1、233、等温核酸扩增技术 83、生物芯片 931 微阵列芯片 1032 微流控芯片 104、国内外 POCT 化的分子诊断产品 1341、Cepheid 的 GeneXpert 1342、Nanospere 的 Verigene 系统 1443、卡优迪生物科技的 Mini8 1444、北京博奥生物的 RTisochip-A 核酸分析仪 155、国内重点公司分析 1651、利德曼 1652、博晖创新 176、发展风险分析 181、分子诊断概述分子诊断是采用分子生物学的理论和技术，通过直接探查核酸的存在状态或缺陷，从核酸结构、复制、转录或翻译水平分析核酸的功能，从而对人体状态与疾病做出诊断的方法。
2、它检测的基因有内源性（即机体自身的基因）和外源性（如病毒、细菌等）两种，前者用于诊断基因有无病变，后者用于诊断有无病原体感染。回顾分子诊断学 20 余年的发展历史，大致经历 3 个阶段：1） 利用核酸分子杂交技术进行遗传病的基因诊断；2） 利用以定量 PCR 为代表的核酸扩增技术，检测存在于宿主的多种 DNA 和 RNA 病原体，及多基因遗传病细胞中 mRNA 的表达量；3） 以生物芯片技术为代表的高通量密集型检测技术，分析过程自动化、分析速度提高，实现高通量、大规模的快速检测病原体和疾病组织中的突变序列。PCR 产品占据目前分子诊断的主要市场，生物芯片是分子诊断市场发展的主要趋势。2、分子诊
3、断技术原理分子诊断的主要技术有核酸提取方法、核酸分子杂交、核酸扩增技术。21、核酸提取方法传统的 DNA 提取方法是一般先破碎细胞，用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质，而核酸保留在水相中，加入 RNA 酶去除 RNA，最后用异丙醇、乙醇把 DNA 从提取液中沉淀出来。而磁珠法核酸提取，通过超顺磁性氧化硅纳米磁珠与核酸分子特异性地识别和高效结合，在 Chaotropic 盐（盐酸胍、异硫氰酸胍等）和外加磁场的作用下，能将核酸从血液、动物组织、食品、病原微生物等样本中分离出来。相比传统的核酸提取方法，磁珠法核酸提取具有自动化、高通量、操作简单、用时短、安全无毒、提取的核酸纯度高等特点。22、核酸分子杂
4、交技术具有一定互补序列的核苷酸单链在液相或固相中按碱基互补配对原则缔合成异质双链的过程，称为核酸分子杂交。杂交的双方是待测核酸序列和探针序列，通过检测核酸探针序列上的标记物，来反映待测核酸序列的含量。探针的标记需要高灵敏性、不影响碱基配对的特异性、不影响探针分子的主要理化性质、对酶促反应活性无影响、检测方法具有高灵敏性和特异性。标记方法包括 32P、35S 和 3H 等核素标记物及生物素、荧光素或者化学放光探针等非核素标记物。核酸分子杂交技术包括固液杂交和液相杂交，固液杂交则包含膜上印记杂染（Southern 和 Northern）和原位杂交；液相杂交则包括 RNA 酶保护分析法及核酸酶 S1
5、 保护分析法等。23、核酸扩增技术核酸扩增是一大类技术方法的总称，目前包括常规 PCR、实时荧光定量 PCR 和等温核酸扩增技术等。231、常规 PCR聚合酶链反应（即 polymerase chain reaction，PCR） 原理：PCR 是模板 DNA、引物和四种脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP ）在 DNA 聚合酶作用下发生酶促聚合反应，扩增出所需目的 DNA。包括三个基本步骤： 双链 DNA 模板加热（90-96）变性成单链（变性 Denature）； 在低温（50左右）下引物与单链 DNA 互补配对（退火Annealing）； 在适宜温度下 TapDNA 聚合酶催化引物沿着模板 DN
6、A 延伸Elongation。由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的 DNA扩增一倍，这些经合成产生的 DNA 又可作为下一轮循环的模板，所以经25-35 轮循环就可使 DNA 扩增达 106 倍。232、定量 PCR 技术实时定量 PCR 技术，是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过 Ct 值和标准曲线对样品中的 DNA 或者 cDNA 的起始浓度进行定量的方法，实时荧光定量 PCR 是目前确定样品中 DNA 或 cDNA 拷贝数最敏感、最准确的方法。对实时定量PCR标记的荧光基团包含有以SYBR
7、染料为代表的非特异性荧光标记（仅与 DNA 双链结合）、以及以 Taqman 探针为代表的特异性荧光标记（利用荧光能量共振转移 FRET 技术来进行检测）。（1）荧光染料在 PCR 反应体系中，加入过量 SYBR 荧光染料，SYBR 荧光染料非特异性地掺入 DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步。SYBR 仅与双链 DNA 进行结合，可以通过溶解曲线确定PCR 反应是否特异。（2）荧光探针将标记有荧光素的 Taqman 探针与模板 DNA 混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守
8、聚合酶链反应规律，与模板 DNA互补配对的 Taqman 探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得 Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。实时定量 PCR 技术无需杂交检测，可以实时检测结果，加快了检测的速度，只需要 1-2 小时的时间就能得到检测结果。但在进行多种病原体检测的时候，需要向同一体系中加入多种病原体的特异性引物，由于不同 PCR 引物扩增效率、反应体系不同等问题，定量 PCR 非常难以应用于多重检测。233、等
9、温核酸扩增技术恒温扩增技术是继PCR技术后发展起来的一门新型的体外核酸扩增技术，扩增反应的全过程（除初始的杂交步骤外）均在单一温度，无需专门的扩增仪器下进行。目前主要的恒温扩增技术有：滚环核酸扩增、环介导等温扩增、链替代扩增、依赖核酸序列扩增和解链酶扩增。它们都具有共同的特点：恒温、高效、特异、不需要特殊的仪器设备。 其中依赖核酸序列扩增与环介导等温扩增是相对稳定的技术，应用较多。3、生物芯片生物芯片技术是近年发展起来的分子生物学与微电子技术相结合的核酸分析检测技术，是运用分子生物学、基因信息、分析化学等原理进行设计，以硅晶圆、玻璃或高分子为基材，配合微机电自动化或其他精密加工技术，所制作的高
10、科技元件，具有快速、精确、低成本之生物分析检验能力。生物芯片样品处理能力强、用途广泛、自动化程度高等特点，具有广阔的应用前景和商业价值，是分子诊断领域的一大热点。 生物芯片根据原理不同，可分为微阵列芯片（Microarrays）和微流控芯片（Microfluidic chip）两类。31 微阵列芯片最初的生物芯片技术主要目标是用于 DNA 序列测定、基因表达谱鉴定和基因突变体检测和分析，所以又称为 DNA 微阵列或基因芯片技术。微阵列芯片的作用原理是在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交的检测分析，得出样品的遗传
11、信息。 微阵列芯片在数平方厘米之面积上布放数千或数万个核酸探针,检体中的 DNA、cDNA、RNA 等与探针结合后，借由荧光或电流等方式侦测，一次测验即可提供大量基因序列相关信息，具有快速、精确、低成本之 生物分析检验能力。32 微流控芯片现阶段，生物芯片已经朝着一个高度自动化、集成化的方向发展，核心理念就是建立一个“芯片上的实验室”（Lab-on-a-chip），微流控技术的发展使得这个理念得到实现。微流控芯片是指通过微电子机械系统（Micro-electro-mechanical Systems，MEMS）技术在固体芯片表面构建微型生物化学分析单元和系统，以实现对无机离子、有机物质、蛋白质
12、、核酸以及其他生化组分的准确、快速和大信息量的检测。在微流控技术用于核酸诊断的应用过程中，将核酸提取、扩增及检测过程等基本操作单元集成到一块几平方厘米大小的芯片上，并以微通道网络贯穿各个实验环节，从而实现对整个实验系统的灵活操控，承载核酸诊断的各项功能。微流控芯片技术将核酸诊断过程全面整合，只需加入样本即可，大大简化了检测过程的操作难度，排除了不同操作者实验技能的影响，并解决了外源核酸对检测结果的干扰问题。图表 7：微流控芯片是一个完整的微型实验室微流控芯片样品体积只需几微升，加热器直接集成在芯片上，与传统的 PCR 相比，在相同扩增效率下，芯片的热循环效率快 2-10 倍。同时连续流动式 P
13、CR、热对流驱动 PCR 等技术的使用，使得扩增过程加快，现有的微流控芯片能够将诊断检测过程缩短至最低 10-15 分钟。图表 8：微流控芯片 PCR 技术微流控芯片中具有很多微管道，可对不同的反应室进行隔离。微流控芯片中不同反应互不干扰，从而具有多重检测的功能，可同时检测多个样本，或同一样本的不同指标。由此，通过在微流控芯片中设置多个反应室，最多可同时进行数十个检测，实现高通量检测。图表 9：微流控可实现多重检测微流控芯片所使用的材质为玻璃、硅片、聚合物等，成本不高；制作方法包括光刻、蚀刻、模塑法、注塑法、激光烧蚀法等，制作工艺也较为成熟；对液体流动过程的控制也有电动流控制、数字化微流控、压
14、力驱动流体控制、被动毛细力流体控制等多种控制方式。微流控芯片的生产具有较为成熟的工艺，已经被用于电化学血气分析、心肌标志物免疫检测、病原体核酸诊断等多个方面。图表 10：微流控芯片可作为合适的 POCT 产品由以上所知，微流控芯片满足了 POCT 在检测性能、易用性、成本上的各种需求，简化了操作步骤，显著提高检测效率，是核酸诊断 POCT化的重要发展方向。4、国内外 POCT 化的分子诊断产品41、Cepheid 的 GeneXpertGeneXpert PCR 仪包含微流样品管、超声装置、注射装置、旋转装置、直角光路设计的特殊定量 PCR 反应管等几个部分，从样品制备到完成测试最快仅需 30
15、 分钟左右，大大缩减了样品的制备时间。PCR 仪具有四种不同的型号，分别具有 1、2、4、16 个独立的反应模块，每个反应模块均具有独立的光学以及热学校准，可以随时分别开始反应；一台电脑可同时连接 6 台 PCR 仪，灵活性强，极大满足了实验室对检测量的需求，同时也降低了成本。相应的试剂盒 Xpert MRSA 则是将酶、dNTPs、缓冲液等全部浓缩在一个微珠（Bead）中，而基因特异性引物、荧光探针、内参则包含于另一个微珠中。检测时，只需将两个微珠加入卡盒中，GeneXpert PCR 仪就可以自动完成样品测试，大大减轻了操作人员的工作强度。独特的微珠试剂设计一方面可保持样品和试剂在常温下的
16、稳定性，以及在微流样品管中的快速溶解，另一方面也便于精确操作减少误差，使得同一反应在任何时候任何地点都可以得到高度一致的检测结果。图表 11：GeneXpertPCR 仪及试剂盒Cepheid 公司的试剂利用定量 PCR 的方法来检测，无需杂交，整体速度很快。在进行多种病原体检测的时候，单个卡盒很难进行多重检测，但可以同时使用多个卡盒，通量的问题得以解决，但成本过高。42、Nanospere 的 Verigene 系统Verigene 系统可自动完成提取核酸、杂交、并通过银染染色将杂交信号放大，之后得到定量的分析数据。Nanosphere 使用直径 13-20nm 的带有寡核苷酸修饰的纳米微球
17、，使用纳米微球比普通的荧光微球具有更好的灵敏度。甚至可以不需要进行 PCR，仅通过信号扩增就能完成检测。 Verigene 系统将反应器和读数器分开，检测的方便性较 GeneXpert弱，同时需要有杂交的步骤，反应时间也较慢，但 Verigene 系统的卡盒可适用于多重检测，为检测带来了方便性。图表 12：Nanosphere 的 Verigene 卡条及仪器43、卡优迪生物科技的 Mini8卡尤迪生物科技是中国首家专注研发手持型通用荧光定量PCR仪的生物公司，其首创的“一键式一步法 Mini8 实时荧光定量 PCR 检测系统”，简化了核酸的提取步骤，重量仅 21kg，可使用 12V 直流电源
18、，适合车载移动使用，最快 10-15 分钟得到结果。2015 年为非洲埃博拉疫情，Mini8实时荧光定量 PCR 检测系统被列入 WHO 官方名录，成为中国首家入选的核酸检测设备供应商。另外公司仍在利用 Utah 大学的 Extreme PCR 技术，开发仅需 10 多 秒就能得到检测结果的新一代产品。图表 13：卡优迪 Mini8 实时荧光定量 PCR 检测系统44、北京博奥生物的 RTisochip-A 核酸分析仪2015 年 4 月 20 日，CFDA 批准博奥生物集团有限公司的恒温扩增微 流控芯片核酸分析仪 RTisochip-A 医疗器械注册。博奥生物利用环介导等温扩增（LAMP）技
19、术，无需 90以上的高温变性过程，特异性更高，反应更快，最快 20 分钟出结果；微流控碟式芯片上的 24 个检测通道，避免不同反应池的交叉污染，可以进行多指标的并行检测；每个样品反应量仅需 14L，节省反应试剂，非常符合快速诊断的需求。为了充分满足客户对不同检测样品数和指标数的需求，博奥生物提供 1*24、2*11、3*8 三种不同型号的碟式芯片。5、国内重点公司分析51、利德曼北京利德曼（300289）将与英国 ENIGMA DIAGNOSTICS LIMITED （以下简称“Enigma”）合作共同设立合资公司，成为 Enigma 的独家合资伙伴，向中国市场交付 Enigma Mini L
20、aboratory 床边分子诊断系统。Enigma 将向该合资企业转授权其技术和知识产权，使之能为中国市场开 发相关的分子检测、其他产品和仪器，并能在中国境内制造生产。 Enigma 公司成立于 2004 年，系一家设立并注册于英格兰和威尔士的公司，专注于分子诊断设备、检测及其他产品，拥有 Defence Science Technology Laboratory 授予的一系列专利的独家许可以及美国应用生物系统公司和 Celera Licences 的实时 PCR 设备推广的许可，并致力于研发和商业化项目。Enigma ML 系统提供了将现有分子诊断的前处理、PCR 检测、数据处理和分析、数据
21、传输合为一体的全自动化解决方案，将反应所需的全部试剂预装入一次性卡架内进行操作，免去了之前 PCR 产品费时费力的样本核酸提取和其它操作过程。此产品利用实时定量 PCR 的方法进行检测，将独有的直接加热技术应用于 PCR 扩增过程中，即保留了定量 PCR快速的特点，又利用特有的实时 PCR 反应体系实现单管一次性多指标检测。Enigma ML 系统的测试数据可安全上传至云端服务器，可集中进行流行病学调查数据处理，同时在医院临检系统可以实现检测结果的实时传输和远程诊疗。52、博晖创新博晖创新（300318）于 2007 年 4 月与美国 Kionix 公司成立合资公司博昂尼克，获得了 Kioni
22、x 公司“层状微流体结构与制造方法”的专利权。美国 Kionix 公司成立于 1993 年，专注于发展三维惯性传感器业务，同时开发了可用于人体外医疗检测的微流体芯片技术。博昂尼克研发的项目为包含微流控生物分子检测仪、分子检测芯片、检测试剂三种产品组成的微流控生物分子检测系统。其微流控生物分子检测技术所包含的技术过程分为提取纯化、PCR 扩增、核酸杂交和终点数据检测，此技术解决了分子诊断当中的自动化问题，研制成功后可将分子检测的过程大大优化，提高检测速度，降低检测成本。目前博晖创新（300318）基于微流控芯片技术平台的“分子诊断法微流控芯片技术平台及基于该平台的 HPV 检测系统”目前正在申报
23、，没有采用实时定量PCR的检测方式，完成后可以实现多人份一次同时检测。6、发展风险分析分子诊断行业与体外诊断行业中的生化诊断、免疫诊断一样，自动化、去中心化检测都是一个趋势。市场上大部分的分子诊断产品操作复杂、容易发生样品污染，对人员和环境要求非常高；微流控芯片整合了核酸提取、扩增及检测过程，反应过程处于封闭的环境中，减少了操作人员的负担及污染的可能性，实现了随时随地快速检测的需求，为医疗检验和疾病防控带来巨大的帮助。微流控芯片技术在分子诊断中已经有非常好的应用，美国 Cepheid公司正是凭借其微流控产品成为了分子诊断领域中重要的公司；微流控芯片技术将会是分子诊断 POCT 化的重要发展方向。风险在于微流控芯片技术是结合微机电加工、生命科学、化学合成、分析仪器及环境科学等许多领域学科的新产品，技术要求高，开发周期较长；另外测序技术的不断发展，实现高通量的检测，可能会对现有基于 PCR 扩增的微流控技术带来冲击。
