1、 设计、合成Foxp3 siRNA序列，并体外干扰肝癌患者调节性T细胞（Regulatory T cells, Treg），评价Foxp3 siRNA干扰后对Treg表型及抑制功能的影响以及是否能上调肝癌患者抗肿瘤免疫应答的能力。方法： 设计并化学合成Foxp3 siRNA，将Foxp3 siRNA通过脂质体转染的方式体外转染Treg。通过实时定量PCR以及流式细胞术分析Foxp3 siRNA对Treg 中Foxp3表达的抑制效能，并通过流式细胞术评价Foxp3 siRNA干扰后对 Treg表面分子CD127，CTLA-4、 GITR的表达以及对CD4+CD25- T细胞的抑制作用。通过酶联免
2、疫斑点法（Elispot）以及五聚体（pentamer）分析法评价Foxp3 siRNA干扰肝癌患者Treg后对经肿瘤特异性抗原NY-ESO-1b诱导的肿瘤特异性免疫应答的影响。结果：通过Foxp3 siRNA的转染可实现对Treg Foxp3表达的部分沉默，并且上调Treg表面CD127分子的表达，下调CTLA-4和GITR的表达。肝癌患者Treg Foxp3表达的沉默可下调Foxp3+ Treg对CD4+CD25- T效应性细胞增殖抑制的能力；经Foxp3特异的siRNA干扰后肝癌患者Treg抑制肿瘤抗原特异性的CTL的能力显著减弱，Foxp3 siRNA以及siRNA-control转染
3、组NY-ESO-1157-165特异性的CTL的数量分别为（0.21%17% VS. 0.57%0.39%，P0.05），与siRNA-control进行干扰的肝癌患者组相比Foxp3 siRNA干扰后的Treg与特异性CTL共培养后，肿瘤特异性CTL数量及分泌的IFN-r的数量显著上调（13255 VS. 2711，P0.05）。结论：通过Foxp3 siRNA对于肝癌患者Treg中Foxp3表达的沉默，在体外实现了对靶细胞Treg表型及功能的干扰，从而在一定的程度上增强了肝癌患者肿瘤特异性抗原所诱导的抗肿瘤免疫应答的能力。关键词：原发性肝细胞癌；调节性T细胞；Foxp3；小干扰RNAThe
4、 specific suppression in regulatory T cells by Foxp3 siRNA contributed to enhance the anti-tumor immune response in hepatocellular carcinoma patients in vitroHeng-Hui Zhang, Ran Fei , Xing-Wang Xie, Li Wang, Hao Luo, Xue-Yan Wang, Lai Wei, Hong-Song Chen Hepatology Institute, Peking University, Peop
5、les Hospital, No.11 Xizhimen South Street, Beijing 100044, China.Correspondence to：Hong-Song Chen, Professor, Hepatology Institute, Peking University, Peoples Hospital, No.11 Xizhimen South Street, Beijing 100044, China. chenhongsongReceived: Accepted:AbstractObjective: To design the suitable sequen
6、ce siRNA of Foxp3 to interfering the function of Treg and evaluate whether the suppression of Treg could enhance the anti-tumor immune response in hepatocellular carcinoma patients or not. Methods: Foxp3-specific siRNAs by chemical synthesis was delivered into regulatory T cells. The inhibition effi
7、ciencies of Foxp3-specific siRNAs were evaluated by real-time PCR and fluorescently stained for intracellular Foxp3 and analyzed using multiparameter FCM. The Foxp3+ Treg subpopulation was selectively analyzed for surface expression levels of CD127, CTLA-4 and GITR. The suppression of Treg to CD4+CD
8、25- T cells or anti-tumor specific CD8+ T-cell responses induced by tumor specific antigen （NY-ESO-1b） was evaluated by CFSE and Elispot and Pentamer analysis. Results: A subpopulation of Tregs with reduced levels of Foxp3 mRNA and protein mediated by siRNA was CD127 up-regulation and CTLA-4 or GITR
9、 down-regulation compared with those in Foxp3high Tregs. Knockdown of intracellular Foxp3 in Treg reduced suppression of Foxp3+ Treg to proliferative capacity of CD4+CD25- T cells and expansion of anti-tumor specific CD8+ T-cell responses in hepatocellular carcinoma patients. Conclusions: Knockdown
10、of intracellular Foxp3 in Treg mediated by siRNAs can inhibit the suppression of Foxp3+ Treg and enhance the anti-tumor immune response in hepatocellular carcinoma patients in vitro.Key Words:Hepatocellular Carcinoma; T-Lymphocytes; Regulatory; Foxp3; Small Interfering RNA原发性肝细胞癌（Hepatocellular Carc
11、inoma, HCC），是一种恶性程度高、治愈率低、预后差的恶性肿瘤，既往传统的治疗方法（如化疗、放疗、手术等）不仅存在着毒副反应严重且难以解决肿瘤转移和复发的问题。肿瘤免疫治疗具有最大限度地杀伤肿瘤细胞的同时而不伤及正常细胞的优点，为肿瘤的治疗提供了新的策略，但是目前困扰肿瘤免疫治疗实施的关键是其对免疫应答诱发的低效率。而课题组的前期研究证实，Treg是抑制HCC患者肿瘤特异性免疫应答的一个主要因素1，去除Treg或抑制HCC患者Treg功能可有效的上调抗肿瘤免疫应答2。但目前现有去除或抑制Treg的方案（主要包括：磁珠分离或CD25抗体-免疫毒素连接）临床应用较为困难3-6。而Foxp3做
12、为Treg的特异标志基因和发育及免疫抑制功能发挥的主要调节基因，其表达调控Treg的免疫抑制功能7,8。故本研究拟通过设计Foxp3的小干扰RNA（siRNA）对HCC患者Treg进行体外干扰，以期实现Foxp3 siRNA对Treg功能的特异性抑制，消除HCC患者机体内针对肿瘤免疫应答的抑制因素以增强抗肿瘤免疫应答效能。1 材料和方法1.1 研究对象4例NY-ESO-1+/HLA-A2+ 的HCC患者的外周血单个细胞（Peripheral blood mononuclear cells ,PBMC）取自北京大学人民医院2003年6月2006年5月收治的肝癌手术治疗的病人，癌及癌旁组织均经病理
13、证实。记录临床资料，包括年龄、性别、肿瘤大小、分化程度、血清甲胎球蛋白（AFP）水平、HBV和HCV感染等。TNM分期参照国际抗癌联盟（UICC）和美国肿瘤联合会（AJCC）2002年联合修订的TNM分期标准9。健康志愿者10例为健康献血员。1.2 材料与试剂3段Foxp3 siRNA采用化学合成法合成，siRNA-FAM作为检测转染效率对照，siRNA-control为非相关序列的siRNA阴性对照（Non-specific control siRNA）。鼠抗人CD4-PerCP-Cy5.5、CD25-FITC、CTLA-4-PE、Foxp3-PE、CD127-PE、GITR-FITC单克隆
14、抗体均购于美国BD公司；CD4负选、CD25正选磁珠购于加拿大Stem cell公司；Lipofectamine2000以及CFSE均购自美国Invitrogen公司；ANNEXIN/PI 双染试剂购自北京宝赛公司；IFN- Elispot检测试剂盒购自美国BD公司；NY-ESO-1157-165肽五聚体（PE-conjugated HLA-0201/ NY-ESO-1157-165 pentamer购自英国Proimmune公司；NY-ESO-1b（SLLMWITQC）由上海生物医学工程公司合成。1.3 HCC患者及健康志愿者CD4+ CD25+ T细胞的分离：将密度梯度离心法分离的PBMC
15、按照试剂盒操作进行CD4负选磁珠分选法去除单个核细胞中的CD4- T细胞，再使用CD25正选磁珠法分选出CD4+CD25+ T细胞。1.4 Foxp3 siRNA体外转染Treg采用Lipofectamine 2000按照试剂盒操作指南进行淋巴细胞转染，每1106细胞加入不同浓度siRNA （5nm，10nm，20 nm）以及脂质体10l，以siRNA-FAM进行转染效率评价。分别于转染后24、48、72 小时,收集细胞进行检测。1.5 Foxp3 mRNA 表达水平检测以实时定量PCR法检测TregFoxp3的mRNA的表达。如方法1.4中所收集的细胞，取1105个细胞，抽提RNA，并进行逆
16、转录。采用ABI公司Power SYBR-Green试剂盒。FoxP3引物为：正向：5- GAAACAGCACATTCCCAGAGTTC -3，反向：-CAACCTGAGTCTGCACAAGTGC-3。GAPDH引物为正向：-CCACAT CGCTCAGACACCAT -3- GGCAACAATATCCACTTTACCAGAGT-3PCR循环条件为，95 60 s，53 60 s，72 60 s； 35个循环后，72 8 min终止延伸，同时设GAPDH作为内参照（反应条件同Foxp3的扩增条件）。1.6 Treg表型、凋亡及Foxp3蛋白表达水平检测取上述细胞与CD4-PerCP-Cy5.5
17、、CD25-FITC、GITR-FITC、CTLA-4-PE抗体室温共孵育15 min。Foxp3-PE标记参照试剂盒操作指南进行破膜标记。凋亡检测采用ANNEXIN/PI 双染试剂标记。以流式细胞仪双色、三色分析法分别分析Foxp3 siRNA转染后对CD4+ CD25+ Treg细胞表面CD127，CTLA-4、 GITR的表达以及细胞内Foxp3的表达的影响以及不同转染浓度对Treg凋亡的影响。每份检测标本均设自身阴性对照。1.7 Treg抑制功能检测将磁珠分选出的CD4+CD25-的T细胞标记CFSE（标记浓度2ug/ml）后，加至抗CD3-抗体包被的培养板中，同时加入抗CD28-抗体
18、以刺激CD4+CD25- T细胞增殖，在培养中再分别加入分离的自身转染Foxp3 siRNA及siRNA-control的CD4+CD25+ Treg细胞，其与CD4+CD25- T细胞别按10，10.5，11，12的比例加入，共同培养72小时，流式细胞术分析CD4+CD25- T细胞增殖增殖情况。1.8 NY-ESO-1特异性CTL的诱导和NY-ESO-1157-165特异性的CTL的检测 将PBMC中去除CD4+CD25+ T细胞后的剩余细胞在体外进行IL-2 30 U/ml和IL-6 50 U/ml维持培养，同时给予NY-ESO-1157-165多肽（10 mg/L）刺激，每3-5 d刺
19、重复刺激一次，共刺激三次，进行NY-ESO-1特异性CTL的诱导。将Foxp3 siRNA以及siRNA-control转染经磁珠分离的肝癌患者CD4+CD25+ Treg后， 在CTL的诱导培养的第三轮刺激时以0.5:1（CD4+CD25+ Treg: CD4+CD25- T）的比例加入，与肝癌患者经肿瘤抗原NYESO1b多肽诱导的特异性细胞毒T细胞共培养3-6天。收集细胞标记CD8+及NY-ESO-1157-165肽五聚体进行流式检测。1.9 Elispot检测分泌IFN-的T细胞频数 采用BD公司IFN- Elispot检测试剂盒.具体操作可详见试剂盒操作说明.加入细胞组别分别为PBMC
20、单纯经IL-2维持组、PBMC（Foxp3 siRNA干扰组）以及PBMC（siRNA control干扰组），加入细胞数2105/孔.经孵育、洗板、标记、显色等步骤后采用CTL公司 Immunospot分析仪计数每孔斑点数.1.10 统计学分析 用SPSS11.0软件进行统计分析，对于多组间采用F分析，两组间比较采用双侧t检验，相关性分析采用Spearman法，P0.05为差异有统计学意义.2 结果2.1设计并合成3段Foxp3特异的siRNA，并从筛选出了稳定表达且干扰作用较好的Foxp3 siRNA： 课题组设计了系列Foxp3 siRNA，并且在体外实验中通过脂质体将这些Foxp3 s
21、iRNA转染至经磁珠分离的Treg中，通过实时定量PCR及流式细胞检测对Foxp3 mRNA的降解，从中筛选出抑制效率较高的一段Foxp3 siRNA3（图1A）。将合成的3段Foxp3特异的siRNA转染Treg后以realtime-PCR 评价Foxp3 siRNA对Foxp3 mRNA特异性的降解，研究发现在系列合成的siRNA中siRNA3对 Foxp3降解效率最高可到约70%（图1B）。2.2 Foxp3 siRNA经脂质体转染效率的评价以及转染后对Treg细胞凋亡作用的分析：将不同浓度（5nm，10nm，20 nm）的Foxp3 siRNA经脂质体转染Treg细胞，以荧光标记的si
22、RNA进行转染效率评价，同时研究不同浓度Foxp3 siRNA转染下对Treg细胞凋亡作用的影响，研究发现在20 nm浓度下Foxp3 siRNA转染效率可达到41.7%（图2B），同时约有15%的细胞出现早期凋亡或死亡（图2A），而5 nm 或10 nm Foxp3 siRNA转染效率仅为17%和25%鉴于上述的结果我们在后续的研究中采用20 nm作为Foxp3 siRNA最佳转染浓度。2.3 Foxp3 siRNA转染后对Foxp3的特异表达产物scurfin的降解：将Foxp3特异的siRNA转染Treg后流式细胞术评价Foxp3 siRNA对Foxp3特异性的达产物scurfin的降解
23、作用，研究发现经Foxp3 siRNA干扰后Treg Foxp3特异性的达产物scurfin的表达显著与未干扰组相比显著降低（图3） （78%11% VS. 17%6%，P0.05）。2. 4 Foxp3 siRNA转染后对Treg 表型的影响：将Foxp3特异的siRNA转染Treg后流式细胞术评价Foxp3 siRNA对Treg 表面分子表达的影响，研究发现经Foxp3 siRNA干扰后Treg细胞中GITR、CTLA-4表达显著下调，CD127分子表达显著上调，差异有统计学意义（P0.05） （图4）。2.5 Foxp3 siRNA转染后对Treg 功能的影响：将Foxp3特异的siRN
24、A转染Treg后将Treg与CD4+CD25-T细胞进行共培养，流式细胞术评价Foxp3 siRNA对Treg抑制功能的影响，研究发现经Foxp3 siRNA干扰后Treg细胞对效应性T细胞增殖的抑制能力显著下降（图5）。2.6 Foxp3 siRNA转染后对肝癌患者Treg抑制功能及效应性T细胞应答的影响：0.39%，P0.05）（图6A）。 与siRNA-control进行干扰的肝癌患者组相比Foxp3 siRNA干扰后的Treg与特异性CTL共培养后，肿瘤特异性CTL分泌的IFN-r的数量显著上调（13211，P0.05） （图6B）。3 讨论Foxp3又称叉状头/翅膀状螺旋转录因子，研
25、究认为Foxp3在调控Treg细胞的发育上起很重要的作用，是Treg发育和功能维持的主要调节基因7,8 。Foxp3的正常表达为Treg发挥抑制功能所必需的，Foxp3的突变可导致Treg的发育及功能障碍10。目前，关于去除Treg或抑制Treg功能，从而增强机体抗肿瘤及抗感染免疫的研究目前已取得较好的结果，该措施将有效的提高抗肿瘤及抗感染免疫治疗的效果 11，此外，在对卵巢癌患者的治疗中，通过Ontak（一种抗肿瘤药，为IL-2-毒素连接物）或抗CTLA-4抗体去除患者Treg细胞，也可获得较强的抗卵巢癌免疫应答3,4。本研究中设计并合成3段Foxp3特异的siRNA，并从中筛选出了干扰作用
26、较好的Foxp3 siRNA，研究还对Foxp3 siRNA体外转染Treg的效率以及最适作用浓度进行了系统的探讨。研究证实，Foxp3 siRNA不仅可有效的抑制Foxp3 mRNA的表达还可有效抑制Foxp3的特异表达产物scurfin的表达。 此外，对Treg中Foxp3表达沉默可显著影响Treg的表面分子的表达以及免疫抑制功能的发挥。研究发现经Foxp3 siRNA干扰后Treg细胞表面GITR、CTLA-4表达显著下调，而CD127分子表达显著上调。CTLA-4（cytotoxic T-lymphocyteassociated antigen 4）又称细胞毒T细胞相关抗原-4，也是T
27、reg表面重要膜分子，参与Treg免疫抑制功能的发挥 12；最近发现CD127的表达与Foxp3表达有很好的负相关性，CD127的低表达与Foxp3的高表达及其一致13。经Foxp3 siRNA干扰后Treg细胞抑制功能的变化一方面体现在对CD4+ CD25- T细胞增殖的非特异性的抑制功能的减弱，另一方面主要体现在对肝癌患者Treg细胞进行Foxp3 siRNA干扰后，可显著影响肝癌患者Treg体外抑制肿瘤抗原NY-ESO-1特异性CTL的诱导及IFN-r的分泌，从而起到增强肝癌患者体外诱导肿瘤抗原特异性免疫应答的作用。综上，本研究中通过Foxp3 siRNA的设计、合成以及对siRNA沉默
28、效率的进一步筛选，在体外实现了对靶细胞Treg表型及功能的干扰，从而在一定的程度上增强了肝癌患者肿瘤特异性抗原所诱导的抗肿瘤免疫应答的能力。本研究的结果将为今后联合其他肿瘤免疫治疗手段，增强肿瘤疫苗所诱导HCC患者抗肿瘤应答效率，改善肿瘤生物治疗中应答率较低的状态，进一步增强肿瘤免疫治疗的疗效奠定前期研究基础。参考文献1. 张恒辉，费然，陈红松*,等. 原发性肝细胞癌患者CD4+ CD25+ 调节性T 细胞的频率、表型及功能的研究. 中华肝脏病杂志. 2007; 15 （4） :267-2732. Zhang Heng-Hui, MEI Ming-Hui, FEI Ran , et al. R
29、egulatory T Cell Depletion Enhances Tumor Specific CD8 T-Cell Responses Elicited by Tumor Antigen Vaccine NY-ESO-1b in Hepatocellular Carcinoma Patients. Cytotherapy. 2009.（revision）3. Jens Dannull, Zhen Su, David Rizzieri, Enhancement of vaccine-mediated antitumor immunity in cancer patients after
30、depletion of regulatory T cells. J Clin Invest. 2005; 115（12）:3623-33.4. Sutmuller RP, van Duivenvoorde LM, van Elsas A, et al. Synergism of cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 blockade and depletion of CD25（+） regulatory T cells in antitumor therapy reveals alternative pathways for suppress
31、ion of autoreactive cytotoxic T lymphocyte responses. J Exp Med. 2001; 194 （6）:823-832.5. Vaclavkova P, Cao Y, Wu LK, et al. A comparison of an anti-CD25 immunotoxin, Ontak and anti-CD25 microbeads for their ability to deplete alloreactive T cells in vitro.Bone Marrow Transplant. 2006; 37（6）:559-67.6. Attia P, Maker AV,
