1、临床标本增菌培养涂片染色需氧培养基血液、骨髓血培养瓶增菌阳性报警后革兰染色，必要时可做瑞氏染色B, C血管内导管尖端BCSF血培养瓶增菌（可选）离心后革兰染色、墨汁染色（选择）抗酸染色（可选）、接种穿刺液离心后革兰染色眼、耳、鼻咽拭子粪便怀疑抗生素相关性腹泻时原始标本涂片镜检,特别注意球杆比、葡萄球菌和梭状芽孢杆菌，念珠菌1、 普通培养：MAC2、 肠道门诊标本：MAC、碱性胨水、4号琼脂3、抗生素相关性腹泻： B痰、气管抽出液、支气管肺泡灌洗液、支气管镜刷子、洗液、革兰染色镜检1、判断是否合格。（WBC25/LP 上皮细胞104/ml，革兰阴性杆菌，菌落计数105/ml，不超过2种菌落。2、
2、无菌操作下膀胱穿刺尿液只要检出细菌即认为是致病菌。脓、分泌物标本数量较多的、2种菌落生长，需进一步鉴定和药敏。常见致病菌有：金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌、变形杆菌、真菌。粪便标本在麦康凯琼脂上生长的无色、透明的小菌落，考虑为沙门或志贺菌需进一步鉴定和药敏。在血平板上生长的大量单一的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、念珠菌需要向临床报告。咽拭子可疑下列细菌有意义1、溶血链球菌；2、金黄色葡萄球菌；3、大量革兰阴性杆菌（四）涂片染色镜检（参考课件，操作及讲解，10min）1、掌握革兰染色、抗酸染色、墨汁染色方法步骤2、不同镜检方法（染色标本，不染色标本的临床应用）3、革兰染色
3、及抗酸染色注意事项（五）细菌鉴定程序及方法（提问及讲解，5min）1、初步分类流程2、细菌鉴定方法（1）双歧索引法：是一种鉴定思路的程序鉴定，容易掌握，对于一些相互区别比较容易，有较特殊特征的细菌，使用双岐索引法比较方便（如分类流程图），如细菌初步分群、科或属的鉴定。但鉴定速度慢，对相互区别较难的细菌，或鉴别单位较多时，不适合使用。（2）查表法：将各种被鉴定的细菌及其对应的生化反应列成矩阵表，进行分析比较，是临床上常用的常规细菌鉴定方法，容易掌握，但准确性差，仅能鉴定出细菌典型的反应模式，仅适应于在生化反应比较简单的种、属间鉴定。 表3志贺菌属种间生化反应鉴别特征（阳性）生化反应痢疾志贺菌福氏
4、志贺菌鲍氏志贺菌宋内志贺菌鸟氨酸脱羧酶0（）2（） 98（）D甘露醇95（）97（）99（）吲哚产生45（V）50（V）25（V）半乳糖苷酶30（V）1（）10（）90（）（3）编码法：将一组生化反应结果转化成生物型数据表示，用该数据检索相配套的编码手册，以鉴定细菌。方法简单，容易掌握，准确性高，不但可鉴定细菌典型生化反应模式，也可鉴定非典型细菌生化反应模式。但其结果受编码分类知识及配套试剂的质量（每个试验同等重要）影响较大，需引起重视。（4）仪器鉴定法：分为全自动及半自动细菌鉴定和药敏分析仪，细菌鉴定原理同细菌编码法，从细菌鉴定到结果打印、报告一次完成，软件更新快，结果准确，但价格昂贵。3、
5、细菌鉴定方法的选择和应用（1）有条件的单位首选仪器法鉴定。（2）暂时没有条件的单位选择编码方法鉴定，但必须选择好的编码及配套系统，做好室内质控，保证每一项生化反应所用试剂的质量。（3）双歧索引法和查表法是细菌鉴定的常规方法，每一位细菌室的工作人员都必须掌握（六）细菌药敏试验（提问及讲解，5min）1、药敏试验的指征 （1）不能从细菌的种属特征推测其对某类抗菌药物的敏感性，即需要做药敏试验。（2） 某些细菌对抗菌药物的敏感性容易改变，可以从最初的敏感变为耐药，应在治疗3-4d后，对来自身体相似部位的感染重新分离细菌做药敏试验。（3） 仅针对明确引起患者感染的病原菌进行药敏试验，标本中污染菌或正常
6、菌群不做药敏试验。（4） 仅对纯培养的细菌做药敏试验。2、 药敏试验中抗菌药物的选择原则（1） 选择试验的药物必须满足两个基本条件：试验药物针对试验菌所引起的感染有确切的临床疗效。试验的药物体外药敏试验结果是可以接受的。（2） 在临床上同一类抗菌药物往往具有相同或相似的抗菌活性，所以可以选择一种药物（预测药物）作为另一种或几种药物的代表进行药敏试验，来预测其它同类药物的敏感性。（3）目前我国多数临床实验室是根据美国CLSI文件M100表1和表1A “临床微生物实验室在细菌常规药敏试验和报告中应考虑的抗微生物药物推荐分组”进行抗菌药物的选择。（4） 目前，越来越多的医院采用自动化仪器进行药敏试验
7、，其抗菌药物的组合是固定的，通常只根据革兰染色结果，设定试验的药物，所以其药物的选择可能与细菌种属不匹配，建议微生物工作人员应在获得细菌鉴定结果以后，对药敏试验结果进行审核和修订，如嗜麦芽窄食单胞菌对碳青霉烯类抗菌药物天然耐药，不需要报告亚胺培兰的药敏结果。3、药敏试验方法（1） 抗菌药物敏感性试验的方法主要有：纸片扩散法、稀释法、浓度梯度法和自动化仪器法等，方法特点及临床应用（见课件）（2） 药敏试验的标准化操作程序包括：培养基制备、菌悬液制备、接种、孵育等。不同的试验菌种和抗菌药物组合药敏试验操作程序有所不同，具体步骤应参照CLSI文件M100、M02和M07执行。（3） 药敏试验中培养基
8、的厚度、pH、离子浓度、添加剂，菌悬液浓度和纯度，孵育条件和时间，药敏纸片的来源和储藏等均影响试验结果的准确性，需严格进行质量控制。在使用稀释法检测MIC时，尤其要重视菌悬液的浓度和纯度，每次药敏试验后应立即取一份菌悬液在非选择琼脂平板上传代培养，以检查接种物的纯度，为保证接种物浓度的准确性，实验室应定期对浊度管、比浊仪进行检查、校准，并定期进行接种菌悬液的菌落计数。4、药敏试验结果判断（1） 按照标准化方法进行药敏试验后，应准确读取抑菌环直径或MIC值。读取结果后应根据CLSI M100中表2A-2L“抑菌圈直径及MIC 解释标准”进行结果判断。注意该表每年都有部分更新和改变，临床微生物室工
9、作人员应不断学习，跟踪和使用最新的标准。（2） 每一种药物的S、I、R判断标准是建立在推荐剂量和临床使用方法基础上的，实验室人员应该与临床医师密切交流，保证药敏试验结果能够被正确使用。三、分析后（一）结果审核（提问及讲解，5min）1、检验报告单审核（1）审核病人一般信息（2）审核报告结果与检验申请目的是否吻合2、药敏试验结果审核（1） 审核试验的药物是否与菌株鉴定结果相一致。如肠杆菌科细菌不需要做糖肽类和大环内酯类抗菌药物的敏感性。（2） 审核药物的敏感性结果是否遵循特定药物的活性规则层次，如三代头孢菌素对肠杆菌科细菌的活性高于一、二代头孢，肠杆菌科细菌如果对一代、二代头孢菌素敏感，一定对三
10、代菌素也敏感。（3） 审核分离菌株的药敏试验结果是否违背细菌的天然耐药和未曾出现过的耐药表型特征。出现出乎意料之外的试验结果时，应进行如下检查予以核实：1） 抄写是否错误；2）试验中是否有污染（重新检查平板上菌株纯度等）；3） MIC 试验时，是否使用了有缺陷的药敏试验板条，琼脂平板或卡条（如损坏、充料不足等）；4） 核实病人以前的结果（如，病人以前分离的相同细菌是否也具有不寻常的抗菌谱）。假如以上检查不能查明原因，必须重新进行药敏试验和细菌鉴定，同时要保留菌株，并送参考实验室确认。（二）检验结果报告（提问及讲解，5min）1、注意检验者和审核者双签名2、多重耐药菌按要求盖“多重耐药菌”章3、
11、阴性培养结果报告是否规范。常见培养阴性结果的报告方式：血培养及增菌培养应报告“培养5天无菌生长”；咽拭子等有正常菌群寄居部位的标本培养至48小时未检出可疑致病菌，则报告“正常菌群生长”；尿液、引流液、脑脊液、穿刺液等无菌部位的标本培养48小时以上未见可疑菌落，则报告“无菌生长”。粪便或肛拭子等肠道标本培养至48小时未见可疑菌落，则根据申请项目报告“未培养出志贺、沙门菌”、或“未培养出霍乱弧菌”4、细菌鉴定报告细菌种名。5、药敏试验结果报告（1） 药敏试验结果以敏感、中介和耐药表示。（2） 出于救治患者的需要，可直接向临床医师报告MC值，但必须提供解释结果的判断标准，以便临床医师能够理解。不应报
12、告无解释标准的抑菌圈直径测量值。（3） 选择性报告：在CLSI文件M100表1和1A中，按照临床选药的优先顺序将试验的抗菌药物分成A、B、C和U组。每个实验室应决定表内哪些药物用于常规报告，哪些用于选择性报告。选择性报告有助于提高药敏试验的临床相关性，有助于减少滥用广谱抗菌药物而选择出的多重耐药菌株。（4） 特殊菌株的药敏试验报告1） 对沙门菌属和志贺菌属细菌，第一、第二代头孢菌素和氨基糖苷类抗生素体外可能有活性，但临床却无效，所以对上述药物不应报告为敏感。2） 肠球菌属对头孢菌素类、氨基糖苷类（除外筛选高水平耐药）、磺胺甲恶唑/甲氧苄啶和克林霉素在体外可能有活性，但在临床上耐药，所以对这些药
13、物不能报告敏感3）产ESBLs菌株应报告对所有青霉素类、头孢菌素及氨曲南耐药。4）耐甲氧西林的葡萄球菌（MRS），应报告对所有青霉素类、-内酰胺/-内酰胺酶抑制剂复合物、头孢类和碳青霉烯类耐药。5）对分离于脑脊液中的细菌，下列抗菌药物不作为选择药物进行常规报告，因为用这些药物治疗某些细菌引起的脑脊液感染可能无效，这些药物包括：仅通过口服途径给药的一代和二代头孢菌素（头孢呋辛钠除外）、克林霉素、大环内酯类、四环素类、氟喹诺酮类。6）尿道分离菌不常规报告的药物：阿齐霉素、氯霉素、克拉霉素、克林霉素、红霉素表4 常见细菌天然耐药和罕见耐药表型细菌名称天然耐药罕见的耐药表型葡萄球菌属氨曲南、替莫西林（
14、羧噻吩甲氧青霉素）、多粘菌素B/粘菌素E、萘啶酸和头孢他啶万古霉素、达托霉素、利奈唑胺、奎奴普丁/达福普丁和替加环素肠球菌属夫西地酸、头孢菌素，低水平氨基糖苷、复方磺胺天然耐药；粪肠球菌对林可酰胺类和链阳菌素天然耐药；鹑鸡/铅黄肠球菌对林可酰胺类、链阳菌素和万古霉素天然耐药利奈唑胺、万古霉素、替考拉宁、达托霉素、替加环素-溶血链球菌对氨曲南、萘啶酸、替莫西林、多粘菌素、低水平氨基糖苷和夫西地酸天然耐药青霉素、头孢菌素类、万古霉素、替考拉宁、利奈唑胺、奎奴普丁/达福普丁、达托霉素、替加环素肺炎链球菌亚胺培南、美罗培南、万古霉素、替考拉宁、利奈唑胺、奎奴普丁/达福普丁、替加环素、利福平肠杆菌科细菌
15、青霉素G、糖肽类、夫西地酸、大环内酯类、林可霉素类、链阳霉素类、利福平、达普霉素、利奈唑胺耐药厄他培南、美罗培南、亚胺培南（变形杆菌属除外）肺炎克雷伯菌对氨苄西林、氨苄西林/克拉维酸及一代头孢天然耐药阴沟肠杆菌、粘质沙雷菌和枸橼酸杆菌非发酵菌青霉素、头孢唑啉、头孢西丁、头孢孟多、头孢呋辛、糖肽类、夫西地酸、大环内酯类、林可霉素类、链阳霉素、利福平、达托霉素和利奈唑胺鲍曼不动杆菌对氨苄西林、氨苄西林/棒酸、头孢噻肟、头孢曲松、厄他培南、磺胺类和磷霉素天然耐药对替加环素和多粘菌素B耐药罕见铜绿假单胞菌对氨苄西林、氨苄西林/棒酸、头孢噻肟、头孢曲松、厄他培南、磺胺类、四环素/替加环素和磷霉素天然耐药
16、多粘菌素B嗜麦芽窄食单胞菌对氨苄西林、阿莫西林/棒酸、替卡西林、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、头孢唑林、头孢噻肟、头孢曲松、厄他培南、亚胺培南、氨基糖苷类和磷霉素均天然耐药（三）危急值报告血培养、脑脊液培养、涂片发现阳性异常结果，应及时按照危急值报告程序报告。四、室内质控（参考课件，提问及讲解，5min）（一）生化试验1、触酶试验质量控制：阳性对照菌株：ATCC25923；阴性菌株：ATCC19615；监测频率：每次新配制时及使用中每个工作日。2、氧化酶试验质量控制：ATCC27853；ATCC25922；（二）染色液1、革兰染色：2、抗酸染液：分枝杆菌；（三）培养基1、外观检查：（完整、琼脂
17、附于平板底部，血平板应不透明、没有溶血情况，平板颜色好、湿润，无干裂、无污染、无浑浊或沉淀、无冻伤、无过热现象，琼脂厚度至少3mm。如发现与上述情况不符的培养基，应不予使用。2、无菌试验：抽检培养基数量：100块以内，随机抽检5；100块以上随即取10块平皿进行无菌试验。35培养24h后观察是否有细菌生长，无细菌生长为合格。3、生长抑制试验表5 常用培养基的质控培养基培养条件质控菌株预期结果血平板空气培养，24hA群链球菌生长，溶血生长，溶血巧克力平板CO2，24h流感嗜血杆菌生长麦康凯平板大肠埃希菌奇异变形杆菌金黄色葡萄球菌生长，粉红色菌落生长，无色菌落不生长沙保培养基空气培养，24h，25
18、白色假丝酵母菌抑制（四）药物敏感性试验药敏试验应严格按最新发布的CLSI所规定的培养基、操作方法、药敏纸片和判定标准进行。为了监控试验过程的质量，必须做好药敏质控。第二节 案例分析案例1患者，女，62岁，因慢性胆囊炎入住我院消化内科，临床行ERCP术后采集胆汁培养，培养为阳性，革兰阳性球菌，镜下称短链状排列，触酶阴性,鉴定及药敏结果如下：问题：该结果是否正确，报告能否发出？分析：目前我国肠球菌对万古霉素耐药比较罕见，但鹑鸡肠球菌和铅黄肠球菌对万古霉素天然耐药，该药敏结果与鉴定结果是吻合的，可以发出报告。案例2患者，女，57岁，糖尿病足创口脓液培养阳性，革兰阳性球菌，触酶阳性，溶血，产黄色素，鉴
19、定及药敏结果如下：鉴定结果为金黄色葡萄球菌（提示低概率ID），药敏结果对包括万古霉素在内的所有抗菌药物均耐药，该结果非常罕见，需进一步核实。方法：取生长孔、Va16孔涂片镜检并接种血平板见革兰阳性球菌及真菌。判定鉴定及药敏结果呈现异常系被酵母菌污染，对标本平板重新分纯后复检，结果如下：案例3 患者，女，40岁，体温39，血培养第二天报警，涂片见革兰阳性和阴性球菌（染色性不确定），该细菌在血平板上生长，菌落较小，淡黄色，鉴定结果为玫瑰库克氏菌（微球菌），药敏结果不显示。该结果是否正确？该患者有菌血症表现，且血培养报警较早，但玫瑰库克菌（微球菌）引起人类感染比较罕见，且该菌的菌落形态和细菌、排列方
20、式均与微球菌不符合。重新涂片染色，请有经验的老师观察，考虑为革兰阴性球杆菌，重新选择革兰阴性板进行鉴定，结果为鲍曼不动杆菌。不动杆菌属是革兰阴性球杆菌，但革兰染色阴阳不定，很容易误认为是革兰阳性球菌，需要特别小心，应多观察几处，并选择细菌相对分散的区域观察。该株细菌因为革兰染色错误，而选择革兰阳性球菌鉴定板上机鉴定，结果报告为玫瑰库克氏菌。案例4 中心静脉导管尖端半定量培养，鉴定及药敏结果如下：该结果是否需要报告？血管内导管尖端培养主要用来判断病人是否是导管相关血流感染（CRBSI）。CRBSI的确诊需要达到以下标准：1）有1次半定量导管培养阳性（每导管节段15 CFU）或定量导管培养阳性（每
21、导管节段1000 CFU），同时外周静脉血也培养阳性并与导管节段为同一微生物；（2）从导管和外周静脉同时抽血做定量血培养，两者菌落计数比（导管血：外周血）5：1；（3）从中心静脉导管和外周静脉同时抽血做定性血培养,中心静脉导管血培养阳性出现时间比外周血培养阳性至少早2 h；（4）外周血和导管出口部位脓液培养均阳性，并为同一株微生物。此临床病例只单一送检了导管尖端培养，未同时送检血培养。所以无法判断该病原菌是否是定植菌还是感染菌，所以在做药敏试验之前需要联系临床医师，根据临床表现来决定是否需要做药敏试验。导管尖端半量培养方法：用镊子将无菌获取的导管头5cm在血平板上来回滚动4次，培养2448h后
22、观察菌菌落数，若每个平板菌落数大于15CFU，可以判断导管尖端存在病原菌定植；若每个平板菌落数小于15CFU，不可能为导管相关性感染，多为皮肤表面污染菌；不需要做药敏试验。案例5以下是痰培养的报告单。报告是否正确？能否发出？药敏试验的基本原则：试验和报告的药物应该是有临床确切疗效的。嗜麦芽窄食单胞菌对氨苄西林、氨苄西林/克拉维酸、替卡西林、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、头孢唑啉、头孢噻肟、头孢曲松、厄他培南、亚胺培南、美罗培南、氨基糖苷类、甲氧苄啶、磷霉素是天然耐药的。因此，做药敏试验时，不需要做这些药物，如果是仪器药敏，审核报告时应将这些药物删除。CLSI文件M100-S20推荐的药物只有：
23、替卡西林/克拉维酸（MIC法）、头孢他啶（MIC法）、米诺环素、左氧氟沙星、复方磺胺、氯霉素（MIC法）。EUCAST专家规则警示：嗜麦芽窄食单胞菌在体外可能对头孢他啶敏感，但在体内应用效果较差。案例6患者，男，17岁，尿频、尿急1天，尿培养及药敏结果如下。此结果是否正确，报告能否发出？此药敏结果与细菌鉴定结果是吻合的，报告可以发出。CLSI建议：尿培养中分离出腐生葡萄球菌，不需要常规做药敏试验。由腐生葡萄球菌引起的泌尿道感染，对常用的抗菌药物（如呋喃妥因、复方磺胺、氟喹诺酮）均有效，可以直接建议临床选择这些抗菌药物治疗。此外，尿道分离菌不常规报告：阿齐霉素、氯霉素、克拉霉素、克林霉素、红霉素
24、的敏感性。案例7患者，女，50岁，痰培养结果如下。表皮葡萄球菌菌是人口腔中的正常菌丛，该结果应该报告“正常菌群生长”，不需要做药敏试验。与其它类型的标本相比，痰标本的培养结果难以判断，应结合痰涂片染色结果综合分析。一般认为合格痰标本，在第2区有下列细菌大量生长需要进行鉴定和药敏：可疑肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、-溶血性链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉氏菌、革兰阴性杆菌、真菌等。而痰中分离出的草绿色链球菌、奈瑟菌、血浆凝固酶阴性葡萄球菌和白色假丝酵母菌一般认为是正常菌群，不需要进行细菌鉴定和药敏。案例8患者，男，23岁，头痛、发热2天入院。脑脊液细菌培养及药敏结果如下：此结果是否正确？报告能否发出
25、？如何向临床医师建议治疗方案？ 1、此株细菌从脑脊液中分离，青霉素的判断标准应采用脑膜炎青霉素的标准（MIC=0.06g/ml为敏感），该株肺炎链球菌MIC=0.5g/ml，应判断为耐药，同样阿莫西林也应该判断为耐药。2、对于脑脊液中的细菌，不应报道以下抗生素：口服抗生素只针对一、二代头孢菌素（头孢呋辛肠外用药除外）以及头霉素、克林霉素、大环内酯类、四环素类及喹诺酮类，所以这张报告单应删除红霉素、左氧氟沙星、莫西沙星、氧氟沙星、四环素。3、建议治疗方案：头孢曲松 2g IV q12h地塞米松或美罗培南2g IV q8h地塞米松。案例9患者，男性，25岁，从事兽医工作，因波浪热，关节痛就诊，在门诊抽取血培养。第三天，仪器报警阳性，涂片见有大量真菌菌丝。分别接种血平板和沙保培养基，培养24h，无菌生长，72h，血平板上有细小菌落生长，涂片染色为革兰阴性小杆菌，该菌尿素酶（），沙保培养基培养7天无菌生长。直接涂片与培养不一致结果如何解释？根据培养结果结合患者病史，初步诊断为布氏菌感染。但血增菌培养直接涂片却见有真菌，且有菌丝，
