1、100-150STED显微技术50-70 STED+n技术50PALM技 术20303D STORMS20-3050-60dSTOR技 术2D SSIM技术 r3D SSIM技术100200电子显微镜0.05jX光衍射仪0.03-10二衍射极限2.1衍射极限我们能看到什么？看到多小的围？看得有多清楚？几百年来， 依靠不断进步的科学手段，微观世界正一层层揭开面纱，让人们可以看得越来越“小”，进而 可以进行研究。人的肉眼能分辨0.1毫米尺度的物体，再小，就要借助工具。1665年，英 国科学家罗伯特虎克制造了第一台用于科学研究的光学显微镜，用它观察薄薄 的软木塞切片。虎克看到了残存的植物细胞壁，它们
2、一个个像小房间一样紧挨在 一起，这就是“细胞” 一词的由来。此后，显微镜制造和显微观察技术的迅速发展， 帮助科学家第一次发现了细菌和微生物。那么，光学显微镜是否可以无止境地“放大”下去，让我们想看到 多小就能看到多小？科学家为此做了很多尝试， 最终发现，存在一道法逾越的“墙” 衍射极限。1873 年，德国科学家阿贝提出了衍射极限理论：光是一种电磁波，由于存 在衍射，一个被观测的点经过光学系统成像后， 不可能得到理想的点，而是一个衍射像，每个物点就像一个弥散的斑，如果这两个点靠得很近，弥散斑就叠加在 一起，我们看到的就是一团模糊的图像。阿贝提出，分辨率的极限近似于入射光波长的二分之一 （d=入/
3、2）。可见光的 波长通常在380780纳米之间，根据衍射极限公式，光学显微镜的分辨率极限就 在200纳米（0.2微米）左右。如果物体小于0.2微米，你仍旧看到的是一个模 糊的光斑。这就是很长一段时间，光学显微镜的分辨极限一一衍射极限。2.2突破衍射极限为了更深入的观察世界，后来有了电子显微镜、核磁共振显像、 x光衍射仪等微观观测或者显像设备，人们借助它们可以看得更“细”。但是这些设备依然 没有突破衍射极限，他们依然遵循着阿贝衍射极限。这些设备使用的是电子束等 波长非常短的入射光，自然，它们的分辨率就高。比如电子显微镜，分辨率可以 达到0.5埃（一埃等于十分之一纳米），这样就可以看到一粒一粒的原
4、子。由于生物学、医学方面的研究，更希望在生命体存活的自然状态下进行观察， 在这方面，光学显微镜有它不可比拟的优势。因此，光学显微镜的研发还是世界 科学家的研究热点。突破性的进展发生在本世纪初，近年来，随着新的荧光探针 和成像理论的出现，研究者开发了多种实现超出普通共聚焦显微镜分辨率的三维 超分辨率成像方法。较成熟的有基于单分子成像的超分辨率显微成像方法，包括 光激活定位显微技术（photoactivated localization microscopy, PALM）和随 机光学重构显微技术 （stochastic optical reconstruction microscopy,STORM
5、）以及两大类通过改造光源的点扩散函数来提高成像分辨率的方法， 分别是受激发射损耗显微技术（stimulated emission depletion, STED） 和饱和结构照明显微技术）（参考文献：吕志坚，陆敬泽.几种超分辨率荧光显微技术的原理和近期进展 ）以上这些进展，都让光学显微镜突破了衍射极限，我们称之为“超分辨成像 技术”。美国光学学会把它列为 21世纪光学五大研究计划之首）三超高分辨率显微技术3.1光激活定位显微技术PALM当显微镜需要分辨两个或者更多点光源的时候， 很难突破光学分辨率的极限来进行精确定位.而当显微镜的物镜视野下仅有单个荧光分子的时候， 通过特定的算法拟合，此荧光分
6、子位置的精度可以很容易超过光学分辨率的极限， 达到纳米级.如上所述，尽管单分子的定位精度可以达到纳米级，但它并不能提高光学显 微镜在分辨两个或者多 个点光源时的分辨率.2002年，Patterson 和Lippincott-Schwartz 首次利用一种绿色荧光蛋白（GFP）的变种（PA-GFP）来观察特定蛋白质在细胞的运动轨迹这种荧光蛋白 PA-GFP在未激活之前不发光，用405 nm的激光激活一段时间后才可以观察到 488 nm激光激发出来的绿色荧光德国科学家Eric Betzig敏锐地认识到，应用单分子荧光成像的定位精度， 结合这种荧光蛋白的发光特性，可以来突破光学分辨率的极限. 200
7、6年9月，Betzig 和Lippincott-Schwartz 等首次在Scienee 上提出了光激活定位显微技术（photoactivated localization microscopy, PALM）的概念.其基本原 理是用PA-GFP来标记蛋白质，通过调节405 nm激光器的能量，低能量 照射细胞表面，一次仅激活出视野下稀疏分布的几个荧光分子，然后用 488 nm激光照射，通过高斯拟合来精确定位这些荧光单分子. 在确定这些分子的位置后， 再长时间使用488 nm激光照射来漂白这些已经定位正确的荧光分子，使它们不 能够被下一轮的激光再激活出来.之后，分别用 405 nm和488 nm激
8、光来激活和漂白其他的荧光分子，进入下一次循环.这个循环持续上百次后，我们将得到 细胞所有荧光分子的精确定位.将这些分子的图像合成到一图上， 最后得到了一种比传统光学显微镜至少高10倍以上分辨率的显微技术，如图1所示oPALM 显微镜的分辨率仅仅受限于单分子成像的定位精度，理论上来说可以达到 1 nm的数量级。2007年，Betzig 的研究小组更进一步将 PALM技术应用在记录两 种蛋白质的相对位置，并于次年开发出可应用于活细胞上的 PALM成像技术来记 录细胞黏附蛋白的动力学过程。Patterson G H, Lippi ncott-Schwartz J. A photoactivatabl
9、e GFP forselective photolabeli ng of prote ins and cells ;Betzig E, Patters on GH, Sougrat R, et al. Imagi ng in tracellular fluoresce nt prote insat nano meter resoluti on ；Shroff H, Galbraith C G, Galbraith J A, et al. Dual-color superresoluti on imagi ngof gen etically expressed probes with in in
10、 dividual adhesi on complexes ）图1 :应用PALM技术定位单个荧光分子最后实现超分辨率 成像的示意图A，B，C，D，E，F展示了实际实验过程及得到的原 始数据；A, B, C, D, E, F展示了用高斯拟合确定荧光分子的中心， 叠加产生了超分辨率图像；（A, A ）未激活任何荧光分子时； （B, B ）用405 nm的激光激活了 4个荧光分子；（C, C ）用488 nm的激光观察一段时间后漂白了第一轮激活的 4个荧光分子；（D, D ）第二轮重新激活的另外的几个荧光分子；（E, E）两轮激活的荧光分子总和组成的图像； （F, F ）E图的局部放大3.2多色随
11、机光学重构显微法PALM的成像方法只能用来观察外源表达的蛋白质，而对于分辨细胞源蛋白质的定位无能为力。但是利用化学小分子Cy3和Cy5 Cy7等荧光分子对的光转换效应同样可以达到突破光学极限的效果。 这项技术被称为“随机光学重建显微术” （stochastic optical recon structio n microscopy, STORM） 。其发明人是哈佛大学的庄小威教授。这项技术是用很弱的光激发荧光分子， 使细胞的一小部 分荧光分子发光，而不是全部。这样由于发光的点分布比较分散，重叠比较少， 因此每个光晕可以近似为一个荧光分子。 在一次激发中，可以确定一部分光晕的中心，在下一次激发中
12、，可以确定另外一部分光晕的中心， 把这许多次激发的结 果叠加，就是完整而清晰的图像（图2）。因此，STORMS要利用荧光发色团标 记抗体对靶蛋白进行识别，可以检测到源性蛋白，避免由于外源性表达偶联荧光 蛋白的靶蛋白对其定位产生的可能的影响， 但是在活细胞应用中受到限制，并且也有可能受到免疫荧光染色过程的影响。随后，他们又利用光学像散性实现了 3D STORM达到了平面2030 nm,纵向5060 nm的成像精度。夏鹏，窦震超高分辨率显微技术研究进展；Huang B, Wang W, Bates M, et al. Three-dime nsional superresoluti on imag
13、i ng bystochastic optical recon struct ion microscopy ）利用某些荧光小分子自身可被反复激发淬灭的性质， 通过与STORMS似的操作方法，可以实现单一荧光分子的超高分辨率成像，这一方法大大简化了原始 STORI的样品制备过程，被称为dSTORM（direct STORM）值得一提的是，庄小威 研究组将SNAP标签与靶蛋白融合表达，同时将荧光分子偶联到可以结合 SNAP标签的小分子化合物上，进而标记靶蛋白，再通过降低溶解氧消耗系统以及脂肪 族巯醇的添加量，成功地在三维超高分辨率的成像中实现了空间分辨率平面 30nm,轴向50 nm,时间分辨率1
14、2 s的优异效果。有意思的是几种细胞膜标记物 也被鉴定出具有光转换性质，并被用于超高分辨率显微成像，在活细胞中得到了 3060 nm的空间分辨率和12 s的时间分辨率。最近，基于ImageJ的PALM/STORM 数据处理插件已经发布，为这两种关键技术的应用提供了极大便利。（参考文献:Heilemann M, van de Linde S, Schuttpelz M, et al.Subdiffractio n-resolutio n fluoresce nee imagi ng with conven ti onal fluoresce nt probes ;光.随机光学重建显微中的光学设计
15、与数据处理）但是，STORM方法也存在缺陷，由于用抗体来标记源蛋白并非一对一的关系，所以STORMS能量化胞蛋白质分子的数量，同时也不能用于活细胞测量。毛铮乐，王琛 .超分辨远场生物荧光成像-突破光学衍射极限）图2 :随机光学重构显微技术效果图3.3 STED受激发射损耗显微术在1994年，Stefan提出了一种理论，利用受激辐射损耗原理，将一束由相位调制产生的空心环形激光围绕激发光，导致环形区域的分子受激辐射，而只 有光束中心部分的荧光分子被激发光照射产生自发辐射，进而被独立检测出来。 随着环形激光强度不断升高，其孔径也相继减小，藉此突破光学极限 （图3）。他们将这种显微镜技术命名为 STE
16、D（stimulated emission depletion microscopy）。 几年后他在哥廷根大学制造出了这种显微镜， 将xy轴分辨率水平从200 nm提升到了 70 nm左右（图3），成功地打破了光学分辨率极限。随后， Hell领导的研 究组又通过将STED与 4Pi结合以及通过两种相位调制的方法，将其从二维成像 扩展到三维（3D STED），实现了 xyz三个方向上的超高分辨率成像。由于 STED技术以共聚焦显微镜为基础，因而在成像深度上具有很大的优势，实验证实其可 以在350卩m厚度的脑切片中得到极高的分辨率。 目前应用STED技术已经实现了在活体小鼠中直接对脑组织进行观察，
17、其观察深度达 1015m，分辨率至少达到 70 nm。夏鹏，窦震.超高分辨率显微技术研究进展）应用STED成像，点光源的光斑大小直接发生 改变，其半高宽大小从传统的 一变成 入一，其中I是STED激光器的最大聚焦2nsin a 2nsin a +丄I sat强度，而Isat则是当受激荧光强度被减少到1/e时的STED激光的强度特征 值由此公式可看出，当I/Isat 的值趋近无穷大时，STED成像的点光源的半高宽趋近于0，亦即分辨率不再受光的衍射过程所限制. STED成像技术的最大优点是可以快速地观察活细胞实时变化的过程，因此在生命科学中应用更加广 泛例如，应用成熟的 STED显微成像技术发现，
18、海马神经元上囊泡蛋白synatotagmin I在各种刺激后都以一种“簇”的形式存在于神经突触前端膜上， 这首次揭示了这种膜蛋白以集合的形式存在于细胞质膜上然后被统一回收的方 式。之后Hell等又进一步发展了这种方法，使之可以用于 EGFP标记的信号和多种颜色的超分辨率检测.目前，STED作为一种成熟的方法，已经可以高速地 监测活细胞高分辨率图像。例如在2008年Scienee上发表的文章表明，应用STED 技术已经可以以视频的速度（每秒28帧）来采集记录神经细胞突触小泡的高分 辨率图像（50 nm）。吕志坚，陆敬泽 几种超分辨率荧光显微技术的原理和近期进展；Willig K I, Kelln
19、er R R, MeddaR, et al. Nanoscale resolution in GFP-based microscopy ;Meyer L, Wildanger D, MeddaR, et al. Dual-color STEDmicroscopy at 30-nm focal-planeresoluti on ）STED技术的不足之处在于光学系统实现起来比较困难，需要非常强的 STED激光来抑制受激点光源的激发。因此， Stefa n进一步对这个系统进行了改进，他找到了一些具有可反复激发淬灭特性的荧光分子，利用其特性，将 STED激光以高频蓝光代替，使得激发光束中心的点光源周边
20、的分子非常快速的被淬灭， 待中心点光源成像后再移动光束进行下一个位置的激发 -淬灭循环。这个改进中使用的高频蓝色激光所需要的能量较 STED激光缩小了千倍，大大降低了对光学系 统的要求。利用这种原理， Stefa n 小组进一步发明了 GSDIM（grou nd statedepletion with in dividual moleculereturn） ，可利用多种小分子进行超高分辨率显微成像，可以得到507Onm的分辨率。但是为使这些小分子可以反复激 发和淬灭，需要在溶液中添加一种溶解氧消耗系统以及脂肪族巯醇， 使得其无法应用于长时间的活细胞观察。而后来发现的一些可反复激活型荧光蛋白，使
21、得该 方法在活细胞层次上的应用得到了进一步加强。图2： STED超高分辨码率成像技术3.4饱和结构照明显微技术 SSIM改变光学的点扩散函数来突破光学极限的另一个 方法是利用饱和结 构 照 明 显微技 术（saturated structure illumination microscopy,SSIM）.早在1963年，Lukosz和Marchand就提出了特定模式侧向入射的光线 可以用来增强显微镜分辨率的理论.2005年，加州大学旧金山分校的Gustafsson博士首先将非线性结构性光学照明部件引入到传统的显微镜上，得到了分辨率达到50 nm的图像。SSIM技术的原理是将多重相互衍射的光束照
22、射到样本上，然后从收集到的发射光模式中提取高分辨率的信息，如图 4所示。候尚国基于多种非线性效应的超分辨成像研究 ）图4 :通过衍射的莫阿干涉效应来提高分辨率当一个未知结构的物体 （a）被一个结构规则的照射模式 （b）的光所照射时，会产生云纹条纹（moir efringes）（c）.云纹条纹发生在采样物体的空间频率与照射光线的空间频率有差异的 地方.显而易见，在显微镜下直接观察，就可以看到它放大了原先不能够分辨出来的样本结 构.通过计算机进一步分析所有条纹中包含的信息，可以重组出样本的高分辨率图像。四超高分辨率成像技术的发展趋势4.1 z平面轴向的超高分辨率需求以上所讨论的几种超分辨率成像方法
23、， 其分辨率的改进都在xy平面.而事实上，由于传统显微镜在光传播方向上 （z轴）的点扩散函数的半高宽大约为2入 入r ,小于xy平面的半高宽 -,因此其理论z轴分辨率本来就低于其nsin a 2nsin axy平面的分辨率.另外，对厚的生物样本进行显微三维成像时，由于样本本身 的折射系数与物镜的折射系数不同，在 z轴方向上产生显著的球面象差（spherical aberration） ，从而使图像在z轴上的分辨率降低.如果要充分观察细胞的三维精细图像，就必须大幅度提高成像的z轴分辨率.因此，近年来， 国际上各个研究超分辨率显微成像的小组也不断地探索提升 z轴分辨率的手段。育杰，轩泽浅谈2014
24、年诺贝尔化学奖：超高分辨率荧光显微成像）4.2超高分辨率显微技术发展趋势与21世纪初相比，三维超分辨率显微成像已有很大的发展， 有多种不同成像技术实际应用于生物系统的例，甚至已经出现了商业化的超分辨率显微成像系 统.但是，目前的成像模式仍然远远没有达到完美状态， 对于固定样本成像其三维分辨率还没有达到可以和电子显微镜相媲美的几个纳米的围. 当前的发展趋势是结合不同成像模式的优点，进一步提高成像的精度和准确度.例如， 2009年霍华德-休斯研究院的研究人员将PALM/STORM技术和光的干涉原理结合起来 （类似于4n和SSIM成像的原理），将三维的分辨率提高到20 nm以，并极大 地提高了收集同
25、样光子后的定位精度. 为了进一步提高图像的分辨率、对比度和成像的灵活性，人们努力的另一个方面是继续开发出量子效率更高、 荧光更稳定、颜色不同的荧光蛋白或者是荧光染料. 例如，Jennifer Lippincott-Schwarz 实验室于2009年开发出稳定的红色光激活荧光蛋白 PA-mCherry，使对两种不同蛋白质同时进行超分辨率 PALM成像成为可能。由于 生命现象是非静止的不停歇活动的本质，超分辨率成像应用的一个重要领域是活细胞成像，如近来已有报道的可应用于 活细胞 上的超 分辨率 成像技术包括SSIM技术、PALM技术和STED技术等。但是，活细胞上快速成像的 分辨率远低于固定样本成
26、像，其时间分辨率也较低。因此，当前的研究热点集中 在通过改进荧光探针和成像模式来进一步提高活细胞上超分辨率成像的时空分 辨率。Shte ngel G, Galbraith J A, Galbraith C G, et al. I nterferometricfluoresce nt super-resolutio n microscopy resolves 3D cellular ultrastructure ）应用和进一步完善超分辨率显微镜成像技术，将使得科学家实时动态观察生 物有机体的生化反应过程成为现实，为深刻认识复杂生命现象的本质打开了黑箱 之窗，使得人们可以直观地从基因表达、蛋白质相互作用、信号网络、细胞功能 等多层面、多视角观察研究有机体个体发育、遗传进化、重大疾病发生、环境对 生命个体影响等生命现象发生、发展的过程，对阐释生命活动的基本规律、 揭示疾病发生机理、建立疾病预警系统、提高医疗诊治水平、探寻发现新药物具有重 大作用。
