1、高压输液泵输送流动相，流速快，分析速度快；高灵敏度检测器，灵敏度大大提高。紫外检测器 最小检测限可达109g，而荧光检测器最小检测限可 达1011g。,与气相色谱法相比,气相色谱只适合分析较易挥发、且化学性质稳定 的有机化合物，而HPLC则适合于分析那些用气相色谱 难以分析的物质，如挥发性差、极性强、具有生物活 性、热稳定性差的物质。所以，HPLC的应用范围已经 远远超过气相色谱。不受试样的挥发性和热稳定性的限制，应 用范围广；可选用各种溶剂作为流动相，对分离的选 择性有很大作用，选择性高；一般在室温条件下进行分离，不需要高柱温。,特点（四高一广）高压：液体流动相受到的阻力大，施加高压以便迅速
2、通过分离柱 高效：GC 柱效约2000块/m,HPLC 柱效约30000块/m以上,高灵敏度：采用高灵敏度检测器以提高分析灵敏度，UV 10-9g，荧 光检测器 10-11g。高速：分析时间短应用范围广：能适应于高沸点和热不稳定有机及生化试样的高效 分离分析方法。缺陷：柱子价格昂贵，耗费大量溶剂，HPLC较GC的价格和损耗 都高。HPLC无论是在理论上、技术上、还是应用上仍处于发展阶 段。,分类：通常将液相色谱法按分离机理分成吸附色谱法、分 配色谱法、离子色谱法和凝胶色谱法四大类。其实，有些液 相色谱方法并不能简单地归于这四类。,第二节,高效液相色谱法的基本理论,-液相色谱的板高方程,fund
3、amental of chromatograph theory热力学理论：,塔板理论平衡理论基 础 动力学理论：速率理论Van Deemter方程,高效液相色谱法的基本概念和理论基础与气相色谱法一致，但又有其不同之处，其主要区别-归结于流动相不同液体和气体的性质差异：扩散系数Dm：液体的扩散系数只有气体的1/万至1/10万 密度：为气体的1000倍黏度：比气体大100倍,一、液相色谱的板高方程,1.涡流扩散项He,He单位柱长的距离偏差dp载体颗粒直径填充不规则因子由于填充柱中固定相颗粒-装填不均匀，粒径的差异 而造成的流动相所形成的紊乱的“涡流”-多径项当柱子制备完成后，其He值就是常数,2
4、.纵向分子扩散项 Hd当样品分子在色谱柱内被流动相带向前时，由分子本身 运动所引起的纵向扩散-导致色谱峰的扩展。,Dm样品分子在流动相中的扩散系数 流动相的线速Cd常数,3.传质阻力项由流动相传质阻力项和固定相传质阻力项组成。3.1 流动相的传质阻力项：A，流动的流动相中的传质阻力项Hm-由于靠近固定相颗粒的流动相流动的稍慢-造成柱内对流塔动板相高的度流变速化不的均影匀响：,Dm样品分子在流动相中的扩散系数 流动相的线速dp 固定相粒度Cm 常数，与柱子的直径、形状、填料结构有关,B，滞留的流动相中的传质阻力项Hsm,-由于固定相的多孔性，会造成流动相在局部滞留-滞留在固定相微孔内的流动相一般
5、停 滞不动-形成滞留区。流动相中试样分子-扩散到滞留区-与固定相进行质量交换。如固定相微孔深而小-传质速率变慢-这种影响在整个传质过程中起主要作用,Dm样品分子在流动相中的扩散系数 流动相的线速dp 固定相粒度Cm 常数，与颗粒微孔中被流动相占据分数和容量因子有关,3.2 固定相的传质阻力项：指从两相界面到固定相内部的质量交换，在液-液分配色谱 中，这一传质过程取决于固定液的液膜厚度 df 和样品分子 在固定液中的扩散系数 Ds,综上所述，由于柱内色谱峰扩展所引起的塔板高度的变化：,4.液相色谱的板高方程,在高效液相色谱中,液体的扩散系数仅为气体的 十万分之一，则速率方程中的分子扩散项B/u较
6、小，可以忽略不计，因此，影响柱效的主要因素是传质项。液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状如图所示。,二、影响分离的因素,1、流 速液相色谱中，最佳 流速很小（0.1-0.3mm/s）,耗时长，一般1mm/s。HPLC降低 流速，柱效提高不是 很大。但在实际操作中，调节流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。,2、涡流扩散项及其影响,降低固定相粒度粒径小的、分布均匀的球形固定相可提高 柱效。3、传质阻力项及其影响,改变淋洗液组成、极性是改善分离,的最直接的因素。,高效液相色谱仪HPLC流程及主要部件generalprocess and main asse mbly of HPLC,第三节
7、高效液相色谱仪,instrument of HPLC,液相色谱仪器high performance liquid chromatograph,液相色谱仪（2）,液相色谱仪（3）,液相色谱仪（4）,流程及主要部件,rocess and main assembly of HPLC流程,检测器,高压输液泵,高压输液泵,输液系统 进样系统 分离系统 检测系统数据处理系统,一、高压输液系统,柱前系统储液瓶（装有流动相）溶剂储存器的要求：足够的溶剂，以备重复分析时保证供液脱气方便耐一定压力材质对所用溶剂是惰性一般为玻璃、不锈钢、聚四氟乙烯等常用脱气方法：低压脱气法吹氦脱气法超声波脱气法,2.过滤器,不锈钢
8、外壳+过滤器芯子过滤器芯子由不锈钢制成的具有一定孔隙度的圆柱体，由不锈钢粉 末烧结而成，粉末粒度决定孔隙度。多孔聚四氟乙烯目的：保护泵的柱塞和进样阀的阀芯,主要部件之一，压力：30MPa以上。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液体的流动相高速通过时，将产生 很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱 的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性,3.高压输液泵,高压输液泵,气动放大泵高压、无脉动、泵成本低往复泵应用最多可以连续以恒定的流量输送 液体螺旋柱塞泵其工作原理与注射器类 似，也称其为注射泵,4、缓冲器,阻尼器-安装于溶剂系统减少流量波动长、细的不锈钢毛细管
9、,通过两个输液泵流速的变化，改变流动相的洗脱能 力，其作用与气相色谱的程序升温类似。,A,B,A,B,C,C,5.梯度淋洗装置,5.梯度淋洗装置 高压（内）梯度:,利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送 入梯度混合室，混合后进入色谱柱。低压（外）梯度:一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种 不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中 混合。,二、进样装置流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：,三、色谱柱系统,色谱柱的结构微粒高效固定相长度：100-300mm内径：4.6mm，5，4，2mm的已常用。LC-MS常采用0.5mm以下的毛细管柱；制备柱
10、通常为6mm内径以上。,三、色谱柱系统,色谱柱的填充干法和湿法装填干法：大于20 m湿法：-10 m也称为匀浆装柱法-即填料粒子配制成悬浮液，超声高 度分散，然后加入加压介质（甲醇或己烷）匀浆的制备方法：平衡密度法、黏度法、非平衡密度法。装柱-加压介质尽可能与流动相接近，以便省略溶剂转换 和柱性能调整,三、色谱柱系统,色谱住的评价烷基键合相柱的评价：苯基键合相色谱柱的评价：氰基键合相色谱柱的评价：氨基键合相色谱柱的评价：,具体方法和操作条件详见page142,四、液相色谱检测器,检测器是HPLC最重要的部分，其作用：将柱中流出物中样品组成和含量 的变化转化为可供检测的信号，完成定性和定量的任务
11、。HPLC检测器的基本要求：灵敏度高线性范围广 稳定性好 通用性好噪音低，漂移小 不破坏样品价格便宜 响应迅速,1.紫外检测器（ultraviolet photometer uv）：应用最广，对大部分有机化合物有响应。原理：Beer Law,特点：灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很小（1mm10mm，容积 8L）；波长一般固定在：254nm和280nm.对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。,2.光电二极管阵列检测器（photo-diode array detector）紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定 波长，计算机快
12、速处理，三维立体谱图，如图所示。,光电二极管阵列检测器,3.示差折光检测器（differential refractive index detector）,通用型检测器，基于连续测定流出物光折光率的变化测定样品 浓度；依据：每种物质具有不同的折光指数可连续检测参比池（流动相）和样品池（含有样品的流动 相溶液）中流动相之间的折光 指数差值。差值与浓度呈正比；灵敏度低、对温度敏感、不能 用于梯度洗脱偏转式、反射式和干涉型三种；,4.荧光检测器（fluorescence detector）,高灵敏度、高选择性；对多环芳烃，维生素B、黄曲 霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。,
13、具有共轭结构的化合物能吸收一定波长 的紫外光（激发光），电子跃迁到高能 级激发态，辐射出波长更长的光发射 光,5.电导检测器electrical conductivity detector,ECD,测定目标：选择性检测阴离子或阳离子,在离子光谱中应用 广泛。工作原理：流动相中的离子引起电导率的改变，电桥产生 的不平衡信号，经方法、整流后输入记录仪。条件：测定过程中需要恒温，原因：电导率随温度变化。,6.蒸发光散射检测器 evaporation light-scatter detector ELSD,工作原理雾状液滴流动相蒸发，溶质形成微小颗粒光被散射程度由颗粒的量决定优点：消除溶剂的干扰；温度
14、变化引起的基线漂移,一、液-固吸附色谱,liquid-solid adsorption chromatogra,ph,二、液-液分配色谱liquid-liquid partition chromatograp,h,三、离子交换色谱ion-exchange chromatograph四、离子色谱ion chromatograph五、离子对色谱ion-pair chromatograph六、排阻色谱size-exclusion chromatograph七、亲和色谱（AC）Affinity chromatograph,第四节高效液相色谱分离方式,1.固定相,一、液谱分离系统,薄壳型（40m）,全多孔型（5 m）,固定相,孔径和耐压性一般硅胶
