1、细胞生物学提纲学生用第一章 绪论研究对象是细胞-Cell细胞生物学：就是从细胞的不同层次来研究生命活动基本规律的学科.细胞的不同层次是指：“细胞整体”、“细胞显微、超微结构”和“分子水平”三个层次绪论分三部分：一、细胞生物学研究内容；二、细胞生物学发展简史；三、细胞生物学发展现状及发展前景一、细胞生物学研究内容首先研究细胞的形态结构，然后是细胞的功能。 显微结构：在光学显微镜下细胞的结构 细胞的结构包括 亚显微结构：也叫超微结构，指的是电子显微镜下细胞的结构细胞的功能：物质的吸收、合成与分解、增殖与分化、遗传与变异等等二、细胞生物学发展简史细胞生物学发展的几个重要时期（一）细胞的发现最早发现细
2、胞的是：胡克（Robert Hooke）Cellar (小室)Cell。最早的一架显微镜是由Z.Jansen于1604年创造的，放大倍数1030倍，又称为“跳蚤镜”；半个多世纪之后，Hooke（胡克）创造了第一架有科研价值的显微镜，放大倍数40140倍，并从木栓中发现蜂巢状小室细胞，Hooke于1665年发表显微图谱一书。他在这本书中描绘的“微小孔洞”被认为是细胞学史上第一个细胞模式图。第一次观察到活细胞的是：列文虎克（A.V.Leeuwenhoek）。（二）细胞学说的创立和细胞学的形成1、细胞学说的创立及其意义：1831年，布朗（R.Brown）发现了细胞核；1835年，杜雅丁（E.Duja
3、rdin）发现了动物细胞中的粘液质，并称其为“肉样质”（sarcode）;1839年，蒲肯野（Purkinje）发现了植物细胞中的物质，称为“原生质”(protoplasm);1839年，冯.莫尔（Von.Mohl）发现了动物细胞中的“肉样质”和植物细胞中的“原生质”在性质上是一样的。1838年，德国植物学家施莱登（M.Schleidon）提出：所有的植物体都是由细胞组合而成的；1839年，德国动物学家施旺（Schwann）认为：动物体也是由细胞所组成的，并肯定了一切生物体都是由细胞组成的。二人的观点就是著名的“细胞学说”（cell theory），施莱登和施旺同时成为细胞学说的创始人。185
4、5年，德国病理学家魏尔肖（R.Virchow）提出：“细胞来自细胞”。“细胞学说”包括三个内容：（1）细胞是多细胞生物的最小结构单位，对单细胞生物来说，一个细胞就是一个个体；（2）多细胞生物的每一个细胞为一个代谢活动单位，执行特定的功能；（3）细胞只能通过细胞分裂而来。2、细胞学的经典时期1）原生质理论的提出；2）细胞分裂的研究；3）重要细胞器的发现1883年Von Beneden和Boveri发现了中心体；1894年Altmann发现了线粒体；1898年Golgi发现了高尔基体，并用他的名字来命名。3、细胞学的形成和细胞学的分支赫特维希(O.Hertwig)于1892年发表了细胞与组织的著名
5、著作，这一著作标志着细胞学（Cytology）作为一门独立的生物学科的建立。Hertwig兄弟二人（O.Hertwig和R.Hertwig）Wilson, E.B.于1896年发表了名为发育和遗传中的细胞一书，(The Cell in Development and Heredity)，成为细胞学史上第一部有系统的细胞学。1925年，这本书的第二版问世，第二版中发表了Wilson绘制的一幅细胞模式图，这幅图是细胞学史上第二个具有代表意义的细胞模式图。（三）电镜下的细胞和细胞生物学的兴起显微镜的分辨力（resolution）即分辨能力，分辨力取决于入射光的波长，入射光波长越短，显微镜分辨本领越高
6、。1933年，德国科学家Ruska（鲁斯卡）在西门子公司（Siemens）设计制造出世界上第一台电子显微镜，Brachet, J（布拉舍）于1961年绘制了一幅细胞模式图，成为细胞学史上第三幅细胞模式图。Hooke（1665年）第一幅、Wilson（1925年）第二幅、Brachet（1961年）第三幅1953年沃森（Wstson）和克里克（Crick, F.H.）发现了DNA分子双螺旋结构。细胞生物学（Cell biology）提出者De Robertis，于1965年将其原著的普通细胞学更名为细胞生物学出版，这标志着细胞生物学新学科的诞生。细胞生物学与细胞学不同之处：A：深刻性；B：综合性
7、。（四）现代细胞生物学与分子细胞生物学的出现上世纪50年代，对细胞质基质的结构尚不了解，认为各种细胞器是悬浮在溶液状基质中；60年代，电镜标本固定技术改进，人们发现基质中有微管、微丝的存在；70年代，由于使用了高压电镜，人们看到了细胞的立体结构，又发现基质中除了有微管微丝外，还有网架状的微梁网架，或称微梁系统。至此，人们发现细胞质基质中具有一定秩序的立体空间结构“细胞骨架”（cytoskeleton）Darnell等人于1986年提出了“分子细胞生物学”的概念（molecular cell biology）细胞生物学主要经历了四个发展阶段：1、细胞的发现(1665年R.Hooke; 1675年
8、Leeuwenhoke)2、细胞学说的创立和细胞学的形成(1838年Schleidon; 1839年Schwann)3、细胞生物学的出现(1965年De Robertis)4、分子细胞生物学的兴起(1986年Darnell)cellcytologycell biologymolecular cell biology三、细胞生物学的发展现状和发展前景生物工程一般包括四类：遗传工程（基因工程），细胞工程，酶工程和发酵工程。细胞工程（cell engineering）是在细胞水平上的生物工程细胞工程最早最成功的一个例子就是单克隆抗体技术（McAb），简称单抗。所谓单抗技术是来自一个杂交瘤细胞的细胞株
9、所产生的抗体。单抗技术的发明人为英国免疫学家Milstein和当时还是博士后的青年科学家Kohler，他们于1975年完成这项技术，1984年获诺贝尔医学奖。细胞生物学的另一个重要应用就是现在非常时髦的转基因动物或转基因植物研究，这项技术的根本目的在于改良生物品种性状或利用转基因生物体生产对人类有经济价值的蛋白质产品。较早较成功的转基因动物为1982年美国四家实验市的共同的研究成果：“超级小鼠”（super mouse）。1997年克隆羊多莉诞生。基础研究方面：1985年，日本一研究组在高压电镜下观察到了DNA的三维双螺旋结构；1986年，美国、日本又研制成功了扫描隧道显微镜，能显示出晶体表面
10、的原子布阵。第二章 细胞生物学研究方法第一节 细胞形态结构的观察方法一、光学显微镜（一）普通显微镜普通显微镜主要结构为三部分：（1）光学放大系统：包括目镜和物镜；（2）照明系统：包括光源、折光镜和聚光器；（3）支架和机械系统。分辨力（resolution）：是指显微镜将物体放大成像后，能将物体相近两点分辨清楚的距离极限。D代表分辨力：D= 0.61 / N.A.其中：代表光波波长； N. A. 为镜口率，也称数字孔径。 N. A. =N Sin /2 (Numerical Aperture) 从公式中可以看出，镜口率与N 和 Sin /2 成正比，通常我们用的介 物镜镜口 质为空气，N=1；油
11、镜用的香柏油N=1.515；一般不能再提高介质折射率， 而镜口角最大也不能超过1800，所以Sin /2的最大值小于1；那么根据 这些数值推算，普通显微镜的最小分辨距离不会小于0.2um，所以通常认 为光镜的分辨力极限为0.2um，放大倍数最高为1000倍。 标本一点 （二）特殊显微镜1、紫外光显微镜（ultraviolet microscope）2、荧光显微镜（fluorescent microscope）3、暗场显微镜（也叫暗视野显微镜 darkfield microscope）背景是暗的，样品是亮的特殊装置：中央遮光板和暗视野聚光器4、相差显微镜（phase contrast micro
12、scope）将光程差（也就是相位差）转化为光强差（即振幅差） 相差：是指同一光线经过折射率不同的介质时，引起相位发生的变化。相位：是指某一时间光的波动所能达到的位置。直射光和衍射光相遇，会产生干涉现象，这时：如果两者相位相同，则两束光合光的振幅加大；物体变亮。若两者相位相反，则两束光合光的振幅减小，物体变暗。相差显微镜的特殊部件：加在物镜中的环形相板和加在聚光器中的环形光阑。凸形相板明反差（bright contrast）或负反差（negative contrst）；凹形相板暗反差（dark contrast）或正反差（positive contrast）。环形光阑作用：把光分成直射光和衍射光
13、，保证直射光线通过环形相板的环形区。5、激光共聚焦扫描显微镜也称为激光扫描显微镜（Laser-scanning microscope）简称LSM二、电子显微镜（electron microscope）简称电镜电镜用的光源是电子束，透镜为电磁场。电子束波长与电压成反比，即电压越高、波长越短。例如，电压为6万伏，则=0.0488埃，比最短的可见光4000埃约小10万倍。电镜的基本构造主要如下：电子束照明系统；电磁透镜成像系统；真空系统；记录系统；电源系统。 电镜与光镜的主要区别： 光镜 电镜 光源 可见光 电子束 介质 空气（香柏油） 真空 聚光镜 光学透镜 电磁透镜 分辨力 0.30.1um 0
14、.1nm 放大倍数 1000倍 百万倍 透射式电子显微镜（TEM：transmission electron microscope ）观察标本内部细微结构 扫描式电子显微镜（SEM：scanning electron microscope）观察标本表面形态结构负染色技术：背景发暗，样品发亮。冰冻断裂和冰冻蚀刻电镜技术：（freezefracture ;freezeetching）主要用于研究生物膜结构主要步骤：A.冰冻标本（-1000C冰或-1960C液氮） B.冷刀断开标本（冰冻断裂） C.升温，冰升华，断裂面结构暴露（蚀刻） D.表面喷一层蒸汽碳和铂， E.将组织溶掉，碳和铂的膜称复膜（r
15、eplica） F.电镜下观察复膜，复膜构造=标本构造三、扫描隧道显微镜（scanning tunneling microscope） 简称STM，可观察原子图像；扫描探针：钨丝或白金丝，直径几个埃隧道电流：电子在样品与探针之间（距离几个埃）转移形成的电流优点：分辨力高；三维图像；电压低（2mV2V）； 不用真空（常压、液态均可）；速度快。第二节 细胞组分的分析方法一、细胞及细胞组分的分离与纯化（一）细胞分离术 1、组织细胞分离 酶法：动物组织胰蛋白酶；植物组织果胶酶 非酶法：EDTA与Ca2+螯合 2、混合细胞分离：流式细胞分离术 又称流式细胞术（flow cytometry） 简称FCM
16、应用仪器：流式细胞计（flow cytometer） 特点：细胞是高速运动的（二）超离心技术（ultracentrifugation） 转速在25000r/min以上 沉降系数:单位离心场强度下溶质分子的沉降速度。 沉降系数以“S”表示，1S相当于110-13s 离心 分析离心制备离心 差速离心： 密度梯度离心：介质蔗糖、氯化铯（三）细胞的选择性抽提非离子去垢剂：如TritonX100、辛基葡萄糖苷 可行成去垢剂类脂 去垢剂类脂蛋白质混合分子团 能保护蛋白质天然构象离子去垢剂：十二烷基磺酸钠（SDS） 易使酶和蛋白质变性，丧失活性二、组织化学法：细胞内核酸、蛋白质、酶、糖和脂等生物大分子的显示
17、方法利用染色的方法进行原位分析福尔根（Feulgen）鉴定DNAPAS（高碘酸席夫反应）鉴定多糖类物质二者皆有醛基与Schiff试剂反应，生成红色化合物三、免疫细胞化学特异蛋白抗原的定性与定位（一）原位分析 直接法：Ag+Ab*镜检（*代表标记物）免疫反应 间接法：Ag+Ab1+ Ab2*镜检标记物可以为多种：1.荧光素免疫荧光技术或称荧光抗体法2.酶免疫电镜技术或称酶标抗体法3.放射性同位素标记4.铁蛋白标记5.免疫胶体金技术（二）体外蛋白质分析：蛋白质印迹法（western blotting）蛋白质由SDS聚丙烯凝胶硝酸纤维素膜转移的过程即为印迹（blotting）四、细胞内特异核酸的定性
18、定位细胞内原位杂交； Southern blotting体外 Northern blotting分子杂交（molecular hybridization）：利用DNA高温变性、低温复性原理；DNADNA; DNARNA; RNARNA原位杂交（in situ hybridization）:在不破坏细胞或细胞器的前提下，用带有标记的特定核酸分子作为探针，来测定特定核苷酸顺序在染色体上或在细胞中的位置的技术。第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术一、细胞培养（cell culture）条件：适合的培养液；培养温度37oC; 小牛血清（动物培养）；无菌室； Co2培养箱；培养瓶；多孔培养板等（一）
19、动物细胞培养1、克隆培养（clonal culture）由同一个细胞分裂而来的多个细胞形成的集落，称为一个克隆。克隆又称无性繁殖系或无性系2、群体培养（mass culture）体外培养细胞生长特点：a:贴壁生长 单层细胞培养 b:接触抑制现象原代培养（primary culture）原代细胞传代培养（subculture）传代细胞细胞系和细胞株 例：HeLa细胞系；CHO细胞系动物细胞的无血清培养（二）植物细胞培养动物细胞：体外不能分化，不能形成组织；植物细胞：体外可分化发育为植株，即再生植株。植物细胞培养分为：1.花药或花粉培养：花粉培养液 愈伤组织分化培养基 长出茎叶另一分化培养基 根形
20、成花 盆植株2.胚和胚株培养：胚幼胚培养基23周分化胚状体的培养基 长出茎叶3.颈顶端培养： 茎顶或叶片组织酶消化 单细胞愈伤组织途径4.叶肉细胞培养：5.原生质体培养：植物细胞经纤维素酶或果胶酶去掉细胞壁即成原生质体，原生质体可进行细胞融合及转基因操作 原生质体高渗培养基 生成细胞壁分化培养基 愈伤组织二、细胞工程（一）细胞融合和细胞杂交技术(cell fusion, cell hybridization)细胞融合：两个或两个以上的细胞合并成一个双核或多核细胞的技术。（二）单克隆抗体技术（monoclonal antibody） 小鼠脾脏B淋巴细胞 小鼠骨髓瘤细胞 （经绵羊红细胞免疫） 仙台
21、病毒 （酶缺陷型突变株） PEG 杂交瘤细胞 HAT选择培养液 杂交瘤 抗体检测为阳性 扩大培养，提取抗体（三）细胞拆和细胞拆和：把细胞核和细胞质分开，然后把不同来源的细胞核与细胞质相互配合，形成核质杂交细胞。主要用于研究核质关系。细胞拆和方法分为：1、物理法：玻璃针、微吸管、紫外光或激光2、化学法：细胞松弛素B 核体（小细胞） (破坏微丝) 胞质体三、显微操作术（micromanipulation）显微操作仪第四节 生理测定1、膜电位的测定：外高内低，6070mV膜电位2、细胞电泳（cell electrophoresis）：第三章 细胞的基本知识概要一、细胞的基本概念1、细胞概念细胞一词是
22、由罗伯特.胡克（R. Hooke）于1665年提出的。细胞概念：细胞是有膜包围的，能进行独立繁殖的最小原生质团，同时细胞是生命活动的基本单位。病毒只能称为“半生命”。原生质概念：原生质是具有生命现象的细胞活物质，指构成细胞的全部生活物质。原生质体（protoplast）：由脂双层膜包围着原生质的活细胞。也有这样说的原生质体是除去全部细胞壁的“细胞”，或是一个为脂膜所包围的裸露“细胞”。细胞的基本构成 纤毛、鞭毛 质膜外结构 细胞 细胞壁 细胞膜 细胞器 原生质（体） 细胞质 细胞核 细胞质基质细胞质概念：细胞质是指细胞核与细胞膜之间的原生质。细胞器（organelle）：凡是在光学和电子显微镜
23、下能够分辨出的，具有一定形态特点，执行特定功能的结构，称为细胞器。如线粒体和叶绿体。细胞质中除了细胞器以外的物质称为基质（cytoplasmic matrix）。2. 细胞的基本共性细胞进行生命活动的最基本要素：（结构共性）（1）一套基因组；（2）一层细胞膜；（3）一套完整的代谢系统。细胞中的四大类有机化合物：（化学成分共性）（1）糖类：单糖：主要作用是提供能源； 多糖：主要作用有二：一是作为食物贮存方式，二是参加结构组成。（2）脂类：细胞中脂类化合物种类较多，如脂肪、脂肪酸、磷脂、糖脂、鞘脂等，磷脂又称双性脂类。（3）蛋白质：氨基酸多肽链蛋白质（4）核酸：分为核糖核酸（RNA）和脱氧核糖核酸
24、（DNA）除了上述这四种有机物以外，细胞中还有大量的无机分子水和无机盐等。细胞中的水分子有两种存在形式 游离水 结合水组成细胞的最基本元素为C、H、O；其余的元素还有：N、S、P、Ca、N、K、Fe等；任何生物分子都离不开C、H、O；N、S等元素是组成蛋白质的主要成分；P元素在脂类分子中经常存在。二、细胞的分类1、细胞分类：经典分类学 动物界、植物界1925年，Chatton把细菌、蓝藻等细胞核没有膜包围的生物称为原核生物；60年代Hans Ris (H. Ris)将细胞划分为 原核细胞（procaryotic cell） 真核细胞（eucaryotic cell） 原核生物：由原核细胞构成的
25、生物称为原核生物；生物划分 真核生物：由真核细胞构成的生物称为真核生物。2.原核细胞与真核细胞的区别（书中26页有表）原核细胞与真核细胞的差异主要有两方面 结构与功能上的差异 遗传装置及基因表达方式的差异。（）结构上的差异：原核细胞没有膜包围的细胞核，而真核细胞的细胞核是有膜包围的;：真核细胞有内膜系统、及内膜系统演变的细胞器，原核生物没有内膜系统；：真核细胞有细胞骨架，原核细胞没有。（）遗传装置及基因表达调控方式的差异： 基因结构： 原核细胞环状，一个，裸露或与少量蛋白质结合； 真核细胞线状，多个，DNA与多种蛋白质结合成核小体结构。真核细胞：组蛋白 核小体 染色质 染色体基因表达调控： 原
26、核细胞： DNA没有无用序列，均为编码序列； 真核细胞：DNA常有无用序列，内含子（intron）与外显子（exon）相间排列 内含子为DNA中不编码蛋白质的序列 外显子为DNA中编码蛋白质的序列基因 exon intron （DNA）转录 切掉 切掉 （mRNA）翻译 （蛋白质)三、原核生物（procaryotic cell）最主要特征是没有由膜包围的细胞核，遗传物质通常集中于细胞的一个或几个区域中，这些区域与细胞质之间没有核膜隔开，所以一般把这种区域称为类核（nucleoid）又称拟核。原核细胞主要形态特征：1、细胞膜：单位膜，约10nm厚，暗亮暗形式，没有内膜系统。2、类核：遗传物质集中
27、区域，为一裸露环状DNA分子。3、细胞质：没有内膜系统、细胞器（核糖体除外）。4、细胞壁：肽聚糖等成分构成四、真核细胞（eucaryotic cell）（一）电镜下真核细胞结构：1、质膜：即细胞膜，为暗明暗三层结构的单位膜。2、细胞核： a.核膜：双层核膜 b.遗传物质：组蛋白 核小体 染色质 染色体 c.核仁：一或多个核仁 d.核质：核基质，内有核骨架。3、细胞质：有各种细胞器4、细胞壁：由纤维素组成。（二）真核细胞的三大结构体系：1、生物膜系统：以磷脂和镶嵌蛋白质构成的膜系统2、遗传信息表达结构系统： DNApr RNApr； 信息表达包括DNA复制、转录与蛋白质翻译3、细胞骨架体系：（c
28、elluar skeleton system）微管、微丝及微梁系统等构成的网架系统，细胞骨架又分为胞质骨架与核骨架。（三）动、植物细胞比较植物细胞中的叶绿体、液泡及细胞壁是动物细胞所没有的五、细胞的形状和大小1、细胞的形状红血细胞为双面凹的圆盘状，表面积大，有利于O2和CO2交换；神经细胞具有传导作用，有很长的突起；保卫细胞，呈半圆形，两个半月形细胞围城一个气孔。2、细胞的大小 A生物体各种细胞体积差别很大B细胞的大小与生物体体积无关，即“细胞体积的守恒定律”C细胞体积的极限问题：细胞不可以无限制的小或者无限制的大六、病毒1、病毒分类： 按宿主分为：动物病毒、植物病毒、细菌病毒（噬菌体） 按核
29、酸类型分为：DNA病毒和RNA病毒病毒大多由核酸芯子外包以蛋白质外壳组成。有的病毒只由核酸构成，没有蛋白质外壳，称为类病毒（viroid），只由蛋白质构成的病毒，这种蛋白质具感染能力，被命名为朊病毒（prion）。据此，病毒又分为：真病毒、类病毒和朊病毒三大类。2、病毒生活周期病毒的增殖又称复制，必须利用宿主代谢系统进行第四章 质膜和细胞表面第一节 质膜的分子结构一、质膜的结构模型：1、双分子片层模型(Bimolecular leaflet model)，2、单位膜模型(Unit membrane model)，3、流动镶嵌模型。（液晶模型和板块模型）二、膜流动性的控制因素： 1、膜脂类的流动
30、性（Fluidity）:对分子本身而言：A构象变化，B侧向移动，C分子旋转，D尾部摆动，E倒翻（Flip-flop）。对整个膜而言：A脂肪酸链的饱和程度，B脂肪酸链的长度，C胆固醇/磷脂，D卵磷脂/鞘磷脂，E蛋白含量。2、蛋白的运动性(protein mobility)第二节 细胞连接(Cell Junction)一、紧密连接(Tight Junction)二、黏和连接（中间连接）(Adherens junction)三、隔状连接(Septate junction)四、桥粒(desmosome)五、缝隙连接Gap junction)：1、功能：（1）细胞分化；（2）协调代谢，例证：缺陷型细胞-不能利用次黄嘌呤合成核酸，野生型则能，两者混合培养后均能。（3）传递电兴奋，实验：脑发育中，神经细胞未产生时靠此连接传递电兴奋。六、胞间连丝(Plasmo
