1、细胞是有机体生长与发育的基础细胞是遗传的基本单位，细胞具有遗传的全能性没有细胞就没有完整的生命细胞概念的一些新思考细胞是多层次非线性的复杂结构体系细胞具有高度复杂性和组织性细胞是物质（结构）、能量与信息过程精巧结合的综合体细胞完成各种化学反应；细胞需要和利用能量；细胞参与大量机械活动；细胞对刺激作出反应；细胞是高度有序的，具有自组装能力与自组织体系。细胞能进行自我调控； 繁殖和传留后代；细胞的基本共性所有的细胞表面均有由磷脂双分子层与镶嵌 蛋白质构成的生物膜，即细胞膜。所有的细胞都含有两种核酸：即DNA与RNA 作为遗传信息复制与转录的载体。作为蛋白质合成的机器核糖体，毫无例外地 存在于一切细
2、胞内。所有细胞的增殖都以一分为二的方式进行分裂。病毒的基本知识病毒（virus）核酸分子（DNA或RNA）与蛋白质构成的核酸-蛋白质复合体； 根据病毒的核酸类型可以将其分为两大类： DNA病毒与RNA病毒 病毒的多样性）类病毒（viroid）仅由感染性的RNA构成；朊病毒（prion） 仅由感染性的蛋白质亚基构成；病毒在细胞内增殖（复制）病毒侵入细胞，病毒核酸的侵染病毒核酸的复制、转录与蛋白质的合成病毒的装配、成熟与释放 病毒与细胞在起源与进化中的关系 病毒是非细胞形态的生命体，它的主要生命活动必须要在细胞内实现。病毒与细胞在起源上的关系，目前存在3种主要观点：生物大分子病毒细胞病毒 生物大分
3、子 细胞生物大分子细胞病毒原核细胞基本特点：遗传的信息量小，遗传信息载体仅由一个环状DNA构成； 细胞内没有分化为以膜为基础的具有专门结构与功能的细胞器和细胞核膜。主要代表：支原体（mycoplast）目前发现的最小最简单的细胞；细菌蓝藻又称蓝细菌（Cyanobacteria） 真核细胞真核细胞的基本结构体系细胞的大小及其分析原核细胞与真核细胞的比较以脂质及蛋白质成分为基础的生物膜结构系统；以核酸（DNA或RNA）与蛋白质为主要成分的遗传信息表达系统由特异蛋白分子装配构成的细胞骨架系统。各类细胞直径的比较原核细胞与真核细胞基本特征的比较原核细胞与真核细胞的遗传结构装置和基因表达的比较植物细胞与
4、动物细胞的比较细胞壁 液泡 叶绿体 古细菌古细菌（archaebacteria）与真核细胞曾在进化上有过共同历程主要证据（1）细胞壁的成分与真核细胞一样，而非由含壁酸的肽聚糖构成，因此抑制壁酸合成的链霉素， 抑制肽聚糖前体合成的环丝氨酸，抑制肽聚糖合成的青霉素与万古霉素等对真细菌类有强的抑制生长作用，而对古细菌与真核细胞却无作用。（2）DNA与基因结构：古细菌DNA中有重复序列的存在。此外，多数古核细胞的基因组中存在内含子。（3）有类核小体结构：古细菌具有组蛋白，而且能与DNA构建成类似核小体结构。（4）有类似真核细胞的核糖体：多数古细菌类的核糖体较真细菌有增大趋势，含有60种以上蛋白，介于真
5、核细胞（7084）与真细菌（55）之间。抗生素同样不能抑制古核细胞类的核糖体的蛋白质合成。（5）5S rRNA：根据对5S rRNA的分子进化分析，认为古细菌与真核生物同属一类，而真细菌却与之差距甚远。5S rRNA二级结构的研究也说明很多古细菌与真核生物相似。 除上述各点外，根据DNA聚合酶分析，氨基酰tRNA合成酶的作用，起始氨基酰tRNA 与肽链延长因子等分析，也提供了以上类似依据，说明古细菌与真核生物在进化上的关系较真细菌类更为密切。因此近年来，真核细胞起源于古细菌的观点得到了加强。第三章 细胞生物学研究方法如何学习细胞生物学？ 抽象思维与动态观点 结构与功能统一的观点 同一性（uni
6、ty）和多样性（diversity）的问题 细胞生物学的主要内容： 结构与功能（动态特征）； 细胞的生命活动 ； 实验科学与实验技术细胞真知源于实验室一、光学显微镜技术（light microscopy） 普通复式光学显微镜技术 荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy） 激光共焦扫描显微镜技术（Laser Confocal Microscopy） 相差显微镜（phase-contrast microscope） 微分干涉显微镜 （differential interference contrast microscope, DIC） 录像增差显微镜技术（video-enh
7、ance microscopy）二、 电子显微镜技术 电子显微镜的基本知识电镜与光镜的比较电镜与光镜光路图比较电子显微镜的基本构造 主要电镜制样技术负染色技术冰冻蚀刻技术超薄切片技术电镜三维重构技术 扫描电镜 （Scanning electron microscope，SEM） SPM（Scanning probe microscope）三、 扫描遂道显微镜Scanning Probe Microscope,SPM （80年代发展起来的检测样品微观结构的仪器） 包括：STM、AFM、磁力显微镜、摩擦力显微镜等原理：扫描探针与样品接触或达到很近距离时，即产生彼此间相互作用力，如 量子力学中的隧道
8、效应（隧道电流）、原子间作用力、磁力、摩擦力等， 并在计算机显示出来，从而反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等。装置：扫描的压电陶瓷，逼近装置，电子学反馈控制系统和数据采集、处理、显示系统。特点：（1）可对晶体或非晶体成像，无需复杂计算，且分辨本领高。 （侧分辨率为0.10.2nm，纵分辨率可达0.01nm）； （2）可实时得到样品表面三维图象，可测量厚度信息； （3）可在真空、大气、液体等多种条件下工作；非破坏性测量。 （4）可连续成像，进行动态观察用途：纳米生物学研究领域中的重要工具,在原子水平上揭示样本表面的结构。普通复式光学显微镜技术 光镜样本制作分辨率是指区分开两个质点间的最小距
9、离荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy）原理与应用 直接荧光标记技术 间接免疫荧光标记技术 在光镜水平用于特异蛋白质 等生物大分子的定性定位： 如绿色荧光蛋白（GFP）的应用激光共焦扫描显微镜技术（Laser Scanning Confocal Microscopy）原理应用：排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率（1.41.7）， 可重构样品的三维结构。相差显微镜（phase-contrast microscope）将光程差或相位差转换成振幅差，可用于观察活细胞 微分干涉显微镜（differential-interference microscope）偏振
10、光经合成后，使样品中厚度上的微小区别转化成明暗区别，增加了样品反差且具有立体感。适于研究活细胞中较大的细胞器录像增差显微镜技术（video-enhance microscopy） 计算机辅助的DIC显微镜可在高分辨率下研究活 细胞中的颗粒及细胞器的运动主要电镜制样技术 超薄切片技术 用于电镜观察的样本制备示意图 负染色技术（Negative staining）与金属投影 染色背景，衬托出样品的精细结构 冰冻蚀刻技术（Freeze etching） （技术示意图） 冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒 和膜表面结构。 快速冷冻深度蚀刻技术（quick freeze deep et
11、ching） 电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的 具有重要应用前景的一门新技术。 电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振 分析技术相结合，是当前结构生物学（Structural Biology） 主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段。扫描电镜原理与应用：电子“探针”扫描，激发样品表面放出二次电子，探测器收集二次电子成象。 CO 2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张 力问题一、 离心分离技术于分离细胞器与生物大分子及其复合物差速离心：分离密度不同的细胞组分密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离 二、 细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法利用一
12、些显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合的特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。 Feulgen Staining三、特异蛋白抗原的定位与定性免疫酶标技术免疫胶体金免疫荧光技术： 快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限 （图）蛋白电泳（SDS-PAGE）与免疫印迹反应（Western-Blot）免疫电镜技术：免疫铁蛋白技术技术应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等四、细胞内特异核酸的定位与定性光镜水平的原位杂交技术 （同位素标记或荧光素标记的探针）电镜水平的原位杂交技术 （生物素标记的探针与
13、抗生物素抗体相连的胶体金标记结合） PCR技术 五、放射自显影技术原理及应用：利用同位素的放射自显影，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究；实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。步骤：前体物掺入细胞（标记：持续标记和脉冲标记） 放射自显影六定量细胞化学分析技术 细胞显微分光光度术（Microspectrophotometry）利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质 （如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。 包括： 紫外光显微分光光度测定法 可见光显微分光光度测定法 流式细胞仪（Flow Cytometry）主要应用：用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量； 测
14、定细胞群体中不同时相细胞的数量； 从细胞群体中分离某些特异染色的细胞； 分离DNA含量不同的中期染色体。一、细胞的培养动物细胞培养 类型：原代培养细胞（primary culture cell） 继代培养细胞（sub-culture cell） 细胞株（cell strain） 正常二倍体，接触抑制 细胞系（cell line） 亚二倍体，接触抑制丧失植物细胞 类型： 原生质体培养 （体细胞培养） 单倍体细胞培养（花药培养） 非细胞体系（cell-free system） 二、细胞工程 细胞融合（cell fusion）与细胞杂交（cell hybridization）技术单克隆抗体（mono
15、clone antibody）技术 图细胞拆合与显微操作技术物理法结合显微操作技术（图1、图2）化学法结合离心技术制备核体（karyoplast）和胞质体（cytoplast）。 其它技术 遗传分析（mutant, knock out, knock in） 对细胞生命活动的研究成为当今生命科学发展的瓶颈对细胞生命活动的研究成为当今生命科学发展的瓶颈第四章 细胞质膜与细胞表面第一节 细胞质膜与细胞表面特化结构 细胞质膜（plasma membrane）,又称细胞膜（cell membrane）。 细胞内膜（intracellular membrane）; 生物膜（biomembrane） 细胞质
16、膜的结构模型 膜脂生物膜的基本组成成分 膜蛋白 确定膜蛋白方向的实验程序 光脱色恢复技术 分子生物学技术在膜蛋白研究上的应用生物膜结构特征 细胞质膜的功能 膜骨架与细胞表面的特化结构第二节 细胞连接 细胞连接的功能分类 封闭连接 锚定连接通讯连接 细胞表面的粘连分子 一、胞质膜的结构模型结构模型 E.Gorter和FGrendel（1925）: “蛋白质-脂类-蛋白质”三夹板质膜结构模型 J.D.Robertson（1959年）： 单位膜模型（unit membrane model） S.J.Singer和G.Nicolson（1972）： 生物膜的流动镶嵌模型（fluid mosaic mo
17、del）K.Simons et al（1997）: 脂筏模型（lipid rafts model） Functional rafts in Cell membranes. Nature 387:569-572生物膜结构磷脂双分子层是组成生物膜的基本结构成分,尚未发现膜结构中起组织作用的蛋白；蛋白分子以不同方式镶嵌在脂双层分子中或结合在其表面, 膜蛋白是赋予生物膜功能的主要决定者； 生物膜是磷脂双分子层嵌有蛋白质的二维流体。 “Central dogma ” of membrane biology膜的流动性膜脂的流动性膜脂的流动性主要由脂分子本身的性质决定的,脂肪酸链越短,不饱和程度越高,膜脂的
18、流动性越大。温度对膜脂的运动有明显的影响。在细菌和动物细胞中常通过增加不饱和脂肪酸的含量来调节膜脂的相变温度以维持膜脂的流动性。在动物细胞中，胆固醇对膜的流动性起重要的双向调节作用。膜蛋白的流动 荧光抗体免疫标记实验 成斑现象（patching）或成帽现象（capping） 膜的流动性受多种因素影响；细胞骨架不但影响膜蛋白的运动， 也影响其周围的膜脂的流动。膜蛋白与膜脂分子的相互作用也是 影响膜流动性的重要因素膜的不对称性细胞质膜各部分的名称 膜脂与糖脂的不对称性 糖脂仅存在于质膜的ES面，是完成其生理功能的结构基础膜蛋白与糖蛋白的不对称性 膜蛋白的不对称性是指每种膜蛋白分子在细胞膜上都 具有
19、明确的方向性； 糖蛋白糖残基均分布在质膜的ES面（GO+3HBH4 labeling）； 膜蛋白的不对称性是生物膜完成复杂的在时间与空间上 有序的各种生理功能的保证。二、膜脂生物膜的基本组成成分成分：膜脂主要包括磷脂、糖脂和胆固 醇三种类型。 膜脂的种热运动方式 脂质体（liposome）膜脂成分磷脂：膜脂的基本成分（50以上）分为二类: 甘油磷脂和鞘磷脂 主要特征：具有一个极性头和两个非极性的尾（脂肪酸链）（心磷脂除外）；脂肪酸碳链碳原子为偶数,多数碳链由16,18或20个组成；饱和脂肪酸（如软脂酸）及不饱和脂肪酸（如油酸）；糖脂：糖脂普遍存在于原核和真核细胞的质膜上（5以下）,神经细胞糖脂
20、含量较高；胆固醇：胆固醇存在于真核细胞膜上（30%以下），细菌质膜不含有胆固醇，但某些细菌的膜脂中含有甘油脂等中性脂类。运动方式沿膜平面的侧向运动（基本运动方式）,其扩散系数为10-8cm2/s；脂分子围绕轴心的自旋运动；脂分子尾部的摆动；双层脂分子之间的翻转运动，发生频率还不到脂分子侧向交换频率的1010。但在内质网膜上,新合成的磷脂分子翻转运动发生频率很高。脂质体（liposome） 脂质体是根据磷脂分子可在水相中形成稳定的脂双层膜的趋势而制备的人工膜。脂质体的应用研究膜脂与膜蛋白及其生物学性质；脂质体中裹入DNA可用于基因转移；在临床治疗中,脂质体作为药物或酶等载体三、膜蛋白基本类型内在
21、膜蛋白与膜脂结合的方式外在膜蛋白与膜脂结合的方式去垢剂（detergent）外在（外周）膜蛋白（extrinsic/peripheral membrane proteins ）；水溶性蛋白,靠离子键或其它弱键与膜内表面的蛋白质分子或脂分子极性头部非共价结合，易分离。 内在（整合）膜蛋白 （intrinsic/ integral membrane proteins）。 水不溶性蛋白，形成跨膜螺旋，与膜结合紧密， 需用去垢剂使膜崩解后才可分离。 脂质锚定蛋白（lipid-anchored proteins） 通过磷脂或脂肪酸锚定，共价结合。膜蛋白的跨膜结构域与脂双层分子的疏水核心的相互作用。跨膜结
22、构域两端携带正电荷的氨基酸残基与磷脂分子带负电的极性头形成离子键，或带负电的氨基酸残基通过Ca2+、Mg2+等阳离子与带负电的磷脂极性头相互作用。 某些膜蛋白在细胞质基质一侧的半胱氨酸残基上共价结合脂肪酸分子,插入脂双层之间,进一步加强膜蛋白与脂双层的结合力,还有少数蛋白与糖脂共价结合。去垢剂是一端亲水、另一端疏水的两性小分子,是分离与研究膜蛋白的常用试剂。离子型去垢剂（SDS）和非离子型去垢剂（Triton X-100） SDS: CH3-（CH2）11-OSO3-Na+ CH3 CH3 CH3 C CH2 C （O-CH2-CH2）10- OH四、确定膜蛋白方向的实验程序 胰酶消化法 同位
23、素标记法五、光脱色恢复技术（fluorescence recovery after photobleaching, FRAP） 研究膜蛋白或膜脂流动性的基本实验技术之一。 程序： 根据荧光恢复的速度可推算出膜蛋白或膜脂扩散速度。膜的流动性：生物膜的基本特征之一, 细胞进行生命活动的必要条件。膜的分相现象。七、细胞质膜的功能 为细胞的生命活动提供相对稳定的内环境; 选择性的物质运输,包括代谢底物的输入与代谢 产物的排除,其中伴随着能量的传递; 提供细胞识别位点,并完成细胞内外信息跨膜传递; 为多种酶提供结合位点,使酶促反应高效而有序地进行; 介导细胞与细胞、细胞与基质之间的连接; 质膜参与形成具
24、有不同功能的细胞表面特化结构。八、膜骨架与细胞表面的特化结构 细胞质膜常常与膜下结构（主要是细胞骨架系统）相互联系, 协同作用, 并形成细胞表面的某些特化结构以完成特定的功能。 膜骨架 膜骨架的概念 指细胞质膜下与膜蛋白相连的由纤维蛋白组成的网架结构,它参与维持细胞质膜的形状并协助质膜完成多种生理功能。 红细胞的生物学特性 膜骨架赋予红细胞质膜既有很好的弹性又具有较高强度。 红细胞质膜蛋白及膜骨架红细胞质膜蛋白及膜骨架红细胞质膜蛋白的SDS-PAGE 红细胞膜骨架的结构 一、细胞连接的功能分类锚定连接（anchoring junctions）与中间纤维相关的锚定连接： 桥粒（desmosome
25、） 半桥粒（hemidesm osome）;与肌动蛋白纤维相关的锚定连接： 粘合带（adhesion belt）； 粘合斑（focal adhesion）二、封闭连接紧密连接是封闭连接的主要形式，存在于上皮细胞之间紧密连接的结构 紧密连接的功能 形成渗漏屏障，起重要的封闭作用； 隔离作用，使游离端与基底面质膜上的膜蛋白行使各自不同的膜功能； 支持功能 紧密连接嵴线中的两类蛋白： 封闭蛋白（occludin），跨膜四次的膜蛋白（60KD）； claudin蛋白家族（现已发现15种以上）三、锚定连接锚定连接在组织内分布很广泛,在上皮组织,心肌和子宫颈等组织中含量尤为丰富锚定连接的类型、结构与功能锚
26、定连接的结构组成 与中间纤维相连的锚定连接 桥粒: 铆接相邻细胞，提供细胞内中间纤维的锚定位点，形成整体网络，起支持和抵抗外界压力与张力的作用。 半桥粒: 半桥粒与桥粒形态类似,但功能和化学组成不同。它通过细胞质膜上的膜蛋白整合素将上皮细胞固着在基底膜上, 在半桥粒中，中间纤维不是穿过而是终止于半桥粒的致密斑内。与肌动蛋白纤维相连的锚定连接 粘合带： 细胞通过肌动蛋白纤维和整连蛋白与细胞外基质之间的连接方式。通过锚定连接将相邻细胞的骨架系统或将细胞与基质相连形 成一个坚挺、有序的细胞群体。锚定连接具有两种不同形式: 与中间纤维相连的锚定连接主要包括桥粒和半桥粒； 与肌动蛋白纤维相连的锚定连接主要包括粘合带与粘合斑。构成锚定连接的蛋白可分成两类: 细胞内附着蛋白（attachment proteins）,将特定的细胞骨架成分 （中间纤维或微丝）同连接复合体结合在一起 （desmoplakin） 跨膜连接的糖蛋白,其细胞内的部分与附着
