1、2. 继代/生根培养：如何选择适当的培养基、如何添加适当比例的激素、丛生芽生长情况（生根成苗）等；3. 初代/继代/生根培养过程中，是否染菌、死亡、褐变等并如何处理及分析。重点研究问题1. 培养基配方比例；2. 培养时，初代、继代培养数据统计及其结果分析；3. 染菌、褐变等处理分析主要技术指标植体处理达标、培养基灭菌彻底、确保无菌接种操作、合理的培养环境其它要说明的问题指导老师意见 指导教师签字：指导教师意见对论文的简短评价：1.指出论文存在的问题及错误2.对创造性工作评价3.建议成绩 优 良 中 及格 不及格 指导教师签字 评阅教师意见评阅教师签字 答辩小组评议意见学号姓名 题目 答辩小组意
2、见： 1、对论文的评价2.建议成绩等级3.需要说明的问题 答辩小组长签字 摘要：以菊花茎段作为外植体，在初代丛生芽诱导培养基、继代培养基、生根培养基上先后诱导产生愈伤组织、丛生芽、根，最后完成植株再生。同时并对每个环节存在问题进行研究分析、整理，从而总结出适合菊花茎段快繁的最佳方法。关键词：菊花；外植体；快速繁殖；Abstract: As a chrysanthemum stem explants, the early generation of problems in the bud induction medium, subculture medium, the rooting mediu
3、m has induced callus, multiple shoot clumps, roots, and finally the completion of plant regeneration. At the same time there are problems that each and every aspect of the analysis, sorting, and to summarize for the rapid propagation of chrysanthemum stem the best way.Key words: Chrysanthemum; Expla
4、nt; Rapid Propagation目录1.材料与方法91.1 材料及预培养91.1.1 材料91.1.2 预培养91.2实验设计和处理方法91.2.1培养基的制作与装瓶灭菌91.2.2接种室、器械及超净工作台灭菌91.2.3外植体的选择与灭菌101.2.4 接种101.2.4初代（丛生芽诱导）培养101.2.5继代培养101.2.6生根培养101.2.7试管苗的移栽102.结果与分析112.1初代、继代培养结果处理112.2结论分析112.2.1继代培养扩大增殖方法112.2.2细菌、真菌污染及防治112.2.3褐变及其防治122.2.4玻璃化及其防治123.讨论124.小结13参考文
5、献13致谢13 菊花（Chrysanthemum morifolium Ramat.）是菊科菊属的多年生宿根草本植物。株高20200cm，通常3090。茎色嫩绿或褐色，除悬崖菊外多为直立分枝，基部半木质化。单叶互生，卵圆至长圆形，边缘有缺刻及锯齿。头状花序顶生或腋生，一朵或数朵簇生。舌状花为雌花，筒状花为两性花。舌状花分为下、匙管、畸四类，色彩丰富，有红、黄、白、墨、紫、绿、橙、粉、棕、雪青、淡绿等。筒状花发展成为具各种色彩的托桂瓣，花色有红、黄、白、紫、绿、粉红、复色、间色等色系。花序大小和形状各有不同，有单瓣，有重瓣；有扁形，有球形；有长絮，有短絮，有平絮和卷絮；有空心和实心；有挺直的和下
6、垂的，式样繁多，品种复杂。在我国有着悠久的栽培历史2 。菊花主要靠扦插繁殖,也可进行嫁接繁殖。但扦插和嫁接繁殖均需较多的母株材料,且受季节和外界环境条件的限制,繁殖速度较慢,对于一些名贵菊花品种和母株来源不足的品种,更不能及时满足生产和市场的需要。研究和利用组织培养方法来繁殖菊花，可以在短期内大量繁殖，使得工厂化育苗成为可能，且利于新品种选育、脱毒复壮、种质资源保存等。菊花利用植物组培技术，可以使用菊花的茎尖、茎段和侧芽作为主选外植体,在不同激素水平的培养基上诱导产生愈伤组织、丛生芽和根,完成植株再生。本文以在脱毒实验中成功移栽上盆且长势健壮的普通观赏菊花的带腋芽茎段为研究材料，从菊花丛生芽诱
7、导、继代、生根培养着手研究，以期寻求低成本、高效、稳定的菊花茎段增殖方法，提高其商品化生产效率，满足菊花种苗商品化生产的要求9。1.材料与方法1.1 材料及预培养1.1.1 材料：供试材料为脱毒实验中成功移栽上盆且长势健壮的普通观赏菊花。1.1.2 预培养：将供试盆栽菊花移至室内阳光充足处正常恒温培养57天。1.2实验设计和处理方法1.2.1培养基的制作与装瓶灭菌均以MS培养基为基本培养基，附加不同生长激素等配置而成。根据实际要求，培养基制作7见下表：表-1 培养基制作配比培养基配比蔗糖琼脂pH丛生芽诱导MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.5mg/L3%0.7%5.8继代培养MS+6-BA
8、3.5mg/L+NAA0.5mg/L生根培养1/2MS+NAA0.2mg/L将已配好的培养基，趁热分装在培养瓶中（每瓶3550ml），用专用透性膜封好后放入高压灭菌锅中灭菌、待用。1.2.2接种室、器械及超净工作台灭菌6接种室的地面、墙壁要擦洗干净，接种前用甲醛或高锰酸钾稀溶液熏蒸，也可以采用紫外灯灭菌。所需器械先用70%酒精浸泡，待接种前在酒精灯下用火灼烧到变红，冷却待用。超净工作台启动前，先用70%酒精擦拭台面，再打开紫外灯照射20min,同时打开风机。接种前关闭紫外灯，打开日光灯。1.2.3外植体的选择与灭菌选用菊花的带腋芽茎段作为外植体。选取生长健壮的嫩茎先用洗衣粉水冲洗2次，再用自来
9、水冲洗2次，以洗去表面泥土杂质为标准。然后移至超净工作台上, 用 75 %酒精处理 2030 秒, 再用无菌水冲洗 35 次, 转入 0.1 %升汞溶液浸泡 810 分钟, 再用无菌水冲洗 46 次, 用滤纸吸干水分，最后将材料放入无菌的锥形瓶中封口待用。1.2.4 接种在超净工作台内，点燃酒精灯,并在酒精灯旁边工作,注意手和衣袖与酒精灯保持适当的距离,以免烧伤。在酒精灯上将操作用具烧红,待温度降至常温时进行操作。将选取用的外殖体材料切成0.51厘米左右带有腋芽的小段。用镊子夹取切好的外殖体材料,按极性方向直立迅速接种到锥形瓶的培养基中,深约23mm,注意培养瓶口始终在火焰下方,尽量使切口接触
10、培养基。每个锥形瓶可接种34 块外殖体。接种时锥形瓶应保持倾斜,接种后要迅速将瓶口在酒精灯上转动灼烧一遍进行消毒,然后迅速盖上专用透性膜封好。最后在瓶壁上上标签,注明接种材料的名称、编号和接种日期。1.2.4初代（丛生芽诱导）培养接种完成后即转入培养室，即进行初代（丛生芽诱导）培养。培养温度2228，光强10004000Lux。外植体接种到培养基上天左右，茎段开始变粗，基部逐渐增大，并在其切口周围出现少量嫩绿色、质地紧密的愈伤组织，同时茎尖也逐渐伸长，腋芽开始萌动展开。经过1015天的培养后，腋芽伸长，并形成丛生芽，逐渐长成苗丛。1.2.5继代培养当丛生芽长至1厘米长时，在超净工作台上将芽从中
11、的小芽切割开，分别转入相同的新鲜培养基上继代增值，每一个小芽又会以同样的繁殖系数产生芽从。培养温度2225，光强25004000Lux。一般继代培养的次数越多，从接种到长出丛生芽所需的时间越短，但不短于7天，若不及时转接，芽苗会迅速长高。如此反复，在短时间内就可以繁殖出大量的无根苗。1.2.6生根培养3当丛生芽长成的小苗达23厘米时，在超净工作台上将其切下转入生根培养基中诱导生根。大约710天左右的培养，小苗开始出现大量小根，最后有16条根可长的较长，芽苗也迅速长高。1.2.7试管苗的移栽芽苗生根后已在生根培养基上长至 5 cm 左右，可将瓶塞打开，让其由无菌环境转至有菌且湿度较低的环境之中约
12、35天后，便可进行移栽，移栽初期注意遮光 。大规模的室外移栽需要在苗床上进行 ,包括整地、 移栽、管理等环节。2.结果与分析本文实验因时间限制，初步完成了菊花茎段从初代到继代的培养过程，并对生根培养进行了理论分析，同时对初代、继代培养的实验数据进行了完善的统计。2.1初代、继代培养结果处理：表-2 初代培养记录表：次数接种量真菌污染细菌污染褐变玻璃化正常成活率160127623355%101382847%393965%4113660%统计：240421913657%表-3 继代培养记录表：9921304545%84152750%117186354%108244844%4087812319849
13、%成活率=正常/接种量1002.2结论分析：2.2.1初代、继代培养结果统计表-4 初代、继代培养数据统计培养类型7天生长情况14天生长情况21天生长情况28天生长情况初代培养茎段变粗，切口出现少量嫩绿色愈伤组织腋芽开始萌动，部分已有丛生芽形成丛生芽大量形成，部分已长成苗从苗从长势良好，可以做继代培养基部形成愈伤组织，丛生芽逐渐增长、增厚新的丛生芽逐渐增多，且速度加快丛生芽形成新的苗从，部分可以继续继代培养苗从基本长势良好，可继代培养或部分进行生根培养从外植体培养到长出丛生芽需要相当长的时间。但这一工作是一劳永逸的,因为大量的扩大繁殖是在丛生芽产生以后。菊花的继代培养扩大增殖可以在两个时期进行
14、。其一是在丛生芽生长以后,把长有丛生芽的愈伤组织块分离,分散的组织块在细胞分裂素水平较高的培养基上培养,让其分化出更多的芽。本实验采用的就是这种方法，本方法效率较高，缺点是接种较繁琐。其二是在长成较高的无根苗以后,把无根苗切成段,用类似扦插的方法在生根培养基上培养，使其直接发育成完整幼苗。这种方法较为简单，但效率低，不建议采用。2.2.2细菌、真菌污染及防治4表-5 初代、继代培养中的污染统计污染分类污染率染菌表现初代18%外植体周围有白色绒毛状菌丝，培养基出现绿、白菌斑16%培养基表层呈水渍状污染，外植体周围滴形云雾状污染继代19%培养基表层出现黄、白色油滴状菌斑30%培养基表层有粉红色如水
15、渍状分布的菌斑污染率=污染统计总数/接种统计总数100%一般情况下，染菌的试管苗很难生根，即使能生根，根褐化现象明显。若条件允许，可以在菊花培养基中附加50150mg/L的氨苄青霉素和50mg/L的硫酸丁胺卡那霉素，可以很好地抑制细菌的生长，而且氨苄青霉素会对菊花生根有促进作用， 而硫酸丁胺卡那霉素则会抑制生根。本文实验中，外植体预处理相当重要，需严防外植体带菌，而且在本文实验中，一般在一周时间内可以发现染菌状况，凡细菌轻微污染的，可以采取补救措施，具体如下：染菌的已接外植体或丛生芽采用75%的酒精浸洗35分钟，然后再用无菌水冲洗23次，接入相应培养基即可，然后每隔23天观察下是否还有染菌现象
16、。2.2.3褐变及其防治培养材料会向培养基中释放褐色物质，即酚类物质在多酚氧化酶的作用下，氧化形成褐色的醌类物质，导致植株中蛋白质变性、酶失活，而使培养基和培养材料逐渐变褐而死亡的现象。从表-2可以看出，第1、2次褐变较严重！为了防治褐变，本文菊花实验中，采用0.1%Vc溶液作为抗氧化剂，效果较佳。方法如下：已做灭菌处理的外植体即带腋芽茎段，放入0.1%Vc溶液中浸泡5分钟，不需无菌水冲洗，稍微在无菌滤纸上滤干，将材料放入无菌的锥形瓶中封口待用。为验证使用0.1%Vc溶液能抑制褐变的可行性，做了对比接种试验，同时在表-2中第3、4次明显可以看出，使用过0.1%Vc溶液浸泡过的茎段褐变率将明显低
17、于未使用Vc溶液浸泡的茎段。表-6 0.1%Vc溶液对比接种实验0.1%Vc溶液总数褐变数褐变率浸泡未浸泡13%0%20%517%褐变率=褐变数/总数2.2.4玻璃化及其防治由于试管苗发生生理失调，而形成发育不正常的组培苗。玻璃苗外观显示的共同特点是呈半透明状，并且可分为外观形态明显异常与基本无异常两种类型。玻璃苗的出现是植物组培技术应用于工厂化育苗的极大障碍,因而试管苗的玻璃化是植物组培过程中亟待解决的问题。本文菊花实验过程中，从表-2、表-3明显看出初代培养的玻璃化程度高于继代培养，为了防止玻璃化，继代培养采取加强光照及降低每瓶接种量来防止玻璃化现象，结果效果显著。3.讨论本文实验采用带腋
18、芽茎段作为外植体，相对纯粹单一使用茎尖或茎段或侧芽要简单的多，且在技术操作上更加容易上手。从理论上讲,植物的任何部位均能在合适的条件下成功地进行培养，但实际上不同的植物部位,其分化和形态发生能力各不相同。菊花能作为外植体的部位很多，除本试验采用的带侧芽茎段外，尖、叶、花序梗、花序轴、花瓣和根等都能作为外植体。通过对菊花的组织培养技术的研究,可以看出在以MS为基本培养基的条件下,菊花的生长依靠生长调节物质来控制。通过调节生长素与细胞分裂素的浓度比例可以有效的控制菊花芽的分化、生长及生根。这一新的组培技术的应用,将对引进的菊花优良品种的迅速扩繁、减少退化、节约成本、提高劳动生产率以及实施工厂化育苗
19、发挥积极的促进作用。4.小结本文结合实验数据，以科学严谨的方式对菊花茎段快繁的整体过程做了系统的论述和分析。主要从六个层次即培养基的制作、各项灭菌工作、初代（丛生芽）培养、继代培养、生根培养、试管苗的移栽着手，对每一步的操作过程进行细致论述。同时结合实验数据，对容易产生问题的方面做了全面的分析，并提出了合理的解决方案。参考文献：1 刘鹏，刘金，赵艳红，刘庆秀，张卫国.菊花的组织培养、脱毒与快繁技术研究.内蒙古名族大学学报（自然科学版），2005，20（4）：4104132 周瑞玲，吴雨龙.菊花的组织培养及移栽技术初探.江苏林业科技，2001，28（2）：23243 向萍，刘超权，陶友保.菊花组
20、织培养和快速繁殖.黄冈师范学院学报，1999，19（4）：79804 高建莉.菊花组织培养中细菌污染的防止.云南农业科技，2005，12（3）：5 王海燕，何小弟，黄永高.菊花组织培养技术在育种上的应用研究.江苏林业科技，2003，30（4）：25306 向太和.菊花组织培养植株再生及其后代的变异.杭州师范学院学报，2006，5（1）：42447 刘忠荣，洪波.培养因素对菊花组织培养的影响.广西农业科学，2004，6（1）：19218 王佐芝，李鸿俊，赵满萍.几种名贵菊花的组织培养与快速繁殖.运城高专学报，1993，1（4）：55569 陈希.不同外植体的选择对菊花组织培养的影响.生物学教学，
21、2005，30（1）：485010 黄莹，王怀宇.优良品种菊花的组织培养及若干问题讨论.广州园林科学，1992，24（2）：2123致谢 本文是在宋刚老师的悉心指导下完成的。从论文的选题，实验的安排到论文的撰写都倾注了导师大量的心血。导师严谨的治学态度、求实的科研作风、敏锐的学术眼光、执着的敬业精神和宽厚的为人态度使我终生受益。借此机会向两年多以来在学习上悉心指导、为人处世上谆谆教导和生活上无私关怀的谢春芹老师致以衷心的感谢和崇敬的敬意！ 此外,我也借此机会向三年以来在工作、学习和生活上给予我极大支持，帮助和指导的班主任张雪松老师和全体同学表示衷心的感谢。 最后感谢我的父母，在生活上你们给予我最无私的关爱和帮助，在精神上你们给予了我前进的动力，谨以此文献给我的父母！
