1、根据基片上交联固定的识别分子种类不同，又可分为蛋白质芯片、肽芯片、抗体芯片、组织芯片、细胞芯片、基因芯片（cDNA芯片、寡核苷酸芯片、基因组芯片）等。所有上述芯片统称为生物芯片。根据芯片的功能又可分为测序和基因图绘制芯片、基因表达谱分析芯片、克隆选择和文库筛选芯片、物种鉴定和基因组分型芯片、突变检测和多态性分析芯片、药物芯片、噬菌体文库筛选芯片等。微缩实验室芯片（Lab on a chip）能将样品分离、纯化、提取、混合、反应、检测等功能集合于一体，将代表微流路生物分析技术发展的最高水平。根据芯片的用途，还可分为分析芯片、检测芯片和诊断芯片。基因芯片（又称DNA芯片）系指将大量探针分子固定于支
2、持物上后，与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。因为其信息量特别大（高通量），可以同时对上万个基因进行分析。但是，芯片的信息质量的稳定性和可重复性比较差。正因为这个弱点，芯片的临床应用受到了很大的限制。美国Luminex 公司开发出的多功能悬浮点阵仪（Multi-Analyte Suspension Array, MASA）技术平台是既能保证信息质量，又能提供相对高通量的新一代分子诊断技术平台。该技术的核心是把微小的乳胶颗粒分别染成上百种不同的荧光色素（芯片是用探针在芯片上的位置给基因的特异性编码；而MASA则是用颜色来编码）。应用时，将
3、针对不同检测物的乳胶颗粒混合后再加入微量病人标本，在悬液中与微粒进行特异性地结合。结合的结果可以在瞬间经激光判定后由电脑以数据信息的形式记录下来。因为分子杂交是在悬浮溶液中进行，检测速度极快，所以又有液态芯片之称。（二）基因芯片技术的主要应用1科学研究 主要包括基因表达谱分析、基因突变分析、基因组多态性分析、基因文库作图和噬菌体文库分析以及杂交测序、微生物菌种鉴定等。2临床诊断 在婴儿出生前，可用生物芯片进行产前筛查和诊断，防止患有先天性疾病的婴儿出生。婴儿出生后，可采用基因芯片技术来分析其基因图谱，可预测其患心脏病或糖尿病等疾病的潜在可能性，以便采取预防措施。在DNA、RNA、蛋白质及其相互
4、作用层次（第三阶段医学）上，了解疾病的发生、发展过程，以便采取预防及治疗措施。如检测P53基因功能失常的芯片、结核杆菌检测基因芯片，美国的Luminex 公司发展的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms, SNP）分析技术，只需15个PCR循环，一次实验便能检测出HIV、HCV、HSV。3药物筛选 生物芯片对于药物靶标的发现、多靶位同步高通量药物筛选、药物作用的分子机理、药物活性及毒性评价。（三）目前存在的问题基因芯片技术已经取得了长足的发展，但仍然存在着许多难以解决的问题，例如技术成本昂贵、复杂、检测重复性差等问题。这些问题主要表现在样品的制备、探针合
5、成与固定、分子的标记、数据的读取与分析等几个方面。二、差异显示技术认识生物体内部基因有序地、时相性地表达差异是揭示遗传信息复杂性的一个极为重要的步骤。基因表达的差异表现为二个方面：一是基因表达种类的不同；二是基因表达水平的改变。检测这些基因表达差异的技术即为差异显示技术,是在转录水平上研究基因表达差异的有效方法。它通过一系列的锚定引物与随机引物组合将不同种细胞，如正常和转化细胞的mRNA进行分组反转录，用PCR方法扩增cDNA，用序列凝胶电泳法显示出扩增结果，比较正常的和异常的cDNA带，从而找出差异表达的基因。差异显示技术在分析基因表达差异、绘制遗传图谱、分离特异性表达基因、临床遗传疾病的诊
6、断等方面得到广泛的应用。（一）差异显示技术的主要方法与原理1差减杂交（subtractive hybridization,SH） 差减杂交或消减杂交最早由Lamar和Palmer于1984年提出。他们先用超声波打断雌性小鼠的DNA，用Mbo I完全消化雄性小鼠DNA；将两者一起变性、复性（其中被打断的雌性小鼠DNA过量100倍），再将产物克隆入表达载体的BamH I位点中，只有那些两端均有GATC序列，即被Mbo I切割并自身复性的基因（雄鼠特有的基因）才能被克隆入载体，这样就达到了驱逐两者共有序列的目的，并最后得到了雄鼠Y染色体的DNA。该方法的缺点是技术要求高、耗时、工作量大。2抑制性差减
7、杂交（ suppression subtractive hybridization，SSH） SSH是由消减杂交衍生发展而来，是抑制PCR与消减杂交技术相结合的、简单快速分离差异基因的方法。先将样本（tester）mRNA和参照（driver）mRNA分别逆转录成cDNA，分别用同一种识别四碱基序列的限制性内切酶消化形成平均长度500的cDNA平端片段,这样可增加有差别表达基因检出的可能性,以防止长链片段形成的复杂结构对消减杂交的干扰。然后，将tester cDNA分别接上接头1（adapter1）和接头2（adapter2），接头为平端双链DNA片段,且双链5端均无磷酸化基团,保证了adap
8、ter以唯一方向与cDNA片段连接。接头外侧序列与第1次PCR引物序列相同,而内侧序列则与第2次PCR引物序列相同。此外，接头上含有7启动子序列及内切酶识别位点,为以后克隆和测序提供方便。再与过量的经消化的driver样本杂交（二轮消减杂交）后，进行巢式PCR ，使差异表达的目的基因片段得到大量富集。然后利用接头上存在的酶切位点,插入适当载体,转化细菌,初步筛选出具有插入的克隆,再经杂交筛出具有差异表达的克隆,进行测序、同源分析等系列工作,最后完成全长基因的克隆、鉴定。该方法具有简便易行、特异性高、背景低、重复性好、能分离出丰度较低的特异性片段等特点。但所需的mRNA量较大（达数微克），稀有样
9、本检测较困难；并且酶切后的cDNA与adapter的连接效率是实验中的关键，连接效率不高就难以发现有表达差异的基因。3差异显示PCR（differential display reverse-transcriptase PCR,DD RT-PCR） 其主要原理是：利用大多数真核细胞基因mRNA结尾处有多聚腺苷酸poly（A）结构，在其3端设计象5-T11CA样引物，该引物可与mRNA总数的十二分之一（即polyA前面二个碱基为TG的mRNA）结合，从而使这部分基因得到逆转录；而一套（即T11MN，M、N代表4种碱基中的一种，但M不为T，共有12条）引物可使全部mRNA得到扩增。由于PCR能扩增
10、的长度是23kb，而mRNA的平均长度只有1.2kb；故在其5端再设计一些随意碱基顺序的引物（20条10-mer），可以使不同长度的基因得到扩增。如果在PCR扩增时，采用同位素标记的dATP代替dATP，在凝胶电泳后的放射自显影照片上就可发现不同长度的PCR产物。该方法具有简便、灵敏、高效及省时等优点，它能够快速地显示细胞mRNA的组成，可对各样本mRNAs的差异同时进行比较和展示，并且所用的mRNA量少；可以立即对扩增的cDNA进行测序和亚克隆及探针标记、杂交、文库筛选等；其缺点是假阳性条带多、对低丰度的基因表达不易检测、不能定量以及基因的克隆受mRNA表达时效的影响等，且其扩增出来的条带往
11、往是在基因3端比较短的一段序列，这部分序列往往在基因的3UTR区，所提供的信息比较少，为得到cDNA必须进行cDNA文库筛选等工作。4DNA代表性差异分析（DNA representational difference analysis，DNA RDA） 代表性差异分析方法有二种：一种是基因组DNA（gDNA）的代表性差异分析（gDNA RDA）；另一种是cDNA的代表性差异分析（cDNA RDA）。DNA RDA在一定程度上具有差减杂交和DD RTPCR两者的特点。（1）gDNA RDA：在gDNA RDA 中，先用相对不足的6碱基识别酶对gDNA进行消化，再与寡核苷酸接头连接，用PCR扩增
12、20个循环，只有那些1 kb以下的片段被扩增，这些被扩增的片段称为扩增子（amplicon），不同的内切酶可产生不同的扩增子。在检测扩增子（tester amplicon）和驱逐扩增子（driver amplicon）产生之后，再将检测扩增子的5端与新的adaptor连接并与过量的driver amplicon混合一起变性、复性以去除两者的共有部分（称为消减富集）；加入Taq DNA 多聚酶后，只有那些自身复性的5端带有接头的双链DNA 3才能被补平，只有这些自身复性的tester片段才能被随后的PCR扩增，称为动力学富集。重复杂交-扩增步骤可使共有序列最大程度地被去除，剩余的差异表达片段可以
13、被用于克隆和测序。该方法可以用于新基因的发现、肿瘤中基因的异常和遗传分析等。但由于步骤本身的随机性，消减扩增之后的PCR产物并不一定代表有意义的目的基因,且在样本制备中的污染也可能产生假阳性。（2）cDNA RDA：cDNA RDA的基本原理与gDNA RDA类似，均是通过消减富集和动力学富集而实现。用识别4 个碱基的酶代替gDNA RDA中的识别6个碱基的酶对gDNA进行消化，使消化产生的代表性片段的平均长度为256 bp ，以保证每种主要的DNA片段至少有一条代表性片段被扩增。它的主要步骤是将tester的mRNA逆转录为cDNA，用4碱基识别酶消化，与R-Bgl-12/24 adapte
14、r（linker）连接，PCR 扩增，去除R-adapter，接上J-Bgl-12/24 adapter，与driver amplicons杂交，补平后PCR扩增，将tester 的J-adapter 换成N-adapter，再与driver杂交，再扩增，代表性片段克隆、测序。gDNA RDA由于同一细胞或组织在不同生命时期表达差异的比较，用6碱基识别酶消化样本，其样本的结构比较复杂且代表性相对较低，这样部分tester中可扩增的片段不能被driver中不可扩增的同源长片段所去除，从而易产生假阳性。与gDNA RDA相比，cDNA RDA无需降低样本的复杂程度，由于用识别4个碱基的酶消化样本，
15、其代表性也更完全且较大的片段也可以被扩增，因此cDNA RDA中杂交消减的基础是信息的有或无，而不是酶切片段的长短差异。cDNA RDA可对不表达的基因进行检测，而gDNA RDA只能对大范围的缺失检测；cDNA RDA还可以对不同阶段的基因的不同表达进行监测，可用于比较发育阶段、细胞周期的时相、药物处理前后基因表达的变化等。此外，cDNA RDA还能检测到影响某一表型的多个基因及其下游的调节基因。与DD-PCR一样，cDNA RDA可以对一定时间内的基因表达进行检测，且所检测的样品含量可以很低。cDNA RDA也不会产生模棱两可的结果，从而降低了随后分析的难度；cDNA RDA采用全长（24
16、 mer）的引物，从而避免了因引物的错配而产生的问题。此外，由于cDNA RDA中接头是在全长cDNA的消化产物上，因此它只要一套引物就可产生代表性片段，而不象DD-PCR一套引物只能产生十二分之一的代表性片段（DD-PCR需要2025套5端引物和4套3端引物结合才能覆盖全部cDNA）。cDNA RDA亦不依赖于mRNA的分离，因此，它可以用于非poly（A）结尾的mRNA的检测。但cDNA RDA要求样本新鲜，且不能用于点突变、小的缺失或插入、转录末端片段及缺乏合适酶切位点的基因检测；酶消化的结果也可以使cDNA两端的信息量丢失。5RNA指纹技术（RNA arbitrarily primed
17、 PCR,RAP-PCR） RAP-PCR基本步骤是先从样本中提取总RNA，用随机引物合成cDNA的第一条链，再用同样的引物PCR合成cDNA的第二条链，凝胶电泳可以显示全部PCR产物，从中回收差异表达的基因片段，进行克隆、测序。该方法采用随机引物，而不是oligo（dT）逆转录mRNA，可将非poly（A）结尾的mRNA也转录出来，避免了信息的丢失；RAP PCR在一定的反应条件下，重复性好，RNA的浓度、DNA的污染等均对结果无明显影响；组间条带的亮度差异在20以上即可定为基因有差异表达。但该方法需要较高的变性温度和较低的离子强度，且随机引物有可能正好在某一类基因的保守区或分散的基因重复序
18、列区，这样有可能只扩增这一类基因。RAP PCR最适用于分析RNA的多态性和不同发育阶段RNA表达类别的差异。6其它 如将SSH与具有高通量鉴定能力的cDNA chips技术结合，极大地提高了相关基因的分离速度和效率。1999年YangGP等将SSH和cDNA微排列技术结合，高效分析差异表达cDAN克隆。首先将SSH分离的cDNA差异表达克隆经PCR扩增后，用机械臂在玻片上点样，形成cDNA微排列，然后将cDNA微排列与荧光标记的RNA探针进行杂交，RNA探针分别来自乳腺癌雌激素受体阳性细胞（MCF7，T47D）和乳腺癌雌激素受体阴性细胞（MDA-MB-231，HBL-100），有10个克隆在
19、雌激素受体阴性细胞中过度表达，Northern分析验证了这10个cDNA序列。（二） 差异显示技术的应用1细胞因子或各种药物活性研究 应用差异显示技术比较同一种组织或细胞经某种细胞因子或药物处理与未处理时其表达的差异，研究该细胞因子或药物对细胞行为的影响，为神经递质、炎性介质、细胞活性物质及某些药物的性质及其作用机制的研究提供了强有力的手段。2细胞周期、发育、分化、凋亡调节机制研究 应用差异显示技术比较同一细胞或组织在不同生命时期表达差异，是研究细胞周期、发育、分化、凋亡的调节机制的十分简便可行方法。3病理条件下机体调节过程的研究 观察各种环境因素作用对组织或细胞基因表达的差异，如缺血、缺氧、
20、氧化应激、防御反应、病毒或细菌感染、噪音、放射线等，为防治方法研究提供指导和理论依据。4疾病相关基因的研究 其中研究得最多的是肿瘤，利用肿瘤组织或细胞作检测DNA,正常组织或细胞作驱逐DNA，经差异显示技术就可筛选出在肿瘤组织或细胞中高度扩增或差异表达的序列。也可利用不同表型的肿瘤细胞分别作检测DNA和驱逐DNA，筛选出某一种表型中呈高度差异表达的基因,为不同表型肿瘤的鉴别诊断、治疗提供帮助。其次为自身免疫性疾病、糖尿病及心肺等疾病的相关基因研究。三、基因阻遏基因阻遏是指采用特定的方式，抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因而使之不能表达的一项新技术。反义技术、核酶、RNA干扰和反基因技术是
21、常用的基因阻遏技术。（一）反义技术反义技术是利用反义分子进行基因阻遏的一种分子生物学技术。反义分子亦称反义核酸（antisense nucleic acid），是指能够与靶基因的某段序列互补的天然存在或人工合成的核苷酸序列。它通过碱基配对与细胞内核酸特异性结合形成杂交分子，从而在转录和翻译水平调节靶基因表达的小分子核酸，既可以是DNA片段，也可以是RNA片段。反义核酸具有合成方便、序列设计简单、容易修饰、选择性高、亲和力高等特点。根据来源不同，反义核酸可分三类：用重组DNA技术构建表达载体在细胞内转录出反义核酸；人工合成的反义寡核苷酸；利用诱导物诱导细胞内的反义核酸。目前最为广泛应用的是反义寡
22、核苷酸，一般由15-20个碱基组成。由于未经修饰的反义寡核苷酸在细胞内容易被核酶降解，通常要作多种修饰，如将核苷酸的磷酸二酯结构中的氧原子替代为硫，形成一种磷酸盐硫化物。亦可以甲基、乙基替代核苷酸分子中的氧原子，分别形成化学修饰型反义寡核苷酸（S-ODN、M-ODN、E-ODN）。这种化学修饰型反义寡核苷酸被成为第一代反义核酸。第一代反义核酸虽然有效增强了对核酸酶的稳定性，但由于其本身具有的多聚阴离子特性或其代谢物作用，在体内表现为剂量依赖的毒副作用。在此基础上，人们对反义核酸的碱基、核糖及核苷酸骨架进行不同修饰，设计出了第二代反义核酸-混合骨架寡核苷酸（mixed backbone olig
23、onucleicaid，MBO）。与第一代反义核酸相比，MBO在体内的稳定性有所增强，且降低了负电荷和免疫原性。其后，研究者又以2-氨基乙基甘氨酸为基本单元设计出了第三代反义核酸-多肽核酸（peptide nucleic acid，PNA）。PNA不带电荷，有良好的蛋白酶和核酸酶抗性，具有比前两代反义寡核苷酸更好的亲和力和相同的序列特异性。1反义技术的作用原理 反义核酸（反义DNA/RNA）与核酸有高度的选择性和亲和力，可与DNA结合形成三聚体（triplex），与RNA结合可形成DNA-RNA、RNA-RNA杂种分子。从而具备一系列的基因复制、转录、翻译等水平的调节作用。（1）抑制DNA的复
24、制过程：反义核酸（如ODN）可与DNA结合形成三聚体，这种DNA三聚体形式的存在，严重妨碍了DNA双链的半保留复制的机制。DNA双链以Watson-Crik原则结合并盘绕成右手双螺旋结构。这种双链DNA的沟槽结构正是反义核酸（如ODN）与双链DNA形成三聚体形式的结构基础。（2）抑制DNA的转录过程：与DNA转录过程密切相关的调节元件是基因的启动子（promoter）序列。反义核酸可与双链DNA中的启动子序列以Hoogsteen碱基配对的方式进行结合，可阻碍转录因子激活蛋白与启动子序列的结合，因而启动子不能被正常地激活，也就不会有RNA的正常转录。（3）抑制RNA跨膜转运过程：反义ODN以及反
25、义RNA分子与前体形式的mRNA结合成RNA-DNA或RNA-RNA复合物，这类复合物形式难以进行跨膜转运，仅能滞留在细胞核中。因而，在细胞浆中没有足够的RNA模板，从而干扰、甚至阻断该基因的表达活动。（4）抑制前体RNA的剪切过程：RNA的剪切过程需要RNA进行折叠，形成较为复杂的三维立体结构方可进行。反义DNA以及反义RNA分子能够以Hoogsteen碱基配对的方式，与mRNA在前体mRNA剪切位点附近结合，从而妨碍前体mRNA分子立体结构的正确折叠，阻止mRNA的成熟过程，因而阻碍了蛋白质的翻译。（5）抑制mRNA翻译复合体的形成：无论是内部核糖体进入位点（internal riboso
26、mal entry site，IRES）方式还是扫描机制，成熟mRNA的5NTR（能够与rRNA进行特异性结合）都是与翻译复合体形成密切相关的核苷酸结构。当反义核酸可与5NTR结合以后，则可有效地阻断翻译复合体的形成，抑制基因的表达功能。2反义技术的应用 随着技术的不断完善和发展，广泛用于治疗药物和基因功能的研究。（1）反义核酸类药物的研究：反义核酸作为一种基因表达的抑制剂在抗病毒、抗肿瘤（抑制癌基因、肿瘤耐药基因、肿瘤转移相关基因）中具有广泛的应用前景。如治疗巨细胞病毒（CMV）所导致的视网膜炎的反义核酸药物（Vitravene）已获FDA批准上市。（2）基因功能的研究：反义核酸是一类重要的
27、基因表达调控分子，可作为揭示基因功能的有效手段之一。反义核酸可用来抑制基因的表达，它不仅可作用于传统上容易用单克隆抗体、小分子抑制剂抑制的酶和受体蛋白，还可作用于用传统方法难以抑制的接头蛋白（adaptor）、结构蛋白、转录因子等。3反义技术应用的局限性 相对于基因敲除，反义核酸的优势在于抑制靶基因程度可调控。反义核酸在细胞中的浓度可由表达载体的类型，启动子的强弱，或反义寡核苷酸的转染剂量、浓度加以控制，因此可控制对靶基因的抑制程度，且此种抑制是可逆的，对于研究在特殊表型中功能丧失的基因具有应用价值。反义核酸可迅速、选择性地鉴别结构和功能上高度同源的基因。但反义核酸亦有其局限性。（1）反义核酸
28、的靶位是mRNA而非蛋白，因此当用反义核酸抑制某一特定基因时，其效果与编码蛋白的降解速率有关。对于某些具有很长半寿期的蛋白，反义技术就会出现某些操作上的限制并影响其结果。反义核酸也能与蛋白发生非特异性结合。（2）反义技术另一局限性在于反义核酸的剂量依赖性毒副作用和免疫原性。（二）核酶与脱氧核酶核酶（ribozyme）是一类具有催化活性的RNA分子，亦称催化RNA（catalytic RNA）。核酶不仅像反义RNA分子那样，以碱基互补的方式与底物RNA分子相结合，并在特定的核苷酸序列部位，将底物RNA分子切断，从而破坏底物RNA分子结构的完整性。其催化活性和结构的稳定均依赖于金属离子（如Mg2+
29、）的存在，是一类金属依赖性的酶。金属离子的作用是为其提供静电屏障或造成空间结构的改变。随着分子生物学和体外进化技术的发展，一些实验室发现单链DNA同样具有酶活性，能在一定条件下可切割RNA分子特定位点内部的磷酸二酯键。这些具有催化功能的DNA分子称为脱氧核酶（DNAzyme），亦称酶性DNA。1核酶 至今已发现6种类型的天然核酶，分别为第1组内含子、第2组内含子、锤头状核酶、发夹状核酶、斧头状核酶和核糖核酸酶P（RnaseP）。按其作用方式可分为自我剪接型、自我剪切型及剪切型。自我剪接型主要是指线粒体第1组内含子、第2组内含子，而锤头状、发夹状和斧头状核酶均属自我剪切型。目前研究较多的是锤头状核酶和发夹状核酶。（1）核酶的设计核酶是RNA分子，分子中极端保守的序列是酶活性的必需结构，而两端与底物RNA互补的片段，则起着识别和结合底物的作用。这两段序列，又称引导序列（guide sequences）可以根据底物的核酸顺序而随意变动。因此，在基因治疗研究中，可以根据治疗的靶基因序列的特点，设计和合成特定的核酶。核酶的设计原则为：1）核酶的基本组成：核酶由三个部分组成，中间是保守结构（具有酶活性的结构域），两端是引导序列。引导序列随靶序列的碱基组成而变。锤头结构核酶由催化中心和结合部位组成。在设计过程中，催化中心一般由22nt的固定碱基序列组成，结合部位由8-13
