，清楚时可见24叶，染色质粗糙。胞浆常呈现淡紫红色，含少量粗大不匀、排列不规则的紫黑色颗粒。此种细胞一般在舌苔涂片中极为少见。4）淋巴细胞：小圆形，直径610m。细胞内有较大的胞核，几乎充满细胞，核的一侧凹陷，核染色质成深紫色。胞浆仅在核的一侧出现一线灰色或天蓝色，甚至不见胞浆。淋巴细胞出现常见于慢性炎症。5）单核细胞：呈不规则圆形椭圆形，直径1
19、525m。胞核大而不规则，呈肾形成蹄形，多扭曲折叠，染色质细疏如网状，染成淡紫红色。胸浆较多，染淡蓝。6）浆细胞：卵圆形，直径为10m左右。外形边缘可呈火焰状，胞核多偏位，染色质颗粒粗大，呈“车轮状”排列，核周的胞浆染色较淡，形成“核周晕”。胞浆丰富，染蓝色，内多空泡。它常见于慢性炎症患者细胞学标本之中。（2）红细胞正常红细胞为两面微凹的圆盘形，平均直径7.2m，厚约2m，无核，侧面呈哑铃形。经瑞氏染色后呈粉红色，中央较淡；而巴氏染色呈鲜红色。标本片中出现红细胞提示有局部出血。（二）变性上皮细胞1上皮细胞的退化变性（1） 肿胀性退化细胞因变性，水分增多，肿胀而增大，达到正常细胞的23倍，胞头出
20、现空泡，或呈泡沫状，珠网状；胞核被挤向细胞的边缘，呈“戒指形”细胞；甚至胞浆完全崩解，留下裸核。细胞核也可肿胀增大，达正常的23倍，核染色质颗粒变粗而淡染，模糊不清，甚至核膜溶解、消失、常见于复层扁平皮的底层细胞或血细胞。（2）固缩性退化细胞因失水而体积缩小，胞浆浓缩。胞浆染色由蓝变红或不同程度的红黄色。核体积缩小，染色质凝集致密，着色很深，称固缩核。最后染色质崩解成碎片，受色变浅或消失。此变化常见于鳞状上皮细胞。2上皮细胞的炎症变性3核异质核异质指脱落细胞的核形态不正常，包括核的大小、形态异常，数目增多，染色增多或分布不均，核膜增厚，核边不整齐等。严重者常显示核已具有恶性特征，但胞浆的质与量
21、尚比较正常。核异质细胞是介于良性与恶性之间的一种过渡阶段细胞，约70%病例可恢复正常，30%可发展为癌细胞。核异质细胞的改变重点是细胞核在明显增大的基础上伴有一定程度的畸性和深染；而炎症变性细胞的核虽增大，但不伴有畸形和深染，或呈深染但反核固缩变小（图1-2-4）。4异常角化鳞状上皮细胞浆的分化程度，超过了细胞的分化程度而过度成熟，称异常角化。在巴氏染色中表现为上皮细胞核尚幼稚，而胞浆已变成红色或橘黄色。此现象若出现于中层或底层细胞，称早熟角化；若出现于表层角化前细胞则称假角化。有人认为，这是癌前表现，应予重视。（三）肿瘤细胞恶性肿瘤细胞的形态变化是多方面的，没有一个单独的特征能作为肿瘤的诊断
22、依据。但是，由于肿瘤细胞具有异常过度的繁殖力，故核的染色质改变是诊断肿瘤的主要依据，而胞浆变化则可鉴别肿瘤的类型。【检测指标和方法】1印片背景方法：标本片均按：“头、体、尾”从左至右的方向置于显微镜载物台上，用载物台推片器上的标尺控制观测视野。观测视野的顺序如图1-2-8a所示。用低落镜（1010）观察，每片观察10个视野，应用血球分类计数器求出每类背景数目及其百分比。2细胞分布检测方法同上项，故一般与“印片背景”指标同时测取。正常参考值：健康成人（淡红舌，薄白苔者）90%以分布均匀。3脱落上皮细胞总数及分类掌握舌苔各类脱落细胞的形态特征。1）方法：每例标本片观察10个中央视野，顺序如图1-2
23、-8a。用高倍镜（4010）检测，每片均用血球分类计数器计数10个视野的各种细胞数以及总数，再求出各类细胞所占百分比。2）正常参考值：参看下表。 脱落上皮细胞的形态特征（巴氏染色） 胞核细胞直径（m）外形胞浆大小位置形状颜色核浆比内底层细胞1315圆形厚、蓝绿色大正中圆紫蓝均匀的细颗粒10：51外底层细胞1530圆形，卵圆形较厚，深蓝或淡蓝绿色大正中或稍偏位圆，卵圆染色比内底层要深1：23中层细胞3040不规则圆形菱形多角形较薄，浅绿色中等正中或稍偏位圆，卵圆染色较深的颗粒状1：35表层角化前细胞40钝角多边形薄，湖蓝色小正中圆虽深可见颗粒结构1：510表层角化细胞40钝角多边形薄、粉红色最小
24、正中圆固缩深染1：510表层完全角化细胞40钝角多边形薄、橙黄色无核4变性上皮细胞总数及分类方法：同上项。在10个视野内计数变性细胞的总数、分类计数及其百分比。5白细胞总数及分类计数瑞氏染色常见白细胞的形态特点如表所示。常见的成熟白细胸形态（瑞氏染色）细胞直径（m）核形染色质胞浆核浆比中性料细胞1015分叶粗颗粒最多，细不，均匀，染紫红色小嗜酸粒细胞1315分叶粗颗粒粗大，整齐，染橘红色，充满胞浆小嗜碱粒细胞1012分叶粗颗粒量少，大小不均，排列不齐，染紫黑色，常盖于核上小淋巴细胞65圆形、肾形粗紧成块透明蓝色，无或偶见少数粗大不均匀紫红色嗜天青颗粒大中单核细胞1525肾形、马蹄形疏松网状半透
25、明灰蓝色，有细小红色嗜在青颗粒，弥散胞浆之中正常参考值：正常的舌苔标本片中白细胞极少，其中白细胞15个/高倍视野者不超过15%，主要为形态较完整的中性粒细胞。观测后将结果分别填记在专用表格中，对典型的视野，可进行显微摄影记录。【实验器材】1.制片器材1）载玻片：厚1mm，要求表面光滑，无灰尘、油渍、划痕及破损。在操作过程中，宜用手指夹着玻片的两侧边缘，而不要让手指与玻片表面接接触，以免污染玻片，影响制片质量。2）推玻片：亦称推片，要求边缘光滑，无缺损。在制作完一例舌苔标本片，应更换一片。在无推玻片时也可用载玻代替。3）盖玻片：为了长期保存而加盖于载玻片标本上的极薄玻片，要求清洁、光滑、透明。4
26、）牙签或木质刮舌板：刮取舌苔时用，要求无菌，亦可用消毒的载玻片代用。5）记号笔：为在载玻片上编号、划痕使用，以红色为最好。2.固定器材1）染色架：安插待固定的标本片。2）固定液：常用的固定液有两种，任选一种。A乙醇-乙醚混合固定液配方：95%乙醇和乙醚等量混合。性质：乙醇能使标本中蛋白沉淀变性，而乙醚溶解脂肪，使细胞易于着色。处理：待标本自然干燥之后置入乙醇-乙醚固定液中1530分钟即可。B卡诺固下液（Carneys fluid）配方：由无水乙醇6份，冰醋酸1份和氯仿3份混合而成。性质：这种固定液穿透力强而快。其中无水乙醇固定细胞质，冰醋酸固定染色质，并防止由于乙醇所引起的高度收缩与硬化。处理
27、：标本自然干燥后，置入卡诺液中固定1224小时。【实验过程】1实验准备2实验操作（1）中医诊断：按照传统中医辨证证的方法进行观察，并将结果记录相关表格之中。（2）检测表记录：（3）分析报告3实验报告（1）清点、整理并归还各种实验器材。（2）分析记录表，完成检测记录和实验报告，按时交任课老师。【注意事项】正常人舌苔脱落细胞的常值国内报道不尽一致，究其原因，多因检测条件控制不一所致。常见的影响因素有：1）受检者的年龄（282岁、青年学生、献血者）、性别、体质差异及样本例数不一。2）对正常人、正常舌象、正常舌苔的标准掌握不一致。3）我国地域广阔，因气温、生活习惯的影响，致舌黏膜上皮细胞发育不一致。4
28、）由于舌苔细胞的采样时间（清晨、空腹、餐后）、制片方法（印片、涂片、推片）、固定液体（乙醇-乙醚、卡诺液）、染色规程（巴氏、HE、瑞氏、丹氏、PSA、Feulgon）、显微镜放大倍率（视野周边半径）、观察视野数目等不同。5）对各类舌苔脱落细胞的识别、分类、命各，尤其是对过渡细胞的归属不统一。6）统计分析方法不同（H检验、2检验、Ridit检验、百分位数值等）。因此，在国范围内制定严格的检测规程，在大量普查基础上，建立统一的观察指标的正常值，是使舌苔细胞学研究深入开展、推广应用的一项十分重要的工作。 检测记录资料编号： 检测方法：实验仪器：检测内容：细胞 直径 外形 胞浆 胞核 核浆比内底层细胞：外底层细胞：中层细胞：表层角化前细胞：表层角化细胞：表层完全角化细胞：检测结果：记录人： 检测日期： 年 月 日 实验报告资料编号： 实验时间：实验地点：实验目的：实验方法：实验步骤：实验结果：结果分析：讨论：记录人： 检测日期： 年 月 日
