1、测大肠杆菌群姓名：陈倩 学号：3208001904 班级：08食品1班 组别：第五组多管发酵法测大肠杆菌群一、 实验目的1、 学习测定水中大肠杆菌群数量的国标测试法（主要为多管发酵法）2、 了解大肠杆菌群的数量在水中的重要性二、 实验原理我国生活饮用水卫生标准GB5749-85中关于生活饮用水的细菌标准具体规定如下：1、 细菌总数1ml水中不超过100个。2、 大肠杆菌数1L水中不超过3个。3、 若只经过加氯消毒即供作生活饮用水的水源水，大肠杆菌群数平均每升不得超过1000个；经过净化处理及加氯消毒后供作生活饮用水的水源水，大肠杆菌群数平均每升不得超过10000个。多管发酵法是以最可能数（mo
2、st probable number）简称 MPN 来表示试验结果的。实际上它是根据统计学理论，估计水体中的大肠杆菌密度和卫生质量的一种方法。如果从理论上考虑，并且进行大量的重复检定，可以发现这种估计有大于实际数字的倾向。不过只要每一稀释度试管重复数目增加，这种差异便会减少，对于细菌含量的估计值，大部分取决于那些既显示阳性又显示阴性的稀释度。因此在实验设计上，水样检验所要求重复的数目，要根据所要求数据的准确度而定。发酵法：又称多管发酵法或三步发酵法1、初发酵（推测试验）：将不同稀释度的水样，分别接种于含有乳糖等糖类的培养液中（3倍或1倍乳糖液），经37 oC培养24 h，观察产酸产气情况，培养
3、基内加有溴甲酚紫作为pH指示剂，细菌产酸后，培养基即由原来的紫色变为黄色，以初步判断是否有大肠菌群存在。2、平皿分离（证实试验）（1）水中除大肠菌群外，尚有其它细菌可能引起糖类发酵，因此需要进一步证实。（2）将初发酵管中已发酵的菌液接种于伊红美兰培养基，37 oC培养24 h，根据菌落特征（带核心的、有金属光泽的深紫色菌落），挑取可能为大肠菌群的菌落制片，经革兰氏染色，进一步证实是否为大肠菌群。3、复发酵试验(完成实验）（1）将上述可能为大肠菌群的菌落再次转接入1倍乳糖培养液中，经37 oC培养24 h，产酸产气者即最后确证为存在大肠菌群。（2）产酸、产气分别记为阳性反应，不产酸、产气则记为阴
4、性反应；（3）根据阳性管数量，查表求得水体大肠菌群的数量。姓名：陈倩 学号：3208001904 班级：08食品1班 组别：第五组三、 实验材料1、 培养基：乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管），三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管），灭菌水2、 仪器及其他用具：试管架，灭菌吸管3支，灭菌试管10支，,灭菌锥形瓶3个（250ml），四、 实验步骤（一）、培养基的制备1、单倍乳糖蛋白胨培养液：成分： 蛋白胨 10g 牛肉浸膏 3g乳糖 5g 氯化钠 5g1.6%溴甲酚紫乙醇 1mL 蒸馏水 1000mL制法：将蛋白胨、牛肉浸膏、乳糖、氯化钠加热溶解于 1000mL 蒸馏水中，调节 pH 为 7
5、.27.4，再加入 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1mL，充分混匀，分装于含有倒置的小玻璃管的试管中，于高压蒸汽灭菌器中，在 115灭菌 30min，贮存于暗处备。2、三倍乳糖蛋白胨培养液：按上述配方比例三倍（除蒸馏水外），配成三倍浓缩的乳糖蛋白胨培养液，制法同上。3、 EC培养液：成分： 胰胨 20g 乳糖 5g 胆盐三号 1.5g 磷酸氢二钾（K2HPO4） 4g 磷酸二氢钾（KH2PO4） 1.5g 氯化钠 5g 蒸馏水 1000mL 制法：将上述成分加热溶解，然后分装于含有玻璃倒管的试管中。置高压蒸汽灭菌器中，115灭菌 20min。灭菌后 pH 应为 6.9。4、培养基的存放：在密封瓶中
6、的脱水培养基成品要存放在大气湿度低、温度低于30的暗处，存放时应避免阳光直接照射，并且要避免杂菌侵入和液体蒸发。当培养液颜色变化，或体积变化明显时废弃不用。（二）、水样的采取在所取材料菜地泥中加入适量无菌水，待泥土基本沉降下来时取水样，并根据实验要求配置稀释水样。（三）、水样的检测1、初（步）发酵实验 （1）水样的稀释： 原水样10-110-2（2）接种：分别吸取1ml 10-1、10-2和原水样接入装有10ml普通浓度乳糖蛋白胨发酵管，每种浓度的水样各加进3支试管；另取10ml原水样接入装有5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管，混匀后，37 培养24 h，24 h未产气的继续培养48 h。2、平板
7、分离经24 h培养后，将产酸产气及48h产酸产气的发酵管，分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再于37 培养24 h，将符合下列特征的菌落的一小部分进行涂片、染色、镜检。（1）深紫黑色，有金属光泽；（2）紫黑色，不带或略带金属光泽；（3）淡紫红色，中心颜色较深。姓名：陈倩 学号：3208001904 班级：08食品1班 组别：第五组3、复发酵试验将镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌的菌株重新接种于普通浓度的乳糖蛋白胨发酵管，每管可接种来自同一初发酵管的同类型菌落13个，37培养24h，结果若产酸产气，即可证实有大肠杆菌群存在。并根据初发酵管试验的阳性管查表，即得大肠菌群数。五、保证措施（1）要保证水样在
8、采集、运输、保存过程中不受污染。（2）实验过程中所 用的玻璃仪器均要灭菌。（3）带菌培养基应在灭菌后再弃去，其他均遵守实验室安全制度。（4）检验开始前要充分摇匀混合水样，这样可以确保细菌在水样中均匀分布，以保证湖水大肠杆菌数量的准确性，这对检验结果的真实性是十分重要的。六、实验流程图姓名：陈倩 学号：3208001904 班级：08食品1班 组别：第五组七、实验结果1、 原水样三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管2、 原水样普通浓度乳糖蛋白胨发酵管姓名：陈倩 学号：3208001904 班级：08食品1班 组别：第五组3、10-1水样普通浓度乳糖蛋白胨发酵管4、10-2水样普通浓度乳糖蛋白胨发酵管姓名：陈
9、倩 学号：3208001904 班级：08食品1班 组别：第五组实验结果分析：实验结果可以由上面的实验图看出，当水样的量和浓度相同时，培养基的浓度越高，产生的气泡以及酸更多；当培养基相同时，水样的浓度越高，产生的气体以及酸更多。产生的气体以及酸表明水中的大肠杆菌量的多少。本次实验中，并不是所有培养基的试管都出现产酸产气，可能原因有以下几方面：1、水样浓度太低；2、采集水样时没有用专门的水样瓶，而是用锥形瓶代替水样瓶；3、由于实验条件的限制，没有完全按标准法去做，平行试验太少；实验结论：原水样与10-1浓度培养后均表明有大肠杆菌存在，即本次实验还是比较成功的。八、实验体会在测大肠杆菌的实验中，我
10、学到很多东西，加强了我的动手能力，并且培养了我的独立思考能力。在做实验前，一定要将课本上的知识吃透,并将以前学过的微生物实验知识综合利用起来，因为这是做实验的基础，否则将使你在做实验时的难度加大，浪费做实验的宝贵时间。比如做培养基的实验,你要回顾以前做培养基的实验步骤，如果你不清楚，在做实验时才去摸索，这将使你极大地浪费时间，事倍功半。做实验时，一定要亲力亲为，务必要将每个步骤，每个细节弄清楚，弄明白，实验后，还要复习，思考，这样，你的印象才深刻。记得才牢固。否则，过后不久你就会忘得一干二净，这还不如不做。做实验时，老师还会根据自己的亲身体会,将一些课本上没有的知识教给我们，拓宽我们的眼界，使我们认识到这门课程在生活中的应用是那么的广泛。通过这次动手实验，使微生物这门课的一些理论知识与实践相结合，更加深刻了我对这门课的认识，巩固了我的理论知识。不过这次实验虽好，但是我认为它安排的实验时间过于短暂，因为这些时间安排能让我们充分通过体会实验，获得知识的时间过短，结果不能保证每一个项目的质量，所以如果有什么出错麻烦请老师指出！
