1、发酵工程要点复习资料发酵工程要点复习资料.txt世上最珍贵的不是永远得不到或已经得到的，而是你已经得到并且随时都有可能失去的东西！爱情是灯，友情是影子。灯灭时，你会发现周围都是影子。朋友，是在最后可以给你力量的人。发酵微生物培养和代谢过程发酵工程利用微生物特性和发酵理论，通过现代化的工程技术手段，进行工业化规模生产，使受培养的微生物细胞积累所需产品的一门技术学科。特点以生命科学为基础结合先进的工程技术手段和其他自然科学原理按照预先的设计改造生物体利用微生物动物或植物体对原料进行加工生产出人类所需产品或达到某种目的的技术传统发酵概念最初发酵是用来描述酵母菌作用于果汁或麦芽汁产生气泡的现象，或者是
2、指酒的生产过程。生物化学上发酵指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量的一种方式。或者更严格地说，发酵是以有机物作为电子受体的氧化还原产能反应。工业上所称的发酵泛指利用微生物细胞制造某些产品或净化环境的过程，它包括厌氧培养的生产过程，如酒精、丙酮、丁醇、乳酸等，以及通气（有氧）培养的生产过程微生物产物是以获得具有多种用途的微生物菌体细胞为目的的产品的发酵工业微生物的生物转化是利用生物细胞对一些化合物某一特定部位（基团）的作用，使它转变成结构相类似但具有更在经济价值的化合物。发酵工业是指利用生物的生命活动产生的酶，无机或有机原料进行酶加工，获得产品的工业。生产菌种的来源根据资料直接向有科研
3、单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买从大自然中分离筛选新的微生物菌种。一般菌种分离纯化和筛选的步骤标本采集-标本材料的预处理-富集培养-菌种初筛-菌种复筛-性能鉴定-菌种保藏采样的注意事项1）保持相对无菌；2）样本的代表性；3）采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、地点以及采集地点的地理、生态参数等；4）应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为真正的原地菌群的出现可能是短暂的；5）采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存于4下，但贮存时间不宜过长。样品菌液稀释计数直接计数法比浊测定光密度法间接测量法(DNA RNA 粘度 产物 消耗等)稀释分离法 平板涂布分离法 组织分离法施加选择
4、性压力分离法主要是利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营养的要求不同，如温度、pH、渗透压、氧气、碳源、氮源等，人为控制这些条件，使之利于某些或某种微生物生长，而不利于其他种类微生物的生存，以达到使目的菌种占优势，而得以快速分离纯化的目的。子实体是指在气生菌丝中可产无性或有性孢子，有一定形态和构造的任何菌丝体组织菌株鉴定形态学(光镜 暗视野 扫描电镜 透射电镜 荧光)生理生化实验(糖酵解试验 淀粉水解试验)遗传学鉴定(PCR测序)微生物菌种选育目的(防止菌种退化 解决生产实际问题 提高生产能力 提高产品质量 开发新产品)优良菌株要求1）有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操作性
5、要强。2）在发酵过程中不产生或少产生与目标产品性质相近的副产品及其它产物。3）生长繁殖能力强，有较强的生长速率，产生孢子的菌种应该具有较强的产孢子能力。4）产品成本低。能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物5）有利用广泛来源原料的能力，并对发酵原料成分的波动敏感性较小。6）对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将这些前体物质作为一般碳源利用。7）不易感染它种微生物或噬菌体。8）生产特性要符合工艺要求。如发酵过程中产生的泡沫要少，这对提高装料系数、提高单罐产量、降低成本有重要意义。9）遗传性能相对稳定。10）生产菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）。方法基因突变
6、： 自然选育(spontaneous mutation)是指不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育(strain breeding)的过程。生产菌种斜面-制备单孢子悬浮液-分离出单菌落（鉴定 移种）-斜面种子（初筛）-高产菌株-沙土管菌株-斜面种子-摇瓶复筛-高产纯化株-生产试验或进一步选育保藏简单易行 效率低进展慢诱变育种(Mutagenesis breeding)是利用各种被称为诱变剂的物理因素和化学试剂处理微生物细胞，提高基因突变频率，再经过适当的筛选方法获得所需要的高产优质菌种的育种方法。确定出发菌株 菌种的纯化选优 出发菌株的性能鉴定同步培养 制备单细胞（或单孢子）悬液 活菌
7、浓度测定诱变剂的选择与确定诱变剂量的预试验 诱变处理（中间培养） 平板分离 计形态变异的菌落数，计算突变率挑取疑似突变菌落纯培养 突变体的初步筛选 用简单快捷的方法重复筛选 摇瓶发酵试验选出突变体（根据情况进行生产试验或重复诱变处理）速度快、收效大出发菌株（original strain）指用于诱变育种的起始菌株。要求1）出发菌株要有一定的目标产物生产能力；2）营养要求低，产孢子多且早；3）生长繁殖快，有良好的代谢特性；4）对诱变剂敏感，变异幅度大；5）选用多个出发菌株进行诱变收效较快。表型延迟（phenotypic lag）：表型的改变落后于基因型改变的现象分离性延迟： 突变的基因经DNA复
8、制和细胞分裂后变成纯合状态，表型才能表现出来。生理性延迟： 由杂合状态变为纯合状态，突变表型仍不能表现出来。光复活作用（photoreactivation）可见光可大大降低经紫外线照射后微生物死亡率的现象。营养缺陷型（auxotroph）诱变产生的缺乏合成某些营养物质的能力，须在基本培养基中加入相应的营养成分或其前体物（precursor）才能正常生长的变异菌株。基因重组(gene recombination)： 将两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式杂交杂交育种的优点：a) 由于杂交育种选用了已知性状的供体菌和受体菌作为亲本，因此，不论在方
9、向性还是自觉性方面，均比诱变育种前进了一大步。b) 利用杂交育种往往还可以消除某一菌株在经过长期诱变处理后所出现的产量上升缓慢的现象，因此，它是一种重要的育种手段。方法细菌接合F因子转导R因子转移转化和转导原生质体融合(protoplast fusion)通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。融合子（fusant）1）受接合型或致育性的限制小，两亲株没有供体和受体 之分，有利于不同种属微生物的杂交。2）重组频率高于其他杂交方法。3）遗传物质的传递更加充分、完善，既有核配又有质配。4）可以采用温度、药物、紫外线等处理纯化亲株的一方
10、或双方，然后使其融合，筛选再生重组子菌落，提高 筛选效率。5）用微生物的原生质体进行诱变，可明显提高诱变频率。遗传标记的筛选(营养缺陷型遗传标记 抗药性标记 荧光染色标记 失活原生质体供体法)原生质体的制备融合与再生融合子的鉴定融合子是在选择性培养基上检出的，即通过两个遗传标记互补确定的。如利用营养缺陷型互补等基因工程将外源DNA通过体外重组后，导入受体细胞，使其在受体细胞中复制、转录、翻译表达的技术称为基因工程或DNA体外重组技术。表达载体必须具备的条件1）能够独立复制；2）应具有灵活的多克隆位点和方便的筛选标记；3）应具有很强的启动子，能被大肠杆菌的RNA聚合酶识别；4）应具有使启动子受到
11、抑制的阻遏子，只有在受到诱导时才能进行转录；5）应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆外源基因，而不转录其他无关基因；6）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号，即起始密码AUG和SD序列。基因工程菌的稳定性分裂不稳定 是指基因工程菌分裂时，出现一定比例不含质粒的子代菌。结构不稳定 是指外源基因从质粒上丢失、碱基重排或缺失，引起基因工程菌性能的改变。影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素外源基因的拷贝数；外源基因的表达效率；表达产物的稳定性；细胞的代谢负荷。真核细胞中具生理作用的基因在大肠杆菌中有三种表达方式，即融合蛋白、非融合蛋白和分泌性表达蛋白融合蛋白 是指蛋白质的N端是一段原
12、核DNA编码的序列，C端接上真核基因编码的序列。优点：基因操作简便，表达蛋白在细菌体内比较稳定，易实现高效表达。缺点：因融合蛋白中含有一段原核多肽序列，会影响真核蛋白的免疫原性（immunogenicity ）。非融合蛋白 是在大肠杆菌中以真核蛋白mRNA的AUG密码子为起始表达的蛋白质。可以很好的保持蛋白质原有的生物 活性，其最大的缺点是容易被蛋白酶降解。分泌型表达蛋白 是通过将外源基因连接到编码原核蛋白信号肽的下游实现的。常用的信号肽有碱性磷酸酶(phoA)信号肽、膜外周质蛋白(OmpA)信号肽、霍乱弧菌毒素B亚单位(CTXB)等。基因的定向进化在实验室中模仿自然进化的关键步骤：突变、重组
13、和筛选，在较短时间内完成漫长的自然进化过程，有效改造目的物，使之适于人类的需要。基因的直接进化(directed evolution)在分子水平上，对目标基因直接处理，然后通过高通量的筛选方法，提高目标蛋白的性能。定点突变 (site-specific mutagenesis 或site-directed mutagenesis) 在目的DNA片段（例如：一个基因）的制定位点上引入特定的碱基对变化的技术易错PCR一种相对简单、快速廉价的随机突变方法通过改变PCR反应条件使扩增的基因出现少量碱基错配，从而导致目的基因的随机突变，关键是控制DNA的突变频率Mg2+和Mn2+提高；dNTP比例改变D
14、NA Shuffling等基本原理：先将来源不同但功能相同的一组同源基因，用DNA核酸酶I进行消化产生随机小片段，由这些小片段组成一个文库，使之互为引物和模板，进行PCR扩增，当一个基因拷贝片段作为另一基因拷贝引物时，引起模板转换，重组因而发生，导入体内后，选择正突变体作为新一轮的体外重组。一般通过23个循环，得到产物大幅度提高的重组突变体。DNA shuffling分子水平的体外定向进化技术Genome shuffling细胞水平的体内定向进化技术优良生产菌种应具备的基本特性1）有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操作性要强。2）在发酵过程中不产生或少产生与目标产品性质相近的副
15、产品及其它产物。3）生长繁殖能力强，有较强的生长速率，产生孢子的菌种应该具有较强的产孢子能力。4）产品成本低。能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物5）有利用广泛来源原料的能力，并对发酵原料成分的波动敏感性较小。6）对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将这些前体物质作为一般碳源利用。7）不易感染它种微生物或噬菌体。8）生产特性要符合工艺要求。如发酵过程中产生的泡沫要少，这对提高装料系数、提高单罐产量、降低成本有重要意义。9）遗传性能相对稳定。10）生产菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）。影响微生物菌种稳定性的因素：变异；污染；死亡菌种的衰退(degenra
16、tion) 变异有正变（自发突变）和负变两种，负变即菌株生产性状的劣化或有些遗传标记的丢失均称为菌种的退化。 衰退的表现1）原有形态形状变得不典型；2）生长速度变慢；3）代谢产物生产能力下降；4）对外界不良环境的抵抗力下降。 菌种退化现象：菌落颜色的改变，畸形细胞的出现等；菌株生长变得缓慢，产孢子越来越少直至产孢子能力丧失；菌种的代谢活动，代谢产物的生产能力或其对寄主的寄生能力明显下降。 衰退的原因1）根本原因在于基因自发突变；2）传代次数的影响，使负突变株的比例逐渐占了优势；3）与培养条件有关。防止衰退的措施1. 减少传代次数；2. 创造良好的培养条件；3. 利用不易衰退的细胞传代4. 采用
17、有效的菌种保藏方法；常用措施合理的育种，处理细胞用单核的，避免使用多核细胞；增加突变位点，减少分离回复；诱变处理后分离纯化，以保证保藏菌种纯碎。选用合适的培养基 营养相对贫乏的培养基做菌种保藏培养基创造良好的培养条件 以防止菌种退化，如低温、干燥、缺氧等。控制传代次数 降低自发突发的机率。确立恰当的移种传代的时间间隔。复壮（rejuvenation）1. 从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获得具有原有典型性状的菌种(狭义复壮，消极措施)。a）纯种分离;b）通过寄主体进行复壮；2. 有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种维护工作中不断筛选“正变”个体(广义复壮，积极措施)
18、。纯种的分离方法菌落纯化(平板划线分离法 平板涂布分离法 平板倾注分离法)细胞纯化(用“分离小室”进行单细胞分离 显微操纵器进行单细胞分离 菌丝尖端切割法进行单细胞分离)菌种保藏的原理微生物菌种保藏，原理基本一致，即采用低温、干燥、缺氧、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂等方法，挑选优良纯种，最好是它们的休眠体，使微生物生长在代谢不活泼，生长受抑制的环境中。 理想的菌种保藏方法注意事项(1)经长期保藏后菌种存活健在；(2)保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力。(3)菌种保藏的方法经济。基本要求：在一定时间内使菌种不死、不变、不乱基本方法：生活态(
19、培养基传代培养，寄主传代培养)休眠态(冷冻，干燥)保藏方法（1）斜面冰箱保藏法（2）半固体冰箱保藏法（3）石蜡油封藏法（4）甘油悬液保藏法（5）沙土管保藏法（6）冷冻干燥保藏法（7）液氮保藏法 斜面保藏法将菌种定期在新鲜琼脂培养基上传代，然后在一定的生长温度下生长和保存的传代保藏方法。可用于实验室中若干菌种的保藏。此法最为简单和经济，且不要求任何特殊的设备。但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变。穿刺保藏法斜面保藏法的改进常用于好气性细菌的保藏，真菌、放线菌等12cm高的穿刺培养物上覆盖2 3mm的液体石蜡矿物油保藏法在斜面培养或穿刺培养上加一层液体石蜡，防止失水干燥隔绝空气，降低菌种细
20、胞代谢速率。沙土管干燥保藏法适用于丝状真菌、放线菌或芽孢细菌的保藏一般沙过80目，土过100目，按12：1混合，高度约1cm。也可用硅胶、磁珠或多孔玻璃珠代替。接种后真空抽干封口。保存期1年左右。真空冷冻干燥保藏法 冷冻干燥的基本方法：是通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，使培养物干燥。此法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一。冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护剂，目前国内常用脱脂乳和蔗糖，国外尚有运用动物血清等的。需氧或不需要(好氧发酵，兼性发酵，厌氧发酵)培养基呈液态或固态液态发酵投资少，设备易，操作简，因地制宜，原料要求低；厂房面积大，劳动强度大，不易机械化固态发酵(Solid
21、 State Fermentation)便于控制，易机械化，易精制，设备小，容量大，可自动控制，适合大规模生产；投资大，动力消耗大，设备要求高发酵在培养基表面或深层进行表面发酵多厂房，大劳动力，低压鼓风机，动力消耗少，控制简单，少污染深层发酵密闭发酵罐，小劳动力，高压空气，动力消耗大，控制精密，污染严重间歇发酵或连续进行分批发酵指在一个密闭系统内投入有限数量的营养物质后，接入少量的微生物菌种进行培养，使微生物在特定的条件下只完成一个生长繁殖周期的培养方法补料分批发酵在分批培养的某些阶段适当补加培养基，使菌体或其代谢产物的生产时间延长。消除培养过程中底物的抑制消除产物的反馈抑制可以达到高密度细胞
22、培养 延长次级代谢产物的生产时间 稀释有毒代谢产物 连续发酵按一定的速度向培养系统内添加新鲜的培养基，同时培养液以相同的速度流出，从而使发酵罐内培养物的液量维持恒定，使微生物细胞能在相对恒定的状态下生长恒浊培养利用浊度检测细胞的浓度。恒化培养恒定输入养料中的某一基质高密度发酵 (High Cell Density Fermentation )微生物代谢产物的合成完全是靠菌体作为生产者来实现的。菌体量越多产物的产量也越大。因此，通过发酵工程实现高密度微生物细胞培养则是发酵的最终要求。透析培养在培养过程中，随着细胞的生长，在培养液中会积累起各种代谢产物，这些物质常常会抑制细胞的生长 。此时，采用透
23、析膜把一些代谢产物排出反应器之外对于消除产物的抑制效应十分有效，但膜易被堵塞。菌种状态(游离发酵，固定化发酵)单一或混合菌种(单一纯种发酵，双菌发酵，混合发酵)生物反应器利用酶或生物体（如微生物）所具有的生物功能，在体外进行生化反应的装置系统。分酶反应器和细胞生物反应器能维持一定的温度、pH、反应物(如营养物质、溶解氧等)浓度应具备良好的传质、传热和混合性能，以便为生物反应的顺利进行提供适宜的环境条件。有一定的除菌及密封设备，以防止生产过程中因微生物侵入造成的杂菌污染。 发酵罐的特点轴封严密，泄漏少能承受一定压力、温度搅拌通风装置保证气液充分混合具有足够的冷却面积死角少，灭菌彻底适宜的径高比（
24、高与直径的比值为2.54）发酵罐设计的原则(稳定性 控制性 操作性 安全性 可视性)1、发酵器应能在无菌条件下工作数天，且应在长时间运转过程中保持稳定； 2、通气和充分搅拌，以满足微生物代谢的需要，但不应损伤菌体； 3、尽可能低的功率消耗； 4、发酵罐上应配备有温度和pH值控制系统以及采样装置 5、发酵罐内的蒸发损失不应太多； 6、在放料、清洗和维修等操作过程中具有最低的劳动力消耗； 7、发酵罐应有较好的适应性，以满足不同生产厂家的需求； 8、发酵罐内表面应光滑。9、用于中试规模的发酵罐与用于实际生产的发酵罐应具有相同的几何形状，有利于放大生产； 10、使用既能满足工艺要求又比较便宜的制造材料
25、，同时应配备完善的供给设施。主要由壳体、控温部分、搅拌部分、通气部分、进出料口、测量系统和附属系统等组成。 壳体的作用：为整个发酵过程提供一个密封的环境，要求罐体承受的压力至少在0.3MPa以上。 控温部分的作用：是保证发酵过程在恒温条件下进行，并将生物氧化和机械搅拌产生的热量及时移去 。 搅拌部分的作用：使罐内物料混合良好，便于菌体吸收营养。另一方面，搅拌器可以打碎气泡，增加气液接触面积，提高气液间的传质速率，加强氧的传递效果及消除泡沫。 通气部分的作用：是从罐的底部向罐内通入无菌空气，一般入口空气压力为0.10.2MPa(表压)，罐顶部有空气出口。 进出料口：是指进料和出料用的系统，同时还
26、配有补料口装置等。 测量系统：测量发酵过程中的pH值、溶解氧等相关数据。此外，测量装置应能承受一定的灭菌温度并在长时间内保持稳定。 附属系统是指用以观察发酵液情况的视镜装置和强化发酵液混合的挡板等设备。 灭菌技术培养基灭菌；发酵罐灭菌；对所有与发酵过程有关的物料进行灭菌；发酵时保持纯种状态。 培养基灭菌原因生产菌与杂菌在培养基中同时生长，使生产菌丧失生产能力；在连续发酵过程中，杂菌有时会比生产菌生长快，使生物反应器中杂菌占优势；杂菌过度生长会污染最终产品。 杂菌代谢所产生的物质，使目的产物的分离困难；杂菌使目的产物降解。发酵过程中，若发生噬菌体污染，生产菌细胞会发生溶菌现象，使发酵产物的最终产
27、量或活力大幅度下降。 实罐灭菌 将培养基置于发酵罐中用蒸汽加热，达到预定灭菌温度后，维持一定时间，再冷却到发酵温度，然后接种发酵，这叫做实罐灭菌，又称分批灭菌或间歇式灭菌。 操作要点： 三路进汽：将蒸汽从进气口、排料口、取样口直接通入罐中，使罐温上升到118120，罐压维持在0.090.1Mpa（表压），并保持30min左右。 连续灭菌 配制好的培养基在向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、保温和冷却而进行的灭菌方式。配料预热罐： 连消塔：促使培养液的温度快速升高到灭菌温度(126132)； 维持罐：冷却管：优点灭菌的温度较高，灭菌时间较短培养基的营养成分受破坏的程度较低提高了发酵罐的利用率缺
28、点灭菌过程所需的设备较多操作较为麻烦杂菌污染的机会也相应增多培养基过滤除菌法 用微孔薄膜过滤，使大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌目的。过滤除菌大多用于遇热容易变性而失效的试剂或培养液。化学杀菌表面消毒剂表面消毒剂是指对一切活细胞都有毒性，不能用作活细胞内的化学治疗用的化学药剂。 化学治疗剂空气除菌 密闭的深层通气发酵需严格的纯净培养，进入发酵罐前空气必须进行压缩、冷却、脱水、脱油和过滤除菌等处理。发酵对无菌空气的要求是 ：无菌，无灰尘，无杂质，无水，无油，正压等几项指标空气除菌的方法 1 辐射杀菌杀菌效率较低，杀菌时间较长。一般要结合甲醛蒸汽等来保证无菌室的无菌程度。2 热杀菌基于
29、加热后微生物体内的蛋白（酶）热变性而得以实现。利用压缩空气时产生的热量进行灭菌空气。3 静电除菌利用静电引力来吸附带电粒子而达到除尘灭菌目的。对于一些直径小的微粒，所带电荷小，不能被吸附而沉降。4 过滤除菌 是利用过滤介质阻截空气中所含的微生物而获得无菌空气的除菌方法。目前，该方法是广泛应用。空气预处理的目的：一是提高压缩前空气的洁净度；二是去除压缩后空气中所带的油和水空气过滤除菌介质）棉花：纤维细长，空气阻力较大。）玻璃纤维：直径越小越好，但小易断，缺点：更换时碎末飞扬，过敏）活性炭 ：大表面，物理吸附，空气阻力小）超细玻璃纤维纸:以拦截为主，有较高过滤效率。缺点为强度差，受温后纤维松散。）
30、石棉滤板：过滤效率低，耐蒸气反复杀菌。 ）新型过滤介质 ：微孔滤膜微孔滤膜：孔径小于0.50m，甚至小于0.1m，因而能将空气中的细菌绝对过滤掉。这类过滤介质主要用于滤除空气中的细菌和尘埃，所以滤后空气的质量较易控制。 提高过滤除菌效率的主要措施减少进口空气的含菌数 设计和安装合理的空气过滤器，选用除菌效率较高的过滤介质 采用合理的空气预处理设备，以达到较好的除油、水和杂质的目的。 空气进入过滤器之前应进行干燥处理，以保证过滤介质正常工作。 种子的概念：将保存在沙土管或冷冻干燥管中处于休眠状态的母发酵剂接入试管斜面活化后，再经过摇瓶及种子罐逐级扩大培养，最后获得一定数量和质量的纯种培养物，即发酵工业上通称的“种子”。 生长旺盛，活力较高，延迟期短，接种到发酵罐后能迅速生长；细胞浓度适宜，以保证在大型发酵罐中有适当的接种量；生理状态稳定；无杂菌污染；生产能力保持稳定Q搅拌P8604186.8（焦耳/小时）发酵过程中产生泡沫的原因：外界引进的气流被机械地分散形成泡沫；发酵过程中产生的气体聚结形成的
