1、3.1.4取经30-35培养 24 小时的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草牙孢杆菌营养肉汤培养物1ml，加9ml0.9%氯化钠溶液，10倍稀释至约 10-510-6 ，备用。3.1.5取经23-28培养 48 小时的白色念珠菌改良马丁培养基培养物1ml，加9ml0.9%氯化钠溶液，10倍稀释至约 10-5 ，备用。3.1.6取经23-28培养 5 天的黑曲霉改良马丁琼脂培养基斜面培养物，加入4ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%氯化钠溶液，洗脱孢子，吸出并转移至空试管作为原液，取1ml加入含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%氯化钠溶液9ml，10倍稀释至 10-4
2、，混匀备用。4.细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证（平皿计数法） 验证试验至少应进行三次独立的平行实验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。4.1试验组 取试验可能用的最低稀释级供试液1ml和50100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。4.2菌液组 测定所加入的试验菌菌数。4.3供试品对照组取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。4.4稀释剂对照组 若供试品制备需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验时，可用相应的稀释液替代供试品，加入试验菌，使最终
3、菌浓度为每1ml供试液含50100cfu，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。4.5菌回收率计算试验组的菌回收率（%）=试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数100%菌液组平均菌落数稀释剂对照组的菌回收率（%）=稀释剂对照组平均菌落数4.6结果判断在3次独立的平行试验中，若稀释剂对照组的菌回收率和试验组的菌回收率均不低于70%，照该供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。4.7结果（见续页1）5.控制菌检查方法验证：5
4、.1试验组取规定量供试液及50100cfu试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。5.2阴性菌对照组方法同试验组，验证大肠埃希菌的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌。5.3结果判断阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，按此供试液制备方法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查。若试验组未检出试验菌，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。5.4验证结果：（见续页2）6.结论：本品按中国药典2010年版二部附录X J微生物限度检查法进行方法验证，结果细菌、霉菌及酵母菌可采用取供试品10g，加pH7.
5、0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀,使成1：10的供试液进行检查；可采用1：10的供试液对大肠埃希菌进行检查。附硫酸铵微生物限度检查记录细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证记录（续页1）检品名称硫酸铵批号20110509、20110510、20110511规格1Kg/瓶包装塑料瓶数量各60g生产单位德国默克公司检验依据中国药典2010年版二部附录 J供试液制备取供试品10g，加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为110的供试品溶液。菌种项目平均菌落数（cfu/皿）回收率%（应70%）123金黄色葡萄球菌试验组636866818785稀释剂对照组/供试品对照组菌液组78大肠埃希
6、菌919695枯草芽孢杆菌5351938957白色念珠菌443946黑曲霉菌42908682结论金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的回收率大均于70%，可以采用该法制备供试液及检查金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌。控制菌检查方法验证记录（续页2）控制菌验证：大肠埃希菌供试液制备验证方法试验组（大肠埃希菌）阴性菌对照组（金黄色葡萄球菌）接种MUG+-接种靛基质试验组呈阳性，阴性菌对照组呈阴性，可以采用该法制备供试液及检测大肠埃希菌。计数培养基的适用性检查室温： 相对湿度： %培养基：1 营养琼脂培养基 2 玫瑰红钠琼脂培养基 均为符合20
7、10版药典规定的干燥培养基。由中国药品生物制品检定所提供。仪器型号及编号：一 培养基的无菌性检查培养基营养琼脂培养基玫瑰红钠琼脂培养基皿数培养天数（d）符合规定45备注营养琼脂培养基灭菌批号： 20110120 培养温度 32.5 （30-35）培养箱号SPX-150B-Z（上海博迅实业有限公司） 玫瑰红钠琼脂培养基灭菌批号： 20110120 培养温度 25.5 （23-28）培养箱号LRH-250F（上海一恒科技有限公司）二 培养基的灵敏度检查1 菌液制备（1）金黄色葡萄球菌新鲜肉汤培养物1ml 9ml 0.9%无菌氯化钠溶液至含菌量 79 CFU/ml CMCC（B）26003第 4 代
8、 10倍系列稀释（2）枯草芽孢杆菌新鲜肉汤培养物1ml 9ml 0.9%无菌氯化钠溶液至含菌量 66 CFU/ml CMCC（B）63501第 3 代 10倍系列稀释（3）大肠埃希菌新鲜肉汤培养物1ml 9ml 0.9%无菌氯化钠溶液至含菌量 69 CFU/ml CMCC（B）44102第 4 代 10倍系列稀释（4）白色念珠菌新鲜改良马丁培养物1ml 9ml 0.9%无菌氯化钠溶液至含菌量 64 CFU/ml CMCC（F）98001第 3 代 10倍系列稀释（5）黑曲霉新鲜孢子悬液, 含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%氯化钠溶液稀释至与细 CMCC（B）98003第 3 代
9、菌浓度标准管相同浊度, 10倍系列稀释至含菌量 62 CFU/ml2检查结果取预先制备好的琼脂培养皿2个，每块平皿接种1ml菌液（含菌50100cfu），同时用已知质量保证的对照培养基平皿2个作对照实验，倾注培养基，混匀，待其凝固后将培养皿倒置于其的使用温度下培养48-72h，取出培养后的平皿点计菌落数。样品培养基上的微生物数应不低于对照培养基上微生物生长的数量的70%。否则，须重新检查或该培养基被视为不符合灵敏度检查要求。 营养琼脂培养温度 32.5 （30-35，2天） 培养箱号SPX-150B-Z 玫瑰红钠琼脂培养温度 25.5 （23-28，3天） 培养箱号 LRH-250F 对照培养
10、基批号：营养琼脂培养基 批号 135003-201002 玫瑰红钠琼脂培养基 批号 135003-201003 22 相对湿度： 56 %菌种类型培养基装量（ml）培养基皿数（皿）营养琼脂对照菌落计数样品与对照菌计数比例玫瑰红钠琼脂金黄色葡萄球菌2074101%73798070118%60595894%67白色念珠菌95%6169黑曲霉486290%56 符合规定实验人： 韦锋 2011 年 1 月 25 日 复核人： 王燕 2011 年 1 月 25 日三 结论： 营养琼脂培养基和玫瑰红钠培养基的适用性检查符合规定 控制菌液体培养基的适用性检查1 胆盐乳糖培养基 2 MUG培养基 二 培养基
11、的无菌性检查胆盐乳糖培养基MUG培养基管数胆盐乳糖培养基 培养温度 32.5 （30-35）培养箱号 MUG培养基灭菌批号 培养温度 32.5 （30-35）培养箱（1）金黄色葡萄球菌新鲜肉汤培养物1ml9ml0.9%无菌氯化钠溶液至含菌量 79 CFU/ml（2）铜绿假单胞菌新鲜肉汤培养物1ml 9ml0.9%无菌氯化钠溶液至含菌量 70 CFU/ml CMCC（B）10104第 3 代 10倍系列稀释（3）大肠埃希菌新鲜肉汤培养物1ml 9ml0.9%无菌氯化钠溶液至含菌量 69 CFU/ml 细菌培养温度 32.5 （30-35） 培养箱号SPX-150B-Z（上海博迅实业有限公司 （1
12、）增菌培养基促生长能力检查分别接种不大于100cfu的试验菌于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好。（2）培养基抑制能力检查分别接种试验菌于被检培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度和时间下培养，试验菌应不得生长。（3）培养基指示能力检查分别接种少量试验菌于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度和时间下培养。被检培养基中试验菌生长的菌落形态、大小、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。表一：培养时间： 24 小时 菌种类型对照胆盐乳糖培养基空白对照金黄色葡萄球菌（抑制）铜绿假单胞菌（促生长）大肠埃希菌（促生长）表二：对照MUG培养基大肠埃希菌（指示） 韦锋 2011 年 1 月 23 日 复核人： 王燕 2011 年 1 月 23 日 胆盐乳糖培养基和MUG培养基的适用性检查符合规定
