1、生理指标测定方案一 氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物歧化酶（SOD）活力一、原理超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶，它催化下列反应： 2O2-+ 2H H2O2+O2 。本反应产物H2O2可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。 本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除超氧阴离子自
2、由基，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。 （一个酶活单位定义为将NBT的还原抑制到对照的一半（50%）时所需的酶量。）二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料 水稻或小麦叶片。 （二）仪器设备 高速冷冻离心机，紫外分光光度计，日光灯（反应试管处照度为4000lx），试管数支。 （三）试剂（1）0.05mol/L（pH7.8）磷酸缓冲液 (PBS)。配制方法：母液A（0.2mol/L Na2HPO4）:称取71.64g Na2HPO412H2O,用蒸馏水定容至1000ml 。(配置溶液时需要用磁力搅拌器搅拌才能溶解。)
3、母液B(0.2mol/L NaH2PO4)：称取31.21g NaH2PO42H2O,用蒸馏水定容至1000ml 。配0.05mol/L（pH7.8）磷酸缓冲液：取91.5mlA母液+8.5mlB母液+蒸馏水定容到400ml （2）提取介质0.05mol/L（pH7.8）磷酸缓冲液，内含1%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）:称取1g PVP用0.05mol/L（pH7.8）磷酸缓冲液 (PBS)定容到100ml （3）130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml。（4）750mol/L氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，
4、避光保存（5）100mol/LEDTA-Na2溶液：称取0.03721g EDTA-Na2，用磷酸缓冲液定容至1000ml。（6）20 mol/L核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml，避光保存。随用随配，并稀释10倍。（或直接称取0.0075 g 核黄素，然后定容至1000ml。）三、实验步骤 1、酶液提取取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.25 g于预冷的研钵中，加1 ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5 ml。取5 ml于4000r/min下离心15min，上清液即为SOD粗提液。2、显色反应取透明度好、质地相同的15mm150mm试
5、管4支，2支为测定管，另2支为对照管。按下表加入各种溶液：（测定时按表格中各溶液的量加倍，以便于重复测定两次。）显色反应试剂配制表试剂名称用量（ml）终浓度（比色时）0.05mol/L磷酸缓冲液 (PBS)130mmol/L甲硫氨酸（Met）750mol/L氮蓝四唑溶液100mol/LEDTA-Na2溶液20 mol/L核黄素溶液酶液蒸馏水总体积1.50.30.30.30.30.100.53.313mmol75mol10mol2.0mol对照2支管以缓冲液代替混匀后将1支对照管用双层黑色塑料袋套上遮光置暗处，其他各管于4000 lx日光下反应20min30min（要求各管受光情况一致，反应温度
6、控制在2535之间，视酶活性高低适当调整反应时间，温度高，时间缩短，低时延长）。3、SOD活性测定与计算至反应结束后，用黑布罩上试管，终止反应。以遮光的对照管作空白，分别在560nm波长下测定其他各管的吸光度。四、结果计算已知SOD活性单位以抑制NBT光还原的50为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。SOD总活性（A0-As）VT/(A00.5FWV1)式中：SOD总活性以酶单位每克鲜重表示；A0为照光对照管的吸光度；As为样品管的吸光度；VT为样品液总体积ml;（5 ml）V1为测定时样品用量ml；(0.1 ml)FW为样品鲜重g。(0.25 g)二 过氧化氢酶（CAT）的的活性测定紫
7、外吸收法一、原理H2O2在240nm波长下有强吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度（A240）随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。二、仪器与用具紫外分光光度计、高速冷冻离心机、研钵、10ml试管数支、移液枪。三、试剂及其配制（1）提取液50mmol/L(PH 7.0)的磷酸缓冲液（不含PVP）：取61ml A母液+39ml B母液+蒸馏水定容到400ml 。（母液之前配好）（2）0.3% H2O2 ：吸取0.5ml 30% H2O2用50mmol/L(PH 7.0)的磷酸缓冲液（PBS）定容至50ml 。四、方法1、酶液提取称取小麦叶片0.2 g，按
8、(m/V)1:5加入预冷提取液(50mmol/L，PH 7.0的磷酸缓冲液)冰浴研磨成匀浆(研磨加1 ml，洗研钵再加1ml,共2ml提取液)，转移到离心管中，并用缓冲液冲洗研钵。在4 ，10000 r/min 下离心15min 。上清液即为过氧化氢酶粗提液，取部分上清液经适当稀释后用于酶活性测定。2、CAT活性测定在3ml 反应体系中包括：0.3% H2O2 ： 1ml 蒸馏水： 1.95ml最后加入酶液：0.05 ml (对照加入0.05ml缓冲液代替，调零)在240nm波长下测定吸光度，每隔30 s读数一次，共测4 min 。3、结果计算 (酶活性单位为：U/(gmin ) )U：酶活单
9、位（将每分钟OD减少0.01定义为1个活力单位）A240:反应时间内吸光度变化；t：为反应时间（min）；(4 min)VT:提取酶液的总体积（ml）；(2 ml)VS:测定时取用酶液体积（ml）.(0.05 ml)三 抗坏血酸过氧化物酶（AsAPOD）活性测定一、原理AsAPOD催化AsA与H2O2反应，使AsA氧化成单脱氢抗坏血酸（MDAsA）。随着AsA被氧化，溶液的OD290值下降，根据单位时间内OD290减少值，计算AsAPOD活性。【AsA氧化量按消光系数2.8（mmolL-1）cm-1计算，酶活性可用每克鲜重每小时氧化AsA的微摩尔数（molg-1h-1）表示。】二、仪器高速冷冻
10、离心机、紫外分光光度计、研钵、试管。三、试剂及配置（1）50mmol/L(PH 7.0)的磷酸缓冲液（PBS）：取61ml A母液+39ml B母液+蒸馏水定容到400ml 。（母液之前配好）（2）提取液50mmol/L(PH 7.0)的磷酸缓冲液，含2mmol/LAsA和0.1mmol/L EDTANa2 。配置方法：取61ml A母液+39ml B母液+蒸馏水定容到400ml；称取0.1409g的AsA溶到PBS中；称取0.0148896g 的EDTANa2溶到PBS中。（3）0.3mmol/L的AsA溶液：（配100ml）配置方法：A法：直接称取0.052839g的AsA，用50mmol
11、/L(PH 7.0)的磷酸缓冲液定容到100ml 。B法：先配置0.3mol/L的AsA母液：称取5.2839g的AsA配置1L的母液。取1ml 0.3mol/L的AsA母液用50mmol/L(PH 7.0)的PBS定容到100ml 。（4）0.2% H2O2 ：用移液抢吸取667l的30% H2O2用50mmol/L(PH 7.0)的PBS定容到100ml 。（AsA的相对分子质量为：176.13 ；EDTANa2的相对分子质量为：372.24）四、方法步骤1、酶液的提取称取0.5g叶片，按1:5加入预冷的提取液，在冰浴中研磨后，在4500r/min下离心15min，上清液为粗酶提取液。(研
12、磨时加2.5ml，洗钵再加2.5ml,提取液共5ml.)2、酶活性测定反应体系如下：50mmol/L(PH 7.0)的PBS ：1.8ml ；0.3mmol/L的AsA溶液：100l ；粗酶提取液：100l ； （对照加提取液代替，调零） 0.2% H2O2 ： 1ml ；加入后立即在290nm波长下测定4min内OD290值的变化，计算酶活性。3、结果计算 (酶活性单位为：U/(gmin) )U：酶活单位（将每分钟OD减少0.01定义为1个活力单位）A290:反应时间内吸光度变化；t：为反应时间（min）；(4 min)VT:提取酶液的总体积（ml）；(5 ml)VS:测定时取用酶液体积（m
13、l）.(0.1 ml)四 植物组织中丙二醛含量的测定一、原理丙二醛（MDA）是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温条件下，可以和硫代巴比妥酸（TBA）反应生成红棕色的三甲川（3，5,5-三甲基恶唑-2,4-二酮），其最大吸收波长在532nm。但是测定植物组织中MDA时受到多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm, 但532 nm 处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中MDA-TBA反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。低浓度的铁离子能够显著增加TBA与蔗糖活MDA显色反应物在532、450 nm处得消光度
14、值，所以在蔗糖、MDA、与TBA显色反应中需一定量的铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为每克千重100300ugg-1,根据植物样品量和提取液的体积，加入Fe3+的终浓度为0.5umolL-1.1. 直线回归法 MDA与TBA显色反应产物在450nm波长下的消光度值为零。不同浓度的蔗糖（025mmol.L-1）与TBA显色反应物在450nm的消光度值与532nm和600nm处的消光度值之差成正相关，配制以系列浓度的蔗糖与TBA显色反应后，测定上述三个波长的消光度值，求其直线方程，可求得糖分在532nm处得消光度值。UV-120型紫外可见分光光度计的直线方程为： Y532=-0.00198+0.
15、088D450 (44-1)2. 双组分光光度计法 据朗伯比尔定律：D=kCL,当液层厚度为1cm时，k=D/C， k称为该物质的比吸收系数。当某一溶液中有数种吸光物质时，某一波长下的消光度值等于此混合液在该波长下各显色物质的消光度之和。已知蔗糖与TBA显色反应物质在450nm和532nm波长下的比吸收系数分别为85.40和7.40。MDA在450nm波长下无吸收，故该波长的比吸收系数为0,532nm波长下的比吸收系数为155，根据双组分分光度计法建立方程组，求解方程得计算公式： C1=11.71D 450 (44-2) C2=6.45(D532-D600)-0.56D 450 (44-3)式
16、中C1-可溶性糖的浓度（mmol.L-1）; C2-MDA的浓度（umol.L-1）; D450、D532、D600分别代表450、532和600nm波长下的消光度值。二、仪器设备紫外可见分光光度计1台；离心机1台；电子天平1台；10ml离心管4支；研钵2套；试管4支；刻度吸管：10 ml1支，2ml 1支；剪刀1把。三、试剂及其配制（1）10三氯乙酸（TCA）：称取100g TCA加蒸馏水定容至1000ml 。（2）0.6硫代巴比妥酸(TBA)：称取0.6gTBA，先加少量的氢氧化钠（1mol.L-1）溶解，在用10的三氯乙酸定容。四、方法1. 试验材料 受干旱、高温、低温等逆境胁迫的植物叶
17、片或衰老的植物器官。2. MDA的提取 称取剪碎的试材0.5g，加入1ml10TCA和少量的石英砂，研磨至匀浆，再加4mlTCA进一步研磨，匀浆在4000r.min-1离心10min，上清液为样品提取液。3. 显色反应和测定 吸取离心的上清液2 ml(对照加2ml蒸馏水)，加入2ml0.6TBA溶液，混匀物于沸水浴上反应15min，迅速冷却后再离心。取上清液测定532、600和450nm波长下的消光度。4. 计算含量（1） 直线方程 按公式44-1求出样品中糖分在532nm处得消光度值Y532，用实测532nm的消光度值减去600nm非特异吸收的消光度值再减去Y532,其差值为样品中MDA-T
18、BA反应产物在532nm的消光度值。按MDA在532nm处得毫摩尔消光系数为155换算求出提取液中MDA浓度。（2） 双组分分光光度法 按公式44-3可直接求得植物样品提取液中MDA的浓度。用上述任一方法求得MDA的浓度，根据植物组织恶重量计算测定样品中MDA的含量：MDA含量（umol.g-1）=MDA浓度（ umol.L-1）提取液体积（ml）/植物组织鲜重（g）（44-4） 五植物体内游离脯氨酸含量的测定一、原理采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸不仅大大减少了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态（干或鲜样）限制。在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮发生反应生成稳定的红色缩合物，用甲苯
19、萃取后，此缩合物在波长520nm处有一个最大吸收峰。脯氨酸浓度的高低在一定范围内与其消光度成正比。二、仪器与用具紫外分光光度计，水浴锅，20ml大试管数支，不同量程的移液枪三、试剂1 3%磺基水杨酸水溶液: 称3g磺基水杨酸用蒸馏水定容至100ml 。2 甲苯3 2.5%酸性茚三酮显色液：冰乙酸和6mol/L磷酸以3:2混合，作为溶剂进行配制。此液在在4下2-3天有效。配置方法：A： 6mol/L磷酸的配置：取173.95ml 85%H3PO4定容到500ml 。（85%H3PO4密度为1.69g/L，相对分子质量为98g ）B： 称取2.5g茚三酮，用上述方法配置100ml 显色液。脯氨酸标
20、准溶液：准确称取0.025g脯氨酸，用蒸馏水定容至250ml，其浓度为100ug/ml，再取此液10ml，用蒸馏水稀释至100ml，即成10g/ml酸标准液。(现配现先用)四、方法1.标准曲线绘制（1）取7支具塞刻度试管按表加入各试剂。混匀后加玻璃球塞，在沸水中加热40min 。各试管中试剂加入量管号0123456标准脯氨酸量（ml）H2O(ml)冰乙酸（ml）显色液(ml)脯氨酸含量（g）02.02300.21.82320.41.62340.81.22381.20.823121.60.423162.002320（2）取出冷却后向各管加入5ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层吸取甲苯层
21、。以0号管为对照，在波长520nm下比色。（3）以消光值为纵坐标，脯氨酸含量为横坐标，绘制标准曲线。2.样品测定（1）脯氨酸提取取不同处理的剪碎小麦叶片0.2g，分别置于大试管，加入5ml3%磺基水杨酸水溶液,管口加玻璃球塞，在沸水中加热10min.（2）取出试管待冷却至室温后，吸取上清液2ml。加2ml冰乙酸和3ml显色液，于沸水浴中加热40min,下步操作按标准曲线制作方法进行甲苯萃取和比色。（3）结果计算：从标准曲线查出测定液中脯氨酸浓度，按下式计算样品中脯氨酸含量的百分数。脯氨酸ug/g(干或鲜样) =（cva）w式中：c-提取液中脯氨酸浓度（g）标准曲线求得 v-提取液总体积（ml）；（5ml）a-测定时所吸取的体积（ml）；(2ml)w-样品重（g）。(0.2g)
