1、 （1）涂布法（如右图解）。基本原理是在同一培养基上根据形态变异以鉴别突变型。具体方法包括以下几步： 繁殖。在液体培养基上培养细菌，摇动培养基使细菌裂殖呈几何级数的增加，并通过测OD值使增殖达到对线期。 涂板产生菌落（colony）。在固体基本培养基上滴上菌液，涂布。经过一夜培养，一个细胞经几何级数增生，可达到107个细胞，成为肉眼可见的菌落。菌落具有共同的遗传组成，如果某个细胞突变，菌落也应有所不同，所以可进行鉴定。如引起小鼠肺炎双球菌（Diplococcus pneumoniae）野生的菌落大而光滑，而突变型的则是小而粗糙。 菌落突变鉴定。主要是通过对菌落形状、颜色和大小等方面的观察，以鉴
2、定突变体。 取少量的菌液（菌落） 在液体培养基上培养（繁殖） 稀释 固体培养基培养 涂布均匀 长出新菌落（遗传基础一致） 检查变异 涂布法图解 （2）影印法（图解如右）。 是由Lederbery J和Lederberg EM于1952年设计的，用于在不同培养基上鉴别是否发生生理、营养或抗性突变。生理特性的突变一类为丧失某种营养物质能力的营养缺陷，另一类是抗性的突变，如抗药性或感染性，抗赤霉素。影印法的步骤如下： a. 先在母板（Master plate）上长成菌落。 b. 制作一个印具（比母板略小）。 c. 配制各种特定的营养缺乏培养基。 d. 用印具先在母板上印，把菌落吸附在丝绒上，再把这个
3、印具印到不同成分培养基上。 e. 鉴定是否生长，如不长为此种营养缺陷型。 制作母板 配制各种不同的培养基 用模版影印到不同的培养基上 观察生长情况 影印法图解 二、病毒 特点 只有一个染色体，实际上是DNA或RNA，不含组蛋白，是由蛋白质外壳及其包被的核酸所组成的颗粒，本身无细胞器，所以必须浸染到细胞中才能生活。 分类 一般分为动物病毒、植物病毒和细菌病毒（称为噬菌体（phage）等。三、细菌和病毒在遗传研究中的优越性 1、繁殖快, 世代短。 细菌20分钟一代，病毒一小时可繁殖百个。 2、易管理和化学分析。 一个试管可装很多; 易于获得大的数量用于分析。 3、遗传物质简单, 只含裸露DNA或R
4、NA。适用基因结构和功能研究。 4、便于研究基因突变。首先是单倍体易于表现（隐性和显性都表现）。虽然突变率105, 至少需上百个培养皿，但只要培养基上加所希望突变的抗性物质，就有望短期鉴定出来。 5、便于研究基因的作用。显隐性都表现，可设计各种营养缺陷型，来对应基因的功能。 6、可用作研究高等生物的简单模型。高等生物复杂，可用细菌来代替某种研究。四、细菌和病毒的拟有性过程 有性过程是指遗传物质的交换和交流。由于细菌和病毒无法象高等生物一样进行有性过程，只能通过其他方式实现遗传物质的交换和交流，即拟有性过程。不经过减数分裂和授精作用而导致遗传物质的重组，叫做拟有性过程。 细菌拟有性过程的方式主要
5、有转化和接合。病毒的拟有性过程称为转导。第二节 细菌的遗传分析 一、转化 二、接合一、转化 定义 转化（transformaton）是指某些细菌通过其细胞膜摄取周围供体的染色体片段，并将此外源DNA片段通过重组参入自己的染色体组过程。只有当参入DNA片段产生新的表现型时，才能测知转化的发生。 发现 首先由Griffith（1928）首先在肺炎双球菌中发现，1949年Avery等在分子水平上加以研究，证实了转化因子为DNA。 大部分转化作用是用肺炎双球菌、枯草杆菌和流感嗜血杆菌等完成的。 转化的过程 供体DNA与受体细胞间的最初相互作用 有4个因素影响最初的相互作用 a. 转化片段大小。 肺炎双
6、球菌的成功转化，转化DNA片段至少有800bp，枯草杆菌至少16000bp。 b. 形态。 双链DNA c. 浓度。 对某一个特定的基因来说，供体DNA分子数目与细胞成功的转化之间有一定的相关。一般在转化一定数目DNA之前，两者成正比。如从一个抗链霉素细菌菌株提取DNA转化链霉素敏感的细胞，直到每个细胞含有10个DNA分子之前，抗性转化体的数目一直与DNA分子存在的数目直接成比例。 每个细菌摄取DNA分子数10-12） b. 混合培养A和B菌株。在完全的培养基上培养数小时。 c. 培养物离心，涂布在基本培养基上培养，结果发现长出了一些原养型（met+，bio+，thr+，leu+）的菌落。 疑
7、问 是由于转化还是由于细胞直接接触而发生的遗传物质交换和重组？ U型管实验 1950年Davis设计（如下图） 先在U管底部放入滤片，该滤片可阻止细菌通过，但不影响大分子（DNA）流过。 左管加入A菌株，右管加入B菌株。 左管用棉塞紧，右管加抽进气管。 右管抽进气轮流加压或抽气吸引使左右大分子完全混合。 待两臂细胞在完全培养基中停止生长后，将它们分别涂布在基本培养上，结果都没有出现原养型，说明直接接触是必要条件。 Hayes的试验 Hayes W （1952）实验 A菌株（链霉素处理）B菌株 原养型重组体的数目没有减少 B菌株（链霉素处理）A菌株 没有重组作用发生 说明接合中的遗传物质转移是一
8、种单向过程。 接合的解释（机理） F因子的发现 Hayes和Caraili-sforza（1953）进一步发现：A成为供体，是因为它有一个性因子（sex factor）的致育因子（fertility factor），简称为F因子。 携带F因子的菌株称为供体菌或雄性，用F+表示；没有F因子的菌株称为雌性，用F-表示。 F因子结构与特性 结构 大小：环状, 约为细菌组DNA的2%, 94.5kb 。 基因簇: 含有转移、复制和插入等序列 （如下图）。 特性 F因子由DNA组成，是染色体外的遗传物质，能自主繁殖存在，并可以单独存在细胞质中。F因子有三种存在状态： （1）没有F因子，即F-，没有F因子
9、的细胞称为雌性受体F- 。 （2）包含一个自主状态的F因子，即F+，含有F因子的细胞称为雄性供体F+ 。 （3）包含一个整合到自已染色体组内的F因子，即重组型Hfr（ high frequence recombination，高频率重组）。Hfr使两个菌株数杂交后所产生的重组体频率大大增加（1000倍）。 F因子插入不是随机的，而有许多特定的位点（如下图）。F因子整合到染色体上是可逆过程，即F因子可整合到染色体上，也可从染色体上分离下来，在切除分离中往往发生错误，分离出一个携带F因子和部分染色体基因的遗传因子，这种特殊的F因子称为F因子。 F因子的转移（接合）图10-8 F因子的转移有三种方式
10、：一是含有F+因子细菌向不含F+因子的F-细菌转移，即F+F- ；二是 重组型Hfr细菌向F- 细菌转移，即HfrF 细菌向F- 细菌转移，即FF-。这三种方式的转移过程和特点如下： a、F+F- （a）F+细菌通过纤毛与F-细菌接触并发生相互作用 。 （b）F+细菌出现缺口，双链之一被切断，从断端转移F因子的一条链到F-细菌中。 （c）F因子的一条链一进入F-细菌中，就在F-细菌中复制新的 F因子。 （d）复制完成后， F-细菌变成F+ ，同时原有F+细胞也完成F因子另一条链的复制，所以转移是 F+的拷贝。 所以最终是F-细菌变成F+细菌，而原有的F+细菌则不变。 b、HfrF- 特点是染色
11、体按定向和均匀速度逐渐进入F-细菌，DNA转移是从oriT起始，F因子的主要部份在 最后进入受体。所以大部分F因子并没有进入受体，中途断开，最终F-细菌没有变成F+细菌。 c、FF- 主要作用是构建稳定的部分二倍体的菌，并能高效表达 。 F+、F和F+Hfr菌的比较 Hfr和F+共同特点： a. 用链霉素处理均不影响与受体杂交。 b. 与受体杂交后,出现的重组体中以大多数非选择性性状是F-受体的遗传性状。 c. 均带有F因子特定表型效应性伞毛。 差异之处： a. HfrF -F+F - （高出1000倍） b. F+F- 。最后是F-F+，但供体染色体基因非常低频率地转移 。 Hfr最后F-还
12、是F- ，但部分染色体高频转移。 c. F菌除了有许多与Hfr和F+相同性质外,最大特点是构建部分二倍体菌。 2. 用中断杂交试验作染色体连锁图 设计人 Jacob和wollman（50年代）根据HfrF-是染色体按定向和均匀逐渐进入F-细菌，大部分F因子并没有进入受体，中途断开的原理，设计中断杂交试验，目的证明接合时遗传物质从供体到受体的转移是直线进行的。 中断杂交试验过程 把Hfr菌株与F-菌株混合培养 Hfr：strsa+b+c+d+ F-：sfrra-b-c-d- 其中str为链霉素，s感 r抗性 a+：叠氨化物抗性基因azir a-：对azrs（敏感） b+：对T1噬菌体抗性tonA
13、r b-：对T1敏感（tonAs） c+：半乳糖（galb+）原养型 c-：半乳糖缺陷型 d+：乳糖（lac+）原养型 d-：乳糖缺陷型 培养一定时间取样，把菌液放在食物搅拌器内搅拌，以中断杂交。 稀释接种到含有链霉素培养基上，杀死Hfr 。 对形成菌进行影印培养测试其基因型，确定a、b、c、d每个基因转移到F-细胞时间。结果（图10-11） 9min 开始出现少量Na3N抗性，表明azir已进入F- ； 11min 出现T1抗性，表明tonAr已进入； 18min 出现galb原养型，表明galb+已进入； 24min 出现lac 原养型，表明lac+已进入。 分析 Hfr菌株基因是按一定的
14、线性顺序依次进入F-的，也就是说，染色体从原点开始是以直线方式进入F-细胞的（图10-12），离原点愈近，进入愈早，反是则晚。图10-12 根据中断杂交实验作出的大肠杆菌直线连锁图 单位：分钟，O是原点，F是F因子。不同Hfr菌株的进一步试验 不同Hfr菌株试验作出基因连锁图，基因顺序不相同，见表10-1。表10-1 用中断杂交法确定的几个Hfr菌株的基因顺序 从表10-1可以看出，虽然不同，但有规律性，如所有的his基因都有gal在一边，gly在另一边，其他基因也是如此，除非它们连锁群的另一端。其差异是由于转移的原点不同和方向不同所致（图10-13）。进一步说明F因子和细菌染色体都是环状的。
15、Hfr细胞染色体的形成，则因F因子插入环状染色体的不同位置，因而形成了不同的转移原点和转移方向。 3. 大肠杆菌的环状染色体图 如果2个基因间的转移时间2min的间杂交不可靠，应采用传统的重组作图法。 杂交 Hfr lac+ade + F-lac- ade- lac +乳糖不发酵 ade-胸嘌呤缺陷型 用完全培养基但不加膘嘌呤，可选出F-ade+的菌落 由于lac+ ade-近，两者相继进入时间相距很短，难以准确界定，所以只能根据产物确定。 如果选出ade+同时也选出lac+ ，说明lac- ade 间没有发生过交换；如果是lac-说明发生交换（图10-14） 重组率=lac-ade+/（la
16、c+ ade+）+（lac- ade+）100% =22% 两个位点是的时间单位约为1min，可见1个时间单位（分钟）大约相当于20%的重组值 。 用重组率与中断杂交法测的基因距离大致符合的，根据接合的实验，用中断杂交法基因重组等方法已绘制出大肠杆菌K12环状遗传图（图10-17）。 第三节 噬菌体的遗传分析 一、噬菌体的结构和生活周期 二、噬菌体的基因重组 噬菌体是一种专门侵染细菌的病毒，20世纪初期被发现；40年代被发现在遗传分析上具有重要的作用。一、噬菌体的结构和生活周期 1. 结构 由一个蛋白质外壳和其中包含的核酸组成。 例 大肠杆菌T2噬菌体具有以下的构造： 六角形的头部：内含双链D
17、NA 尾部：中空的针状结构及外鞘（也称尾鞘）， 尾鞘作用是通过收缩将DNA注入宿主细胞。 末端：由基板、尾丝及尾针组成，尾丝起附着作用（图）。 2. 种类 分为烈性噬菌体和温和性噬菌体两大类。 （1）烈性噬菌体 如大肠杆菌的T噬菌体（T1T7）。侵染机理是，噬菌体头部中DNA通过尾鞘收缩注入大肠杆菌细胞中，在其中合成噬菌体DNA和蛋白质，组装新的子噬菌体，使细菌裂解，释放出数百个子噬菌体（如下图）。 （2）温和性噬菌体 如和P1噬菌体。大肠杆菌的T噬菌体，但它们侵入后不使细菌裂解，而是在特定的条件下才使细菌裂解。如有紫外线照射或温度刺激就可原来温和性噬菌体改变成烈性噬菌体，使细菌裂解。 噬菌体
18、侵入后DNA整合到细菌染色体上，P1噬菌体DNA独立存在于细胞质中 。它们共同点是在细菌中DNA不大量复制也不大量转录和翻译，保持一个相对固定的数量。二、噬菌体的基因重组 1. 研究噬菌体的遗传性状 噬菌斑形态：大小、边缘清楚或模糊 举例：正常的T噬菌体r+：噬菌斑小而边缘模糊 T噬菌体突变体r：产生约大两倍的边缘清楚的噬菌斑（速溶性） 宿主范围：能感染和裂解的菌株种类（不同） 举例：正常的T2噬菌体h+：只侵染B菌株 T2噬菌体的突变体h：同时可侵染B株及B/2株* * B/2株是大肠杆菌B株的突变体，它对T2噬菌体有抗性。这种突变体叫宿主范围突变体。2. 噬菌体基因重组值的估算 （1）双重
19、感染（double infection） 双重感染是指用两种噬菌体同时感染某一菌株。下面举例说明。 亲本之一（噬菌体之一）：hr+即能感染B和B/2菌株产生噬菌斑小而边缘模糊，即透明、小噬菌斑。 亲本之二（噬菌体之二）：h+r能感染B株，产生约大两倍的边缘清楚的噬菌斑，即为半透明、大的噬菌斑。 用hr+和h+r两种噬菌体同时感染B株，进行双重感染。在双重感染（相当hr+h+r）的过程中，hr+和h+r相互作用（即基因可以发生交换），所以在其子代中可以得到hr和h+r+的重组体。重组体hr产生透明、大噬菌斑；h+r+为半透明、小的噬菌斑。 （2）重组值的测定 第一步对双重感染杂交子代噬菌体基因型
20、的测定，方法是把子代释放出来的噬菌体接种在同时长有B及B/2株培养上，记录噬菌斑的形态。记录亲型（h+r：半透明，大；hr+：透明，小）和重组型（hr：透明，大；h+r+：半透明，小）的噬菌斑的数值。 第二步计算重组值。 重组值=重组噬菌斑数/总噬菌斑数100% =h+r+hr/h+r+hr+h+r+hr 表10-2 列出 用rxh+r+h所得的四种噬菌斑数及算得的重组值。 表10-2 用rxh+ r+h所得和四种噬菌斑数及算得的重组值（rx代表不同的r基因）杂交组合每 种 基 因 型 的 %重 组 值rh+r+hr+h+rhrah+ r+h34.042.012.024/100=24%rbh+
21、 32.056.05.96.412.3/100.3=12.3%rch+ 39.059.00.70.91.6/99.6=1.6%*:ra、rb、rc分别代表不同速成溶菌突变型（它们表现型不同，所以是不同基因） 第三步写出ra、rb、rc与h三个连锁图。 第四步对基因进行顺序排列。 第五步确定基因顺序。 确定rb、rc和hrcrb+r+crb，重组型=13.9，说明h位于rb及rc之间, 所以顺序为rc-h-rb。至于ra在h哪一边，是靠近rb还是rc，由于T2噬体的基因是环状的，所以列须再进一步确实。三、转导 1. 定义：以噬菌体为媒体所进行的细菌遗传物质重组的过程，称转导。 2. 发现 Led
22、erbery及其研究生Zinder（1951）首先在鼠伤寒沙门氏菌（Salmenella typhimurium）中发现转导现象。 发现过程 他们用苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌和甲硫氨酸、组氨酸营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌共同培养，相当让两种不同缺陷型的菌杂交。杂交过程和结果如下： phe- try- tyr- met- his- （苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸） （甲硫氨酸、组氨酸） 营养缺陷型 营养缺陷型 原养型的菌落（即出现个别正常型的细菌） 那么这些原养型菌落的出现是由接合引起的？ 还是由转化引起的？ 他们先进行U形管实验（方法同本章第二节的），结果是获得原养型的菌株，
23、由此推测可能有一种可通过滤膜的过滤性因子（FA）在起作用。进一步利用DNA酶处理，结果FA不受DNA酶影响，从而消除了转化作用的可能性。最后认为FA是一种噬菌体，发现了转导。3. 转导的机制 转导是在噬菌体包装中因为错误将细菌染色体片段包装进去成为内含细菌染色体片段“假噬菌体”而发生的。具体过程如下： （1）噬菌体侵染细菌。 （2）噬菌体DNA使细菌染色体形成片段，合成噬菌体DNA和外壳。 （3）新噬菌体包装，偶尔将细菌染色体片段也包装进去成为内含细菌染色体片段“假噬菌体”。“假噬菌体”和真噬菌体一起释放出来。 （4）“假噬菌体”和真噬菌体一样可再侵染细菌，其中“假噬菌体”侵染时，就将外来的细菌基因注入，经过基因重组改变遗传性状，完成转导的过程。 目前根据转导的机制，已广泛应用在体外包装“假噬菌体”，即将外源基因导入“假噬菌体”中，再侵染细菌，进行基因表达的研究。 4. 利用普遍性转导测定细菌基因间
