1、复习总结分子生物学复习总结基本概念分子生物学：在分子水平上研究基因及其活动，包括转录，翻译，DNA复制，重组和易位等。中心法则central dogma：遗传信息从DNA通过转录流向RNA，RNA通过翻译指导合成蛋白质，这种遗传信息的传递规律称之中心法则。少数RNA也是遗传信息的贮存者，RNA能逆转录为DNA，是对中心法则的补充。遗传密码genetic code：DNA(或RNA)三联体与蛋白质中氨基酸的对应关系。 密码子的兼并性degeneracy：由多种密码编码一种氨基酸的现象称为简并性。决定同一种氨基酸密码子的头两个碱基是相同的,第三位碱基不同,第三位碱基发生点突变时仍可翻译出正常的氨基
2、酸。变性 denature 指双螺旋间氢键断裂，双螺旋解开，形成单链无规则线团，因而发生性质改变（如粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加等）。复性 renature 变性DNA只要消除变性条件，二条互补链还可以重新结合，恢复原来的双螺旋结构，这一过程称为复性。增色效应(hyperchromicity )：DNA变性发生在一个狭窄的范围内，在变性过程中，DNA在260nm的吸收值先是缓慢上升，到达某一温度后骤然上升，这个现象称为增色效应。核苷酸 nucleotide 戊糖 碱基 磷酸，DNA RNA核苷nucleoside 戊糖与碱基复制子 replicon DNA的能独立复制的单位，
3、包括复制原点和其它的结构基因。复制叉Replication fork 复制起始点呈现一叉形(或Y形)，称为复制叉，随复制进行，复制叉向前移动。端粒酶（telomerase） 能使端粒延伸，是一种含RNA的蛋白复合体。端粒酶实际上是一种逆转录酶。它催化互补于RNA模板的DNA片段的合成。逆转录酶reverse transcriptase RNA指导的DNA聚合酶（RNA directed DNA polymerase），以RNA为模板指导DNA合成冈崎片段（Okazaki fragment） 在不连续合成中形成的短DNA片段称为冈崎片段。滞后链（lagging strand） 链的合成是不连续进
4、行的。修复系统 repair system 包括五种：直接修复，错配修复，切除修复，重组修复，SOS修复直接修复：光裂合酶，O6-甲基鸟嘌呤甲基转移酶错义突变missense mutation 碱基序列的改变引起了产物氨基酸序列的改变。无义突变 nonsense mutation 某个碱基的改变使代表某种氨基酸的密码子变为蛋白质合成的终止密码子，导致肽链合成过早终止增变基因Mutator genes 这些基因的突变可以大大提高整个基因组其它基因的突变率回复突变back mutation，reverse mutation 由单个碱基改变所造成的突变是可逆的，它可以恢复原来的碱基排列，这种碱基逆向
5、改变叫编码链（有义链）Coding strand or sense strand：DNA双链上不用作转录模板的那一条单链,因其碱基序列除由T代替U而外,其他与转录产物mRNA序列相同而得名。又称正链反义链（antisense strand）模板链（template strand） DNA双链上用作转录模板的那一条单链顺反子Cistron 遗传的功能单位称为顺反子单顺反子monocistron：真核细胞一般以一个基因为转录单位，转录产物是单顺反子、即编码一种多肽的mRNA。一条mRNA分子编码几条不同的多肽链，这种mRNA称为多顺反子mRNA（polycistronic mRNA）转录 tran
6、scriptionRNA的合成是以DNA为模板，按照碱基互补原则形成一条新核糖核酸链，这个过程称为转录翻译（Translation）生物体内将贮存在mRNA碱基序列中的遗传信息转变成多肽氨基酸序列的过程分子伴侣molecular chaperone 一类在细胞内帮助新生肽链正确组装，成为成熟蛋白质，而本身却不是最终功能蛋白质分子的组成成分的分子，称为分子伴侣启动子Promoter： 位于转录起始位点附近启动转录所必需的序列，结合RNA 聚合酶并起始转录转录因子Transcriptional factors：识别并结合在启动子序列上的蛋白因子 general factors 基本 upstrea
7、m factors 上游 inducible factors 可诱导RNA 聚合酶 polymerases （DNA-dependent RNA polymerases）：使用DNA作为模板合成RNA的酶(正式应为DNA-依赖性RNA 聚合酶)。 与逆转录酶相反。SD序列原核生物mRNA与核糖体的识别信号是S-D序列（Shine-Dalgarno序列），在mRNA起始密码子AUG上游方向413核苷酸之前有一段富含嘌呤的序列，其保守序列为5-AGGAGG-3，这一序列叫S-D序列，能够与16SrRNA 3端的富含嘧啶的序列互补结合，正好使30S亚基上的部分P位对准起始密码子AUG以便携带甲酰甲硫
8、氨酸的起始tRNA进入P位。 转基因动物用实验的方法，有目的地把外源基因（包括人的基因）导入动物体内。外源基因与动物本身基因整合后，它就能随着动物细胞的分裂而增殖，并稳定地转给后代。克隆动物限制性内切酶 restriction enzyme 识别DNA内部特异性短序列，切断双链基因工程：根据人们的意愿，利用工程设计的方法，在体外将克隆获得的目的基因与适当的载体进行切割和连接，构建成正确的重组表达载体，再应用物理的、化学的或生物学的方法将该表达载体导入到细菌、动植物细胞或受精卵中，使目的基因在宿主体内以瞬时方式或稳定方式进行表达，借此研究目的基因的结构与功能，或获得该基因的表达产物。这就是基因工
9、程。 顺式作用元件（Cis-acting sequences）：真核生物的DNA调控元件称为顺式作用元件，是指DNA上的一段序列，它只能作用于同一条DNA，故称为顺式作用元件。包括启动子，增强子和沉默子。它们通过DNA和蛋白质、蛋白质和蛋白质的相互作用，最终改变RNA聚合酶的活性而调节转录反式作用因子trans-acting element影响基因转录的调节蛋白，包括基本转录因子和特异转录因子，基本转录因子与RNA聚合酶构成转录起始复合物，称为RNA聚合酶的亚基。特异转录因子包括转录激活因子和转录抑制因子，前者与增强子结合增强基因转录，后者与沉默子结合抑制基因转录。 剪接splicing：指m
10、RNA前体在snRNP(核内小核糖核蛋白)等因子的作用下切除生成成熟mRNA的过程。scRNA 原生质内小RNA一个基因的外显子和内含子都转录在一条原初转录本RNA分子中，然后把内含子切除，把外显子连接起来，才能产生成熟的RNA分子。这个过程就叫剪接体（spliceosome）：由snRNA（核内小RNA）和蛋白质组成的核蛋白复合物。其功能是结合内含子两端的边界序列,协助RNA的剪接加工。 可变剪接（altermative splicing）有些基因产生的mRNA前体可按不同的方式剪接，产生出两种或更多种mRNA，这种方式RNA编辑RNA editing遗传信息在mRNA水平上改变的过程。细胞
11、周期Cell cycle：从上一次有丝分裂结束至下一次有丝分裂结束。从上一次有丝分裂结束至下一次有丝分裂开始被称作分裂间期。实际的分裂时期称为M 期，它对应着可见的有丝分裂。 PCR：PCR技术是利用与目标基因片段的两侧序列相互补的寡核苷酸为引物,在DNA聚合酶的作用下经引物与相互补的目标片段序列的热变性、再结合、延伸等程序的反复进行,使目标基因片段大量扩增,在短时间内可以得到起始量的几百万倍。又叫聚合酶链式反应。PCR技术具有快速、灵敏的特点。操纵子Operon：细菌基因表达和调控的单位，一个或几个结构基因与一个调节基因和一个操纵基因组成一个操纵子。调节基因编码调节蛋白，调节蛋白与操纵基因结
12、合，从而调控结构基因的表达。Southern blot：指将变性DNA从琼脂糖凝胶转移到硝酸纤维膜从而与互补核酸杂交的过程。Western blot：将蛋白质从电泳凝胶中转移并结合到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射同位素标记的特定蛋白质之抗体进行反应，以检测特异蛋白的这种技术叫做Western蛋白质杂交技术 Dot blotmRNA差异显示法(mRNA differential display)或称差异显示逆转录PCR(differential display reverse ranscription PCR，DD-RT-PCR)首先提取组织标本的mRNA，然后以3端的12对锚定引物进行逆转录反应
13、；以锚定引物和5端的20种随机引物进行PCR扩增，并在反应体系中加入同位素标记的 d-ATP探针；PCR扩增产物电泳分析后回收差异条带，再以之为模板进行第二轮扩增；对第二轮扩增产物进行杂交鉴定、测序，获得差异显示表达序列标签（expression sequence tag，EST）。C-值矛盾 C-value paradox：生物进化地位和复杂性不能解释某些生物种类之间基因组大小差异的现象。核小体：染色质的基本结构亚单位，核小体有一个特征性DNA 长度，通常是200bp，卷绕在由组蛋白H2A、H2B、H3、H4各两分子所组成的八聚体上。每个核小体结合一个H1组蛋白。组蛋白H2A 和H2B被组装
14、成H2A*H2B二聚体。两个H2A*H2B 二聚体成功地加在H3*H4核心上形成八聚体。 堆积比（压缩比） packing ratioDNA长度与压缩体长度的比值。核糖体ribosome合成蛋白质的场所，由核糖体RNA和具有各种功能的大量蛋白质的核糖核蛋白颗粒。mRNA DNA模板链上的碱基序列，转录为RNA分子上的碱基序列tRNAtRNA是传递氨基酸的RNA，成熟的tRNA二级结构常常形成三叶草结构（cloverleaf），三级结构倒L形。氨基酸活化：指氨基酸由氨酰-tRNA合成酶在ATP存在的情况下催化生成氨酰-tRNA的过程。在细胞质内进行。核酶ribozyme ：某些RNA分子本身具有
15、自我催化能力，可以完成rRNA的剪接。这种具有催化作用的RNA被称为核酶。编码蛋白质的基因：持家基因(Housekeeping genes)：是那些(理论上)在所有细胞中都表达的基因，因为其功能对任何细胞型都是必要的。奢侈基因(Luxury genes)：在特别细胞类型中通常大量表达并编码特殊功能产物的基因。结构基因 (structural gene)编码细胞必需的蛋白，如酶和结构蛋白的基因，b.隔裂基因(split gene) 指一个结构基因内部有一个或更多的不翻译的编码顺序，如内含子(intron)所隔裂的现象。c. 基因家族Gene family：真核生物的基因组中有许多来源相同，结构相
16、似，功能相关的基因，这样一组基因称为基因家族。基因组Genome 一个生物体中包含的全部DNA序列，包括核内，细胞器DNA。转录组transcription 细胞，组织或器官中的一整套mRNA，也包括不编码蛋白的RNA。蛋白质组 protome 由一个完整的基因组表达的一整套蛋白质。数量可能大于基因组，有些基因可编码多个蛋白质假基因(pseudogene) 由原始活性基因突变引起的基因组中稳定但不活泼的成分。拓扑异构酶topoisomerase：通过切断并连接DNA双链中的一股或双股，改变DNA分子拓扑构象，避免DNA分子打结、缠绕、连环，在复制的全程中都起作用，催化形成不同的超螺旋。其种类有
17、：拓扑异构酶I能切断DNA双链中一股并再连接断端，反应不需ATP供能（转录）；拓扑异构酶II能使DNA双链同时发生断裂和再连接，需ATP供能，并使DNA分子进入负超螺旋。卫星DNA Satellite DNA生物核基因组的CsCl密度梯度离心结果常常显示，在浮力密度处有一条DNA的主带，同时在主带的两侧往往有一条或几条次要的DNA带，它们的浮力密度或者比主带高或者比主带低，于是被看作是庞大基因组DNA的卫星，故称为卫星DNA。内含子 intron ：可以被转录成RNA的DNA片断，但是在剪接过程中被剪切掉，因此内含子一般不编码蛋白质。发现两个编码外显子（exon）在成熟RNA中重复出现的所有割
18、裂基因片断。并不是都编码，有些部分编码内含子变化大（数量大小，较后者长），外显子保守。共翻译转位cotranslation由与粗糙内质网结合的核糖体合成的蛋白质前体，在其N端含有一个信号序列，它使新生肽链在合成过程中（即共翻译）插入到内质网膜上的特殊通道，然后转移入其内腔。在切去信号肽后，蛋白质可以停留在内质网腔内，或进一步通过高尔基体转移至溶酶体，或分泌小泡，然后分泌出去。蛋白质停留在某一给定位置是受分子上的信号肽控制的，它防止蛋白质进一步的运送。衰减子（attenuator）在合成代谢的操纵子的前导区内，存在着类似终止子结构的一段DNA序列，该序列可以辅助阻遏作用，进行转录调控。由一个特征
19、的RNA发夹环组成，随后为8个尿嘧啶残基。基因文库gene library，gene bank采用物理方法(剪切或超声波)或限制性内切酶将染色体DNA切割成许多片段，继而将它们与适当克隆载体结合，将重组DNA转入受体菌中扩增，每个细菌内都携带一种重组DNA分子的多个拷贝。全部细菌所携带的各种染色体DNA片段就涵盖了基因组全部信息，即基因文库。核酸探针指一段用放射性核素或其他标记物（如酶与荧光素等）标记的与目的基因互补的DNA片段或单链DNA和RNA。蛋白质工程根据蛋白质的精细结构与功能之间的关系，利用基因工程的手段，按照人类自身的需要，定向地改造天然的蛋白质，甚至创造新的、自然界本不存在的、具
20、有优良特性的蛋白质分子read-through一些特殊的辅助因子使酶通过终止序列时仍起作用继续转录，这种现象称为 氨基酸活化不仅仅是一个携带氨基酸的过程。其重要意义在于： （1）为肽键的形成提供能量； （2）tRNA上的反密码子与mRNA上的密码子识别，执行遗传信息的解读过程； （3）保证了蛋白质合成的准确性。 反义RNA Antisense RNA一种RNA通过互补的碱基与特定的mRNA结合。结合位点通常是mRNA上的S-D序列，起始密码子和部分N端的密码子，从而抑制该mRNA的加工与翻译,是原核细胞中基因表达的调控的一种方式。 或称干扰mRNA的互补RNA, (micRNA，mRNA-in
21、terfering complementary RNA).反义RNA作用1）调控翻译的起始；2）调控mRNA的稳定性；3）调控转录的终止。反义RNA技术的基本原理及应用导入目的基因反义RNA, 关闭基因表达，研究靶基因功能。将可合成目的基因的反义RNA基因导入大肠杆菌，可表达合成与mRNA互补的反义RNA。可调控目的基因的表达。可应用于病毒性疾病，品种改良，分子病基因治疗等。但还未实际应用。还需要进一步研究。Dhfr 加压筛选机制A. 在用MTX加压筛选的初期，细胞大部分或全部是不稳定的；B. dhfr基因的单细胞拷贝数的变化范围为40400，随着加压程度的提高，拷贝数逐渐增加（可达1000个
22、），对MTX的耐受力也相应提高；C. dhfr基因的长度为31kb，但被扩增的DNA长度可达5001 000kb；D. 当MTX压力解除后，dhfr基因将逐渐减少；E. 当与dhfr基因相连的外源DNA导入细胞后，有整合到内源dhfr基因位点的趋势。双小染色体，可自由复制，但无着丝点，常丢失。可变剪接方式：1）选用不同的启动子：当用不同的启动子进行转录时，产生的初始转录物是不同的。如鸡血红蛋白基因。 （2）选用不同的加尾位点：许多基因的初始转录物有多个加尾位点。选用不同的加尾位点可产生出不同的蛋白质。 3）选用不同的剪接位点：如SV40的T和t抗原是由同一基因用这种方式产生出来的两种蛋白质。
23、4）上述二者（2）+（3）兼有，如降钙素基因转录产物的剪接方式。意义：在于可使一个基因表达出多种蛋白质，即扩大了DNA中遗传信息的含量。如何高效表达外源基因？1.什么是分子生物学？简述基因工程的形成和发展史。分子生物学：是在分子水平上研究基因及其活动，包括转录，翻译，DNA复制，重组和转位等。基因工程发展史：1871 Friedrich Miescher The Discovery of DNA1910 Thomas Hunt Morgan The Chromosome Theory of Inheritance1927 Muller Genetic Damage is Inheritable
24、1928 Griffith Transformation Discovered 1941 Beadle and Tatum one-gene-one enzyme1944 Avery Identified DNA as the material genes are made of1943 Luria and Delbruck Random Mutations1949 Erwin Chargaff Chargaffs rulers1950 Barbara McClintock Transposons1952 Chase &Hershey Proof that DNA is the molecul
25、e of heredity1953 Watson&Crick Determined the structure of DNA1954 Crick Central dogma 1958 Meselson and Stahl DNA Replication Mechanism1960 Jacob and Monod Lac Operon 乳糖操纵子1966 Nirenberg and Khorana Finished unraveling the genetic code1970 Smith and Wilcox Restriction Enzymes 1970 Temin and Baltimo
26、re Reverse Transcriptase1977 Gilbert and Sanger DNA Sequencing 1977 Chow and Roberts Introns 1988 Mullis PCR1996 Yeast Genome Sequenced1999 First human chromosome sequenced2000 Human genome draft completed3.如何用实验方法证实DNA是遗传物质？遗传物质这种特殊的分子必须具备以下基本特点：a.稳定地含有关于有机体细胞结构，功能，发育和繁殖的各种信息 b.能精确地复制，这样后代细胞才能具有和亲代
27、细胞相同的信息c.能够变异，通过突变和重组生物才能发生改变，适应和进化在1952 年，Hershey和Chase用放射性标记T2噬菌体，感染细菌(32P 标记DNA，35S标记蛋白质)。感染后的细菌在搅拌器中破碎，通过离心分离到两种成分。一种是从细菌表面释放的空噬菌体外壳，它们由蛋白质组成，因此有35S的放射性标记。另一中成分是被感染细胞本身。大多数32P 标记出现在被感染细胞内。感染后产生的子代噬菌体中30%带有32P 标记。子代仅含有很少(不足1%)的原噬菌体蛋白质。该试验直接表明父代噬菌体的DNA进入到细菌中，变成了子代噬菌体的一部分，恰好符合是遗传物质的遗传特性。噬菌体的复制依赖于命令
28、被感染宿主细胞的复制系统去生产很多它自己的拷贝。噬菌体拥有和细胞基因组类似的遗传物质，复制是严格的，并且它们有同样的控制遗传的方法。T2的例子进一步说明了不管是在细胞基因组中还是病毒中，遗传物质就是DNA这一结论。当DNA 加入到几种培养生长的原核细胞时，核酸进入细胞，在一些情况导致新蛋白质的产生。4.DNA双螺旋结构特点以下三个事实导致Watson和Crick于1953年提出了DNA的双螺旋结构(double helix)。X-光衍射数据显示DNA具有常规的螺旋结构，每个螺旋3.4?(3.4nm)，直径20? (2nm)。由于每个螺旋间的距离是3.4nm，所以每个螺旋有10 个碱基。G+C数
29、目不同种间变化范围为26%到74%。Watson和Crick提出双，螺旋中两条多聚核苷酸链通过碱基之间的氢键联系起来。G只能与C 形成氢键，而A 只能与T 形成氢键。这种反应被称为碱基配对(Base pairing )，并且碱基对(G 与C，A 与T)是互补的。这个模型要求两条链是反向平行(Antiparallel)。在双螺旋中，一条是5-3走向，另一条是3-5走向。a.DNA分子由两条多聚脱氧核糖核苷酸链(简称DNA单链)组成。两条链沿着同一根轴平行盘绕，形成右手双螺旋结构。螺旋中的两条链方向相反，即其中一条链的方向为53，而另一条链的方向为35，螺旋结构上有大沟和小沟。b.嘌呤碱和嘧啶碱基
30、位于螺旋的内侧，磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧，彼此以3 -5 磷酸二酯键连接，形成DNA分子的骨架。碱基环平面与螺旋轴垂直，糖基环平面与碱基环平面成90角。c.螺旋横截面的直径约为2 nm，每条链相邻两个碱基平面之间的距离为0.34 nm，每10个核苷酸形成一个螺旋，其螺矩（即螺旋旋转一圈）高度为3.4 nm。d.双螺旋内部的碱基按规则配对，碱基的相互结合具有严格的配对规律，即腺嘌呤（A）与胸腺嘧啶（T）结合，鸟嘌呤（G）与胞嘧啶（C）结合，这种配对关系，称为碱基互补。A和T之间形成两个氢键，G与C之间形成三个氢键。双螺旋的两条链是互补关系。5.什么是DNA的变性与复性？哪些生物技术原理与这一
31、性质有关？涉及的技术：Library Screening Southern Blotting Northern Blotting 原位杂交 探针技术6.两种测序方法的原理Sanger法(双脱氧法)：利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物，直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个独立的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸（dNTP），并混入限量的一种不同的双脱氧核苷酸三磷酸（ddNTP）。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡核苷酸选择性地在G,A,T,C处终止，终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTP的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。但他们有共同的起始点，但终止在不同的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可以用X-光片放射自显影或非同位素标记进行检测。Gilbert 法7.基因组的组成成分真核生物基因组的一般特点：真核生物的基因组一般比较庞大，远大于原核生物的基因组。真核生物的DNA与蛋白质结合形成染色体，储存于细胞核内。真核基因组存在着许多重复序列，重复次数可达几百万以上。绝大多数真核生物编码蛋白质的基因为断裂基因，即结构基因是不连续排列的，中间由插入序列隔开。真核生物基因组中不编码的区域多于编码区域。
