1、RSD=2.83%. ConclusionThis method is convenient and accurate, and it can be used toestablish quality control of the medicinal material.Key words：Calcium Disodium Versenate coordination titration method; Beihanshuishi寒水石（Gypsum）始见于吴普本草，作为凝水石别名1 。在中国药典（2005年版）中有 5 味成方制剂中使用了北寒水石2。在其他的藏药、蒙药的部颁、地区标准中有 110
2、 余味成方制剂中使用了寒水石，但是未说明是南寒水石或者北寒水石。在1995 年版、2000 年版和 2005 年版中国药典寒水石均被列入 成方制剂中本版药典未收载的药材及炮制品 目录中，但也未注明是南寒水石还是北寒水石。中华人民共和国卫生部药品标准中药材中收载了南寒水石和北寒水石。南寒水石为碳酸盐类矿物方解石族方解石，主含碳酸 CaCO3;北寒水石为硫酸盐类矿物硬石膏族红石膏，主含2含水硫酸钙（CaSO4 2H2O）3。而中药常用药材石膏（GYPSUM FIBROSUM）是硫酸盐类矿物硬石膏族石膏，颜色为白色、灰色或淡黄色2。六省区藏药标准中收载了寒水石（据考证是北寒水石）的质量标准4，但是未
3、建立主成分含量测定的方法及对主成分的含量限度进行规定。为了保证北寒水石的用药的规范，本研究对北寒水石的性状标准进行了修订，并对北寒水石主成分含水硫酸钙（CaSO4 2H2O）的含量测定方法进行了系统的方法学考证，建立了北寒水石主成分含量测定方法，在此基础上对含量的限度进行了规定。1 仪器与试药1.1 仪器恒温干燥器（北京中兴伟业实验仪器公司），电子天平（AL104 梅特勒-特利多）（均经鉴定合格），酸式滴定管（北京玻璃仪器厂和天津市天科玻璃仪器制造有限公司生产，均经检定合格），箱式电阻炉（沈阳市节能电炉厂 型号：SY-4-13）。容量瓶、量筒、移液管（均经鉴定合格）、烧杯、锥形瓶、玻璃棒若干。
4、1.2 药品和试剂乙二胺四醋酸二钠溶液（0.050 25 mol/L）经标定，（乙二胺四醋酸二钠，北京化工厂），钙黄绿素指示剂，盐酸（分析纯，白银良友化学试剂有限公司。批号：080603），氢氧化钾（分析纯，天津百世化工有限公司。批号：2008-01-10），甲基红（分析纯，上海建信化工有限公司。2007-01-12），0.025%甲基红的乙醇溶液，氨试液（分析纯，白银良友化学试剂有限公司。080520），氨-缓冲液（pH10.0），指示剂（铬黑 T，天津大茂化学试剂厂），基准氧化锌（天津市光复科技发展有限公司，批2008-08-28），其它所用试剂均为分析纯。对照品：石膏成分分析标准物质（3
5、GBW03109a 定值日期 1993-05，有效期 2012-05，国家标准物质中心提供，国家技术监督局批准）。北寒水石样品共 6 批，经本单位李天才副研究员鉴定为北寒水石。2 方法与结果2.1 性状和理化鉴别性状和理化鉴别部分参照中国药典（2005 年版）附录方法2 。2.1.1 性状本品呈扁平块状、长块状、或不规则形状，大小不等;粉红色,半透明，表面凹凸不平;体重，质硬，断面具纵纹理，纤维状;具星状或针状玻璃样光泽;气微，味淡。2.1.2 理化鉴别取本品一小块（约 2 g）,置具有小孔软木塞的试管内，灼烧，管壁有水珠生成，小块变为不透明体。另取本品粉末 0.2 g，加稀盐酸 10 ml，
6、加热使其溶解，溶液显钙盐的鉴别反应和硫酸盐的鉴别反应。2.2 含量测定4tips:感谢大家的阅读，本文由我司收集整编。仅供参阅！春夏两季杨梅树叶部精油成分及抗氧化活性的比较研究钟瑞敏，张振明，肖仔君，王羽梅，曾庆孝【摘要】 目的探讨不同季节乌杨梅叶部精油成分与抗氧化活性的差异。方法采用GC-MS 联用技术结合 Kovats 保留指数对比法分析了春夏两季乌杨梅鲜叶精油的成分，运用 DPPH 自由基清除法、 -胡萝卜素漂白法和硫代巴比妥酸法对精油抗氧化活性进行了综合对比分析。结果春季精油产量（0.13%）高于夏季（0.05%），春季精油成分以倍半萜烯含氧衍生物为主（占 52.69%），夏季精油则以
7、倍半萜烯为主（占 70.04%），其中 5-羟基白菖烯是变化差异最为显著的特征成分。春季精油表现出优良的脂质抗氧化和清除DPPH 自由基活性，而夏季精油仅表现出有限的脂质抗氧化能力。结论杨梅叶精油产量和品质随季节而变化, 春夏两季精油的抗氧化活性差异可能与它们特征组分的相对含量存在显著差异有关。5【关键词】 乌杨梅; 芳香精油; 季节变化; 抗氧化活性杨梅 Myrica rubra Sieb. et Zucc.系杨梅科（Myricaceae），是原产于中国的亚热带树种，我国有 6 个种1。杨梅可药食两用，宋代食疗本草和明代本草纲目对杨梅的药用功效均有记载。杨梅的枝叶、根、皮在中国大陆、台湾地区
8、和日本等地常用作收敛剂、解毒剂和肠胃止泻剂等传统中药成分2。二十多年来，日本和我国学者对杨梅枝叶溶剂萃取物的药用成分进行过较深入研究，先后分离出杨梅素、单宁、三萜和二芳基庚萜化合物等几类活性成分36，近年来还分离得到两种具有抗肿瘤活性的香豆素衍生物等成分7，8。药理研究表明杨梅叶甲醇萃取物可治疗 NO、CCl4-和 -萘基异硫氰酸酯诱导的肝损伤，50%乙醇萃取物可抑制体内黑色素的合成9，10。杨梅属于芳香植物，近年来相继开展了针对不同属杨梅叶芳香精油的分析和生物活性研究。本作者11，12对分布于南岭自然保护区内乌杨梅树不同药用部位的精油成分及其生物活性也进行了系统研究，发现其具有优良的抗氧化和
9、抗食源性致病菌活性，精油特征成分及含量与矮杨梅13、丁岙杨梅14及东魁杨梅15叶部精油存在较大差异。芳香精油的产生与植物的生理和生长环境条件高度相关, 同种芳香植物因生长环境的差异，精油含量和品质差别显著，而且在不同季节、不同生长期、植株的不同部位，精油及其有效成分含量也不同16，17。本文对国内南方省份资源丰富的乌杨梅春、夏两季鲜叶芳香精油进行了含量测定，采用 GC-MS 联用技术并结合 Kovats 保留指数（KI）对比法对其成分进行了比较鉴定，同时通过国际上普遍采用的 3 种体外评价方法对其抗氧化活性进行了对比研究，旨在为6客观评价其药用价值和保护性开发提供科学的基础数据。1 材料与仪器
10、1.1 材料乌杨梅 M. rubra var.astropurea Tsen.新鲜枝叶由广东南岭国家自然保护区大顶山管理处分别于 2006 年 4 月和 7 月提供，鲜叶均采自同一颗具有 15 年树龄的大树，采收后速冻处理待用。品种经保护区彭华贵工程师与该自然保护区标本库标本对照鉴定。主要试剂包括：C8-C21 系列正烷烃（气相色谱纯，中国医药集团，上海），亚油酸（Alfar aesar, 德国），DPPH 自由基（2,2 -Diphenyl-1-picrylhydrazyl） （Sigma,美国），AAPH 自由基2,2 -Azobis（2-methylpropionamidine） dih
11、ydrochioride （ Aldrich，美国），硫代巴比妥酸（Sigma，USA）, -胡萝卜素（Sigma，USA），2,6-二叔丁基对甲酚（BHT）和抗坏血酸均为分析纯。1.2 仪器芳香精油测定仪（广州玻璃厂），气质联用仪（Finnigan TRACE /DSQ，美国热电），紫外可见分光光度计（916 型，澳大利亚 GBC）。2 方法2.1 精油提取与含量测定采用水蒸气同步蒸馏法提取精油。沸蒸回流 3 h。精油用无水硫酸钠脱水，过滤后取适量正已烷溶解稀释为 1 10-3（V/V）浓度用于气质联用分析。7样品测定前均置于-25下贮存。2.2 气质联用分析 GC-MS 分析采用韶关学院实
12、验中心 TRACE GC/DSQ 气质联用仪完成。GC 条件：色谱柱为 DB-5 石英毛细管柱，30 m 0.25 mm 0.25 载气为高纯氦（99.999%）;柱流量 1ml min-1; 不分流进样;进样口温度 220;传输线温度 210;进样量1 l。程序升温，柱温 40（1 min）-10（/min）-200（3 min）。MS 条件：电离方式 EI，电子能量 70 eV，发射电流 100 mA，离子源温度 200，质量扫描范围 50-350 m/z，溶剂延迟 4 min。C8-C21 系列正烷烃均以 1 10-3（V/V）浓度用正己烷溶解，与上述 GC 条件一样进样测定。杨梅叶精油
13、被 GC 分离的各成分用下面的线性升温公式计算其KI18：KI = 100n + 100（ tx-tn ）/（ tn+1 - tn）其中 tx 为测定物质的保留时间，tn 和 tn+1分别为碳原子数相差为 1 的正烷烃的保留时间（tn tx tn+1） 结果用随机所带的美国 NISTLibrary（2002 版）质谱库检索，并与相应标准 KI 值18对比确定，无标准 KI 值的组分只用质谱库检索结果确定。相对含量的确定采用峰面积归一化法。2.3 抗氧化性评价试验2.3.1 DPPH 自由基清除率测定配制浓度分别为 4，8，10，16，24，32 和 50 g L-1 的受试样品甲醇液。分别取
14、200 l 与 4 ml 浓度为 6 10-5M DPPH 甲醇液混合，于 517 nm处测定吸光度，不加样的 DPPH 甲醇液为空白样。平行样为 3 个。自由基清除率按下式计算自由基清除率（%）=（AC（0） AA（t）/ AC（0） 100%其中 AC（0）为 t = 0 h 时的空白样吸光度值;AA（t）为 t= 1 h 时样品吸光度值。82.3.2 -胡萝卜素漂白试验法将 -胡萝卜素（0.1 mg）用氯仿（10 ml）于梨形瓶中溶解，加入亚油酸（20 mg）和吐温 40（100 mg），然后于 50旋转真空干燥。加入 50 ml 含氧蒸馏水，于超声波中形成乳化液 A。取 200 l 浓
15、度分别为 4，8，12，16 和 20 g L-1 的受试样品乙醇液与 5 ml 乳化 A 液于试管中混合，不加样品的用等量乙醇代替与 A 液混合作为空白样。在 50保温，于 470 nm 测定吸光度。抗氧化率用下式计算抗氧化率（%） = （AA（120） AC（120）/（ AC（0） AC（120） 100%其中 AA（120）为 t = 120 min时的样品吸度度，AC（120）为 t = 120 min 时空白样吸光度值，AC（0）为 t = 0 min 时的空白样吸光度值。2.3.3 硫代巴比妥酸法分别取 0.1ml 浓度为 5，25，50 g L-1 的样品甲醇液与 0.5 ml
16、蛋黄乳浊液混合，加入 50 L 的 AAPH 自由基溶液（0.07mol/L）引发脂质过氧化反应。随后即加入 1.5 ml 乙酸溶液（20%）和 1.5 ml 浓度为 0.8%硫代巴比妥酸液用 1.1% （W/V）十二烷基硫酸钠溶液配制，振荡均匀。不加精油样品的为空白样。然后于 95水浴保持 60 min。冷却后，每个试管中加入 5 ml 正丁醇，充分萃取，于 1 200 g 离心 15min。倾出有机层在 532 nm 处测定吸光度值。抗氧化指数用下式计算抗氧化指数（%） =（AC（0） AA（t）/ AC（0） 100%其中 AC（0）为空白样 t = 0 h 吸光度值，AA（t）为样品
17、t = 1 h 吸光度值。2.4 数据处理与统计分析数据处理和统计分析采用 SPSS10.0 软件。相同受试浓度水平下各受试物的抗氧化率之间两两差异显著性分析比较用邓肯氏极差法（P 0.01）。93 结果2.2.1 含量测定方法取本品细粉约 0. 2 g,精密称定，置锥形瓶中，加稀盐酸 10 ml，加热使其溶解，加水 100 ml 与甲基红指示液 1 滴，滴加氢氧化钾试液至溶液显浅黄色，再继续多加 5 ml，加钙黄绿素指示剂少量，用乙二胺四醋酸二钠滴定液（0.05 mol/L）滴定至溶液黄绿色消失，并显橙色。每毫升乙二胺四醋酸二钠滴定液（0.05 mol/L）相当于 8.608 mg 的含水硫
18、酸钙（CaSO4 2H2O）。2.2.2 供试品溶液的制备取北寒水石样品砸碎后用研钵研细，先过五号筛，收集样品，再过 6 号筛，收集样品。样品符合中国药典 凡例 中细粉的规定。取本品细粉约 0.2 g,精密称定，置锥形瓶中，加稀盐酸 10 ml，加热使其溶解，即得。2.2.3 专属性实验按照 2.2.1 项下的方法，在不加入北寒水石样品的情况下进行空白试验。结果表明在不加样品情况下进行滴定，消耗的 EDTA 溶液平均值 0.05 ml，指示剂立即变色。2.2.4 回收率实验采用加样回收法，精密称取已知含量的北寒水石样品 6 份，每份0.1 g。分别精密添加对照品 0.1 g。按照 2.2.2
19、项下制备样品溶液，测定含水硫酸钙10计算平均回收率为 103.95%，RSD 为 2.83%。实验结果表明本方法回收率好。2.2.5 重复性实验精密称取同一批次北寒水石样品 6 份，按照 2.2.1 项下方法测定含水硫酸钙（CaSO4 2H2O）的含量。结果含水硫酸钙（CaSO4 2H2O）的平均含量为97.61%，RSD=0.24%。结果表明，在同一条件下，本方法的重复性较好。2.2.6 中间精密度实验选取了 3 个人使用同一种方法、同一个设备（滴定管、天平等其他仪器），在不同的时间（上午、中午、下午），精密称取同一批次北寒水石样品 3份，按照 2.2.1 项下方法测定含水硫酸钙（CaSO4
20、 2H2O）的含量。取每个人实验结果的平均值进行比较。结果含水硫酸钙（CaSO4 2H2O）的平均含量为 98.80%，RSD=0.19%，结果表明该方法符合中间精密度要求。2.2.7 线性实验精密称取 0.00,0.05,0.10,0.15,0.20,0.25 g 同一批次的北寒水石样品，按照 2.2.2 项下方法制备供试品溶液，测定含水硫酸钙（CaSO4 2H2O）含量，做线性考察实验，以样品称样量为 Y,样品中的含水硫酸钙（CaSO4 2H2O）含量为 X 绘制标准曲线，计算回归方程为：Y=0.989 6 X+0.000 3。结果表明含水硫酸钙（CaSO4 2H2O）含量在0.000 4
21、0.249 8 g 线性关系良好（r=0.999 7）。2.2.8 耐用性实验选取北寒水石样品的细粉，称取 1.199 9 g，加入 60 ml 稀盐酸后定容至 70 ml 制成供试品溶液。分别于 0，1，2，4，8，16 h 后，精密吸取 10 ml 供试品11溶液测定含水硫酸钙（CaSO4 2H2O）含量。测定含水硫酸钙（CaSO4 2H2O）的平均含量为97. 69%，RSD=0.29%，结果表明待测样品在 16h 稳定性良好。2.2.9 样品的测定按照2.2.2 项下方法制备供试品溶液，用上述方法对以下不同批次样品进行含水硫酸钙（CaSO4 2H2O）含量测定。结果见表 1 表 1 北
22、寒水石样品含水硫酸钙（CaSO4 2H2O）的含量测定结果%2.2.10 含量限度的制定根据 6 批样品测定结果，北寒水石主成分含水硫酸钙（CaSO42H2O）含量最高值为 99.82%，最低值为 97.20%，平均值为 98.62%。考虑到不同地区样品收集的差异性，故暂规定北寒水石中含水硫酸钙（CaSO4 2H2O）含量限度定为不得少于 97.0%。3 讨论文献中曾经报道过测定寒水石中的含水硫酸钙（CaSO4 2H2O）的含量5,6，但是没有进行系统的方法学考证。本研究按照参照中国药典（2005 年版）中的 中药质量标准分析方法验证指导原则 2，进行了系统的方法学考证。此外，在供试品溶液制备
23、中对稀盐酸加入量进行了考察。结果是加入 10 ml 稀盐酸试液既能最大限量的溶解样品，又可减少含量测定中氢氧化钾的加入量。稀盐酸加入过少会影响测定结果，加入过多会使测定中氢氧化钾的加入量增加。对北寒水石的取用量进行了考察，结果是取用 0.2g 北寒水石，滴定所用的滴定液的体积在 20 ml 左右，符合消耗滴定液的精度控制范围。12目前对国标、部标及地区标准中成方制剂中有 110 余种成方制剂使用了寒水石，但是没有说明是南寒水石或者北寒水石。由于南寒水石和北寒水石的化学成分不同就造成了药理药效的不同，极大地影响了用药的规范性。随着研究的逐步深入，建议对国标、部标及地区标准中涉及到寒水石的成方制剂
24、进行深入考证，确定所用寒水石是南寒水石还是北寒水石，以便规范用药及提高用药的安全性。【参考文献】1 陈 榆. 寒水石的本草考释J. 中国中药杂志，1989,14（12）:7.2 国家药典委员会. 中华人民共和国药典，部S. 北京：化学工业出版社，2005:63, 附录 25,114.3 中华人民共和国卫生部药典委员会. 中华人民共和国卫生部药品标准 中药材，第册S. 1992:29,66.134 西藏 青海 四川 甘肃 云南 新疆 卫生局. 藏药标准S. 1978:95.5 温雅琴. EDTA 滴定法测定蒙药寒水石中硫酸钙的含量J. 药物分析杂志,1995,1:50.6 张绍琴, 赵忠杰, 郑丽文. 中药寒水石中主要成分的含量测定J. 中药材，1986,4:42.医药卫生栏目14
