1、植物细胞组织培养的基本技术总结版本章主要内容 商业性组织培养实验室和小工厂的设计与主要设备 培养基及其配制 外植体的选择与培养 试管苗的驯化与移载第一节 商业性组织培养实验室和小工厂的设计与主要设备 培养皿的清洗； 培养基的配制、分装和高压灭菌； 无菌操作材料的表面灭菌和接种； 将培养物放到培养室培养； 试管苗的驯化、移栽和初期管理。(一)、洗涤室(cleaning room) 洗涤室用于完成玻璃器皿等仪器的清洗、干燥和贮存。 室内配备： 大型水槽，最好是白瓷水槽。为防止碰坏玻璃器皿，可铺垫橡胶。上下水道要畅通。 备有塑料筐，用于运输培养器皿。 备有干燥架，用于放置干燥涮净的培养器皿。(二)、
2、准备室(repairing room) 完成培养基制备以及试管苗出瓶、清洗与整理工作。准备室要求明亮、通风。 如果房间较多，可将准备室分为洗涤室和配置室两部分。洗涤室专门负责试管苗出瓶与培养器皿的清洗工作；配置室则负责培养基的配制、分装、包扎和高压灭菌等工作。 (三)、缓冲室 进入无菌室前要在缓冲室里换上经过灭菌的卫生服、拖鞋，戴上口罩。 应当在此室内安装灭菌用的紫外灯。控制无菌室及培养室的配电板等。(四)、无菌操作室(transfering room) 接种室是进行植物材料的分离接种及培养物转移的一个重要操作室。其无菌条件的好坏对组织培养成功与否起重要作用。 配置： 在工作方便的前提下，接种
3、室宜小不宜大，一般7-8m2，要求地面、天花板及四壁尽可能密闭光滑，易于清洁和消毒。配置拉动门，以减少开关门时的空气扰动。 接种室要求干爽安静，清洁明亮。在适当位置吊装1-2盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。最好安装一小型空调，使室温可控，这样可使门窗紧闭，减少与外界空气对流。(五)、培养室(culturing room) 培养室是将接种的材料进行培养生长的场所。培养室的大小可根据需要培养架的大小、数目、及其他附属设备而定。 设计原则： 充分利用空间和节省 能源 高度比培养架略高为 宜 周围墙壁要求有绝热 防火的性能。(五)、培养室(culturing room) 培养架大多由金属制成。 规格：
4、一般设5层，最低一层离地高约10 cm，其他每层间隔30cm左右，培养架即高1.7m左右。培养架长度都是根据日光灯的长度而设计，如采用40W日光灯，则长1.3 m，30 W的长1m，宽度一般为60cm。 培养室最重要的因子是温度，一般保持在20-27左右，具备产热装置，并安装窗式或立式空调机。由于热带植物和寒带植物等不同种类要求不同温度，最好不同种类有不同的培养室。室内湿度也要求恒定，相对湿度以保持在70-80为好，可安装加湿器。 控制日光照时间可安装定时开 关钟，一般需要每天光照10-16h。也有的需要连续照明。现代组培实验室大多设计为采用天然太阳光照作为主要能源，这样不但可以节省能源，而且
5、组培苗接受太阳光生长良好，驯化易成活。(六)、驯化室 驯化室要求清洁无菌，配有空调机、加湿器、恒温恒湿控制仪、喷雾器、光照调节装置、通风口以及必要的杀菌剂。(七)、温室 应配有空调机、通风口、加湿器、恒温恒湿控制装置、喷雾装置、光照调节装置以及必要的杀菌杀虫装置及相应药剂。二、仪器设备和器皿用具 常见仪器设备 1、超净台 2、无菌箱 3、空调机 4、除湿机 5、恒温箱 6、烘箱 7、高压灭菌锅 8、冰箱 9、电子分析天平和托盘天平 10、显微镜及解剖镜 11、水浴锅 12、摇床与转床 13、磁力搅拌器 14、电蒸馏水器 15、酸度计 16、离心机1、超净台和无菌箱 1、超净台，优点是操作方便自
6、如，比较舒适，工作效率高，准备时间短。开机10分钟即可操作，可进行长时间使用。在工厂化生产中，接种工作量很大，需要经常长久地工作时，超净台是很理想的设备。 2、无菌箱，在投资少的情况下，可以用接种箱来代替超净台。接种箱依靠密闭、药剂熏蒸和紫外灯照射来保证内部空间无菌。但操作活动受限制，准备时间长，工作效率低。工作原理 超净台功率在145-260W左右，它装有小型鼓风机，使空气穿过一个前置过滤器，在这里把大部分空气尘埃先过滤掉，然后再使空气穿过一个细致的高效过滤器，它除去了大于03um的尘埃、细菌和真菌孢子等，最后以较洁净的气流吹到工作台面。超净空气的流速为每分钟24-30m，这已足够防止附近空
7、气袭扰而引起的污染，这样的流速也不会妨碍采用酒精灯对器械等的灼烧消毒。在这样的无菌条件下操作，就可以保证无菌材料在转移接种过程中不受污染。 根据风幕形成的方式，超净台可分为水平式和垂直式二种型号。（二）各类玻璃器皿1、培养器皿 2、分注器 3、离心管4、刻度移液管5、细菌过滤器6、实验器皿1、培养器皿 1、培养器皿：在组织培养中配制培养基和进行培养需大量的玻璃器皿。要求由碱性溶解度小的硬质玻璃制成，以保证长期贮存药品及培养的效果；培养用的还要求透光度好，能耐高压高温，能方便放入培养基和培养材料的器皿，根据培养的目的和要求，可以采用不同种类、规格的玻璃器皿。其中以试管、三角瓶、培养皿等使用较多。
8、 最常使用的是 三角瓶 培养皿（9、12cm直径）用于：游离细胞、原生质体、花粉等的静置培养、看护培养、无菌种子的发芽、植物材料的分离等都需采用。 试管（18mmXl80mm或20mmX200mm）用于：培养较高的试管苗。 工厂化生产可采用广口的200ml罐头瓶，加盖半透明的塑料盖，由于瓶口大，所以大量繁殖时操作方便、工作效率高，也减少了培养材料的损伤。但缺点是易引起污染。瓶口封塞 瓶口封塞可用多种方法，要具有一定的通气性和密闭性，以防止培养基干燥和杂菌污染。 以前封口常用棉塞。但这种封口办法夏季极易污染，且不易保持培养基的湿度。现在多采用聚丙烯塑料薄膜作为封口，以线绳结扎或橡皮圈箍扎。为了增
9、加通气性，可在里面衬一层硫酸纸或牛皮纸。这样经济方便，且通气好。也可采用专用的封口膜。5、细菌过滤器 用于除去不能采用湿热灭菌法的液体中的细菌。一般采用0.22um微孔滤膜进行抽滤灭菌。包括滤头，注射器或采用抽滤装置：真空泵、吸滤瓶、滤气玻璃管等。6、实验器皿 在组织培养中配制培养基，贮藏母液，材料的消毒等需要各种化学实验用的玻璃器皿，包括: 100ml、250ml、500ml、1000ml烧杯； l0ml、l00ml、1000ml量筒； l00ml、1000ml试剂瓶(棕色)等等。（三）、器械用具（P13） 1镊子类：尖头和枪形 2剪刀类 3解剖刀 4解剖针 5、接种工具：接种针、接种钩及接
10、种铲（由白金丝或镍丝制成） 6、钻孔器 7、其它：酒精灯，电炉，试管架，搪瓷盘等第二节 培养基及其配置 目的要求： (1)一般掌握培养基的种类、特点； (2)掌握基本培养基的配方； (3)一般掌握培养基的组成成分和适宜的剂量； (4)掌握培养基母液和常用培养基的配制方法和步骤； (5)熟练掌握培养基的灭菌方法； (6)一般掌握培养基的筛选办法。培养基及其配制 培养基的种类 培养基的成分 培养基配制1.培养基的种类 按成分分类: MS,B5,White,NT,KM-8P,N6等。 按状态： 液体，固体。（1）MS培养基（Murashige and Skoog Medium）MS培养基（Muras
11、hige and Skoog Medium） Toshio Murashige, Folke Skoog. A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures. Physiol. Plant. 1962,15:473-497. 植物组织培养中常用的一种培养基。 离子浓度较高，硝酸盐含量较其他培养基高。 器官，花药，细胞，原生质体培养。（2）B5培养基（B5 Medium） Gamborg, O. L.; Miller, R. A.; Ojima, K. Nutrient requiremen
12、ts of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50:151158; 1968.B5培养基（B5 Medium） 铵含量较低 木本植物，十字花科植物（3）White培养基（White Medium） White, P. R. Handbook of plant tissue culture. New York: The Ronald Press Co.; 1943. White, P. R.; Grove, A. R. Proceedings, International Conference on Plant T
13、issue Culture (1963: University Park, PA). Berkeley, CA: McCutchan Pub. Corp.; 1965:553 pp. 无机盐含量低 生根培养（4）NT培养基（NT Medium） 1970 烟草叶肉原生质体培养（5）KM-8培养基（KM-8 Medium） 1974 有机成分复杂，包括所有单糖和维生素，呼吸代谢主要有机酸 原生质体和融合体培养（6）N6培养基（N6 Medium） 1974，朱至清等。 成分简单，KNO3和（NH4）2SO4含量高 小麦，水稻及其他植物花药培养和组织培养2.培养基的成分 水 无机营养成分 有机营养
14、成分 植物生长调节剂 附加成分（1）水 培养基的主要组分 水是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒，是生命活动过程中不可缺少的物质。 配制培养基母液时要用蒸馏水，以保持母液及培养基成分的精确性，防止储藏过程发霉变质。大规模生产时可用自来水。（2）无机营养组分 作用 满足植物对各矿质元素的需求。 大量元素，6种 微量元素，7种 非必须元素，6种铁采用螯合铁，FeSO4加EDTA（3）有机营养成分 碳源 蔗糖 维生素类 硫胺素（B1），烟酸（B3），吡哆醇（B6），泛酸钙（B5），肌醇。 氨基酸 蛋白质组成成分，促进细胞生长。 其他有机附加物 椰子汁，酵母提取物，马铃薯，水解酪蛋白等。可以促进组织生长。 椰子汁 椰子的液体胚乳。它是使用最多、效果最大的一种天然复合物。一般使用浓度在10%-20%。它在愈伤组织和细胞培养中有促进作用。 马铃薯 去掉皮和芽后，加水煮30分钟，再经过过滤，取其滤液使用。对PH值缓冲作用大。添加后可得到健壮的植株。 其他 酵母提取物，香蕉，水解酪蛋白等。（4）植物生长调节物质 生长素 细胞分裂素 赤霉素 乙烯生长素赤霉素细胞分裂素脱落酸乙烯 -植物激素“五兄弟” 生长素（auxin）的发现 向光性：在单侧光的照射下，植物朝向光源方
