1、血小板功能检测血小板聚集实验血小板活化， 一、血小板功能检测项目出血时间、粘附性、聚集性、释放产物、花生四烯酸代谢产物、胞浆游离钙水平测定、凝血活性、膜糖蛋白检测、基因多态性和突变。常用的检测功能的方法为：血小板聚集性测定(比浊法、阻抗法、循环血小板聚集体、自发性血小板聚集)，近年来，流式细胞仪、PFA-100分析及激光衍射法检测微小聚集体也逐渐地进入临床或临床前阶段。比浊法测定血小板聚集是应用较广泛的指标，可以用于遗传性血小板疾病诊断指标，也可以作为血栓性疾病中评估其病理反应，指导抗栓药物的应用以及作为抗血小板药物监测之用。在比浊法的应用中，有几项关键问题应予以注意：(1)血液采集与分离。(
2、2)诱导剂应用:种类、浓度。(3)正常值的选定。流式细胞仪可以检测血小板功能、代谢、尘化及受体表达，而微小聚集体的形成作为血栓形成的早期敏感指标采用激光衍射法的测定也正在评估中，反映体内全血状态下的血小板阻抗法以及血小板内钙离子水平的检测在临床研究中显示其意义。 二、血小板功能检测的临床应用1、出血性疾病：分遗传性和获得性二类，采用常规的血小板聚集试验对遗传性血小板疾病即可作出初步诊断。 2、血栓性疾病：大多数血栓性疾病均可以检测到血小板反应性增高，(这对疾病的病理过程，指导疾病治疗均有一定；意义，许多指标在疾病中的意义也作比较研究，一些分子标志物在反映血小板活化方面有较高的灵敏度)。P选择素
3、是反映血小板活化的较敏感指标，而血小板聚集性测定较为简便。最近的一些研究也表明血小板活化指标不仪在反映血小板活化方面有意义，而且对某些疾病具有预示意义。譬如，胶原诱导血小板聚集在妊娠25周升高，则预示先兆子痫，具有较高的灵敏性和精确性，也有采用血小板数、MPV和聚集三项来综合预示先兆子痫。采用MPV、血小板数和P选择素，发现不稳定心绞痛和心肌梗死有差别。这表明血小板检测在临床上足十分有用的。在血小板参与功能血栓形成的机制中，除了上述获得性原因外，近年来的研究也证明存在遗传因素。粘性血小板综合征为常染色体显性遗传，表现为对ADP和/或肾上腺素的血小板聚集反应增强，本征分为三型：I型对ADP和肾上
4、腺素聚集反应均增强，II型对肾上腺素聚集反应增强，III型对ADP聚集反应增强。在原因不明的动脉血栓形成中，本征的发病率占21%。血小板膜糖蛋白基因多态性与动脉血栓形成的危险之间的关系正在研究中。 GPIIIa的PLA1(Leu33)PL2(Pro33)，GPba上的三个多态性(39bp*重复变异数、Thrl45Met、-5T/C)，胶原受体GPIa807C/T、Lys505Glu的基因多态性与缺血性心脏病、脑血管病和介入疗法的关系研究，多数是在基因型与疾病关系之间进行，虽然获得的结果尚属初步，但譬如动脉粥样硬化，心脑及周围血管血栓病，糖尿病等疾病使人们对遗传因素与血栓形成关系有了新的认识。3
5、药物监测中的应用：抗血小板药物监测通常采川比浊法血小板聚集性测定即可，当然，采用PFA-100时，其灵敏性更高，服用ASA时其血小板诱导剂叫可选用AA+ADP或胶原，服用抵克力得和玻立维时可选用ADP，在GPIIb/IIIa拮抗剂活疗叶，用全血血小板聚集和流式细胞仪测得的结果致，较比浊法灵敏，肝素治疗引起血小板减少/血栓形成综合症也叮采用聚集法测定。 血小板功能检测主要有以下指标：1,p选择素测定：用ELISA法，一般实验室应该都能开展，医院检验科肯定能开展，关键是你要买到试剂盒，有酶标仪。这个指标主要评价血小板活化程度。可行性较大。2，血栓烷B2：也是可以用ELISA检测，难度和P选择素差不
6、多，主要反映血栓前状态。3，PF3：好象没有自动化仪器可以检测，所需要的试剂也很简单，白陶土 和氯化钙就行了。但是首主观影响很大。4，血小板聚集实验：该实验需要的试剂也很简单，主要就是要有酶标仪。5，血小板黏附实验：手主观影响大，几乎已经被淘汰了。综上所述，有酶标仪，应该都还好做，只是操作方面你最好向做过这些实验的人请教一下。有的医院检验科开展以上检查，可以咨询技术方面的问题。 【摘要】血小板在执行生理性止血的同时，也在病理性血栓形成过程中起重要作用。血小板功能检测对于临床相关疾病的诊断和抗血小板药物的筛选及相关研究有着重要的意义。目前，血小板功能检测的实验与方法日益增多，但所有这些检测方法均
7、有不足之处，因而有必要研究和发展一种操作简便、检测灵敏度高的方法。本文对近年来血小板功能检测方法诸如血小板的一般功能检测、血小板黏附功能测定、血小板聚集功能测定、血小板释放功能测定、血小板凝血活性检测和流式细胞术在血小板功能检测中的应用等研究进展进行了综述，并对研究前景作了简单的展望。 【关键词】血小板功能检测 Research Advance inPlatelet Function Assays Review Abstract Platelets play a key role in the pathogenesis of atherothrombosis, and also perform
8、thephysiological hemostasis.The platelet function assays have values in the investigating patients with suspected platelet disorders and in studying the effects of anti platelet drugs.There are increasing assays for investigating platelet function,including assessment of platelet adhesion,activation
9、 and aggregation,etc.However,all of these assays have certain limited sensitivity.It is necessary to develop a simple, sensitive assay that measures the activated platelet. This article reviewedadvances of researches on platelet function assays, including assay for general function of platelet, assa
10、y of platelet adhesion function, plantelet activation assay, platelet aggregation assay, platelet coagulation assay and application of flow cytometry in assessment of platelet functions, etc.and looked forward to research prospect in this field. Key words platelet； platelet function; platelet functi
11、on assay J Exp Hematol 2007; 15(5):1130-1134 血小板在生理性止血、维持血管壁完整性以及某些病理过程,如血栓形成、动脉粥样硬化、不稳定性心绞痛、肿瘤转移和炎症反应等过程中起着重要作用1,2。因此，血小板功能检测对早期发现是否有血栓形成的危险以及血小板相关疾病的诊断和治疗有着重要的意义。本文就血小板功能检测方法的研究进展作如下综述。 血小板功能检测可分为血小板一般功能测定，血小板黏附、聚集及释放功能的测定和流式细胞术（FCM）分析等。 血小板一般功能测定 这种测定包括出血时间的测定3、血块收缩试验、活化凝血时间测定、快速血小板功能分析法（RPFA）4等，
12、是目前临床评价血小板功能的辅助手段。 血小板粘附功能测定 1941年Wright5建立了转动玻瓶法测定抗凝全血中的血小板在玻璃瓶表面的黏附特性。1960年，Hellem6建立了玻璃珠柱法测定枸橼酸抗凝全血或富血小板血浆的血小板粘附性。血液通过玻璃珠柱后，由于血小板粘附在玻珠或塑料管，以及形成的血小板聚集体被滞留在玻璃珠柱内。因此，过柱后血液中的血小板数降低，故又称滞留试验。1963年Salzman7对Hellem法加以改进，血液抽出后为经抗凝直接通过玻璃珠柱进行测定，本法有助于粘附性减低的出血患者的诊断，但对粘附性增高的血栓性疾病敏感性降低。 血小板聚集功能的测定 血小板聚集是血小板的一个重要
13、生理特性，是其参与止血和血栓形成过程的重要因素之一。血小板聚集功能的测定对于临床上诊断血栓前状态和血栓性疾病具有重要意义。长期以来血小板聚集活性的检测一直是血小板体外功能评价的金标准8。目前已有多种方法对血小板聚集活性进行定量或定性的测定。 肉眼或镜下检查法 主要观察聚集颗粒出现的时间及其大小，以判断血小板的聚集活性，但是只能粗略地评价血小板的聚集活性。 将全血以恒定的速度通过微孔金属网，若血小板聚集成团，则阻止血流通过，测定过滤前后的压力差来表示血小板聚集活性。 PRP比浊法 最初由Bron9提出，在特定的搅拌条件下，在富含血小板血浆（PRP）中加入诱导剂，血小板激活后GP b a复合物暴露
14、出纤维蛋白原的受体并与其结合而导致血小板聚集，血浆浊度降低，透光率增加，光电池迅速将光浊度的信号转换为电讯号，在记录仪上记录下电讯号的变化。 PRP比浊法是目前应用最广泛的一种测定法，临床上对于血小板无力症、原发性血小板增多症及血栓前状态和血栓性疾病的诊断具有重要意义。这种方法也存在不足之处：需要去除红细胞，可导致CO2的挥发和pH增高，不能完全反映体内血细胞之间的相互作用；测定时间过长可导致血小板活性降低；对血小板聚集物的形成不敏感，只能检测大的血小板聚集物；离心过程也会导致血小板的激活和红细胞碎片中血小板的丢失；血小板数目的调整难以标准化；重现性差10；而且高脂血症的PRP会影响吸光度，减
15、少PRP与PPP之间的差异。因此，体外血小板聚集实验不能准确反应体内血小板的聚集功能和血小板活化水平的变化11。 全血电阻抗法 1980年Cardina和Flower12以电阻抗原理设计了一种测定全血中血小板聚集的方法，即在测定管中加入2个电极，加入诱导剂胶原或ADP，血小板发生聚集而堆积在电极上，阻抗就相应增加，在记录仪上记录这种阻抗，以观察体外血小板的聚集活性。这种方法的优点是直接使用全血，无需富血小板血浆的制备，操作更简便快捷；无需经过离心，是新型血小板功能试验和血小板拮抗剂评价的良好供选方案13；对于脂血标本的测定，可以克服比浊法因浑浊而影响结果。这种方法的不足之处，与比浊法相比较对小
16、聚集物的形成不敏感，且每次测定后需要清洗电极，连接电极的电线需要小心放置，不能弯曲，使其很难满足临床工作的需要。 全血血小板计数法 用来测定血小板聚集时减少血小板数目。将枸橼酸钠抗凝的全血放到含有旋转离心磁棒的聚苯乙烯试管中，并在37下孵育，用甲醛固定单个血小板，以测定起始血小板数。加入诱聚剂诱导血小板聚集，并测定聚集后血小板数量，聚集前后进行比较，得出血小板减少的百分率。该法对很小的血小板聚集物敏感，并不需要对抗凝全血的稀释，耗血量少，所需时间短，可用于评价血小板功能异常的病人。 血小板功能分析仪（PFA 100） PFA 100系统最早在1995年由Kundu等14提出，对抗凝全血的血小板
17、功能进行定量检测。PFA 100模仿体内血管损伤时的止血环境，此系统由微处理器控制，使用一次性反应杯，内有一层生物膜，表面附有胶原，并含有ADP或肾上腺素。当用枸橼酸钠抗凝的全血从膜的小孔中抽吸出来时，血小板粘附于胶原并被ADP或肾上腺素进一步活化，形成血小板栓子，将小孔阻塞，仪器自动记录小孔完全阻塞的时间，所需的时间称为封闭时间。胶原和ADP用来区分先天和后天性血小板功能障碍，胶原和肾上腺素都适合检测阿斯匹林诱导的正常人血小板异常15。PFA 100操作简单，结果准确，临床上用于VWD和血小板异常的筛选，以及抗血小板药物治疗的监测和外科手术过程中初级止血的评价。然而PFA 100对于纤维蛋白
18、原缺陷疾病的诊断的灵敏度低16。 体外血小板聚集计测定法 在高剪切力条件下测定血小板的黏附和聚集。该方法简单快捷，仅需要0.2ml血液17。临床用来抗血小板药物的治疗、血栓前状态及血小板功能亢进等疾病18和心胸外科出血的监测19。 剪切诱导血小板聚集测定法 该方法采用旋转式铁板流体测定仪，将PRP注入平板的内筒内，氦氖激光透过其中，通过圆锥的旋转产生剪切力，从而引起血小板聚集，血小板聚集引起PRP透光度的变化，由电脑进行分析处理，最后绘制成聚集曲线20。剪切诱导的血小板聚集对于血栓性血小板疾病，如脑血栓、动脉粥样硬化的防治具有重要意义。但是温度和血小板数目对该法的测定结果都有较大的影响。 散射
19、性粒子检测法 该方法最先由Ozaki21提出，仪器采用He Ne半导激光器（波长为675 nm）通过聚光镜折射成直径约为40 m的激光束，照射到装有富血小板血浆（PRP）比色杯。该方法能通过血小板聚集颗粒的大小及其生成数量两个指标来评价血小板的聚集功能，血小板聚集颗粒的大小及数量与散射强度相一致，与比浊法相比，灵敏度有了很大提高。 微量板滴定法 即应用全自动定量绘图酶标仪根据比色法测定血小板聚集率。与比浊法相比较，微量板滴定法更灵敏、有效且重现性好，可用于检测已知血小板功能拮抗剂，如吲哚美辛、阿斯匹林等，且可以检测未知血小板调节因子8。该方法的最大优点是可以一次测定多个样品，尤适用于临床和科研
20、中对批量血小板聚集率的测定。但是要求血小板计数在一定范围内的结果才比较准确。 血小板释放功能的测定 血小板胞浆内含有颗粒、致密颗粒及溶酶体颗粒，当加入诱聚剂后会引起这些颗粒内容物的释放，即血小板的释放。颗粒的释放主要通过 血小板球蛋白（ TG）和血小板4因子（PF4）来测定。用商品化的放射性免疫法和ELISA法试剂盒对其进行定量测定已被推广使用，其结果对样品的处理过程高度敏感，但是结果易受机体代谢功能和血小板破坏的影响。研究发现P 选择素即血小板颗粒膜蛋白 140（GMP 140），表达在静息血小板膜上。当血小板活化后，P 选择素在血小板膜表面表达，并同时释放颗粒的内容物，P 选择素可作为血小
21、板活化的分子标志物22。在血栓性血小板减少性紫癜（TTP）、子痫等血栓性疾病及糖尿病病人的P 选择素增加23，24。因此，检测P 选择素阳性血小板数量是活化血小板最为客观、直接、特异的检测方法。致密颗粒的释放可以通过5羟色胺（5 HT）或腺苷酸的测定加以判断。5 HT测定应用荧光光度法测定，与同样处理的标准物比较，求得血小板或血浆中5 HT含量，用于筛选血小板贮存池缺陷导致胶原诱导的血小板致密颗粒释放障碍、先天性或后天性TXA2合成障碍、ADP受体缺陷等疾病。应用荧光聚集仪可同时测定血小板聚集和ATP的释放反应。 血小板其他功能检测 血小板其他功能的检测包括血小板凝血活性检测、血小板钙流检测以
22、及血小板膜糖蛋白的检测等。血小板第3因子利用试验用于检测血小板凝血活性，使用正常人和病人富含血小板血浆(PRP)和乏血小板血浆(PPP)相互交叉配合,以白陶土作活化剂促使PF3形成来测定血浆凝固时间,通过比较各组时差,从而得出PF3是否有缺陷，临床上用于诊断先天性PF3缺乏症、血小板无力症、骨髓增生异常综合征等。 大部分血小板内游离的Ca2+贮存在致密管道系统内，血小板活化后，Ca2+从致密管道系统释放至胞质内，细胞质内Ca2+水平增加。利用荧光探针标记血小板内钙离子，在诱导剂作用下，血小板的钙离子通道打开，使用共聚焦显微镜观察血小板荧光的强弱变化并经计算机控制系统及图像分析系统观察血小板浓度
23、和钙流的变化。测定胞内Ca2+的方法可用于临床诊断与Ca2+代谢有关的血小板疾病。 血小板膜含有多种糖蛋白，通过SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）可以将血小板溶液中的糖蛋白按分子量大小进行分离。血小板膜GPIb和GPIIb IIIa复合物的测定用于巨大血小板综合症和血小板无力症的诊断。 流式细胞术在血小板功能检测中应用 随着流式细胞术的成熟以及各种荧光标记的单克隆抗体的研制成功并可以直接标记荧光素分子，为血小板活化机制研究开辟了新的局面。 传统的流式细胞术 即使用洗涤的血小板或PRP检测血小板膜糖蛋白的表达。样本在离心、洗涤等操作过程中极易活化，导致血小板体外激活，影响临床诊断价值。 全血
24、法流式细胞术 主要是对血小板特异性膜糖蛋白和活化标志物进行免疫荧光标记，用流式细胞仪测定荧光强度和特异性荧光抗体结合阳性的血小板百分率，来测定血循环中血小板的活化状态以及血小板对激活剂的应答反应。与常规血小板功能测定法相比，全血法流式细胞术有许多优点：直接应用全血，反映了血小板生理状态下的功能，同时简化了标本的处理，最大限度的减少了人为活化血小板；避免了因离心导致的血小板体外激活，并防止血小板亚群的丢失；标本用量少，尤其适用于儿童和血小板减少症的患者；亦能检测出少到1%的活化的血小板亚群，能分析单个或亚群血小板膜活化标志物的测定。此外，血小板活化时其细胞内的钙离子浓度发生很大变化25，借助于钙
25、离子敏感荧光探针的帮助，用FCM测定钙离子浓度，可以作为活化血小板监测的非免疫性指标。然而，Ca2+流变化极为迅速，使得FCM定量测定较为困难。但是全血法流式细胞术也存在不足之处，如流式细胞仪价格昂贵，仪器操作复杂；同时为了避免血小板体外活化，血样需在45分钟内处理，不能长久放置；只能分析循环中的血小板的数量和功能，不能反映血小板代谢和最近被清除的血小板的数量。而且，血小板膜糖蛋白种类多，与血小板的功能状态都有关系，目前还没有一个单抗或几个单抗的组合可以全面客观评价血小板功能，该方法还需进行更深入的研究使之标准化。 展 望 综上所述，近年来血小板功能检测的方法有了较大的发展，为临床血栓与止血研
26、究和出血与血栓性疾病的诊治提供了更为广阔的前景。然而，目前的血小板功能检侧方法仍然存在不足，建立并完善一种操作简便，准确快捷的血小板功能评价的新方法仍是研究的热点之一。研究发现血小板膜纤维蛋白原受体（b3）活化即构象的改变与血小板的活化有关，b3的活化和暴露是血小板聚集的前提条件，CD42a（GPIX）在静息或活化的血小板上都表达，是血小板的标志物。Nyland13指出，与其他已经确定的检测方法相比较，纤维蛋白原受体激活测定法是血小板功能评价的良好方法。另外，血小板的膜磷脂（磷酯酰丝氨酸PS、磷酯酰肌醇PI）在膜表面的侧相分布与血小板的功能状态有关，静息血小板的PS和PI分布在膜的内侧，活化的血小板PS和PI在膜发生侧相翻转，即由膜内侧翻向膜外侧。目前，我们实验室已初步检测并分析了CD41a、CD42b和CD62p等阳性百分率与血小板聚集活性的关系，PS侧相分布的变化与血小板功能状态的关系，血小板胞浆内颗粒释放与血小板质量的关系，并用抗CD42a的单抗将血小板与其它血细胞区分，再用PAC 1检测b3的暴露情况，拟建立FAR法来判断血小板的功能，以期建立一种更科学，更准确的血小板功能评价方法。
