1、1.为什么要培养动物细胞？为什么要培养动物细胞？2.2.要培养动物细胞，对取材有何要求？要培养动物细胞，对取材有何要求？实验材料，药性、毒性检测，提取细胞分泌物等实验材料，药性、毒性检测，提取细胞分泌物等 选择胚胎细胞或幼年动物组织，因为其选择胚胎细胞或幼年动物组织，因为其分裂增分裂增殖能力强殖能力强。3.3.培养基是用液体的还是固体的？培养基中的成分培养基是用液体的还是固体的？培养基中的成分有何特点？有何特点？培养基是液体的，成份与培养基是液体的，成份与动物内环境动物内环境相似。相似。动物血清动物血清4.4.动物细胞培养条件有何特点？动物细胞培养条件有何特点？体温和体温和PHPH都应与都应与
2、动物体内环境动物体内环境相似。相似。动物细胞培养动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成组织，将它分散成单个细胞单个细胞，然后放在适，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。5.5.培养动物细胞需要哪些培养动物细胞需要哪些条件条件？液体、营养物质（液体、营养物质（血清血清）、）、PHPH、温度、气体、无菌等、温度、气体、无菌等动物组织块动物组织块动物组织块动物组织块细胞悬液细胞悬液细胞悬液细胞悬液原代培养原代培养原代培养原代培养传代培养传代培养传代培养传代培养胰蛋白酶处理分散成单个细胞胰蛋白酶处理分散成单个细胞胰
3、蛋白酶处理分散成单个细胞胰蛋白酶处理分散成单个细胞幼龄动物的器官组织；动物胚胎幼龄动物的器官组织；动物胚胎幼龄动物的器官组织；动物胚胎幼龄动物的器官组织；动物胚胎细胞贴壁细胞贴壁细胞贴壁细胞贴壁接触抑制接触抑制接触抑制接触抑制原代培养原代培养原代培养原代培养传代培养传代培养传代培养传代培养加入培养液加入培养液加入培养液加入培养液用胰蛋白酶等用胰蛋白酶等用胰蛋白酶等用胰蛋白酶等处理贴壁细胞处理贴壁细胞处理贴壁细胞处理贴壁细胞适宜条件适宜条件适宜条件适宜条件不死性细胞不死性细胞不死性细胞不死性细胞电激处理使供电激处理使供电激处理使供电激处理使供体核进入受体体核进入受体体核进入受体体核进入受体卵母细
4、胞构建卵母细胞构建卵母细胞构建卵母细胞构建重组胚胎重组胚胎重组胚胎重组胚胎卵母细胞采集、培养卵母细胞采集、培养卵母细胞采集、培养卵母细胞采集、培养MM期期期期卵母细胞卵母细胞卵母细胞卵母细胞供体牛供体牛供体牛供体牛供体细胞注入供体细胞注入供体细胞注入供体细胞注入去核卵母细胞去核卵母细胞去核卵母细胞去核卵母细胞代孕母牛代孕母牛代孕母牛代孕母牛克隆牛克隆牛克隆牛克隆牛体细胞培养体细胞培养体细胞培养体细胞培养去核卵母细胞去核卵母细胞去核卵母细胞去核卵母细胞去核去核去核去核胚胎胚胎胚胎胚胎移植移植移植移植体细胞核移植过程体细胞核移植过程（体细胞克隆动物）（体细胞克隆动物）体细胞核移植技术存在的问题体细
5、胞核移植技术存在的问题（1 1）成功率非常低）成功率非常低（2 2）克隆动物以表现早衰、生理缺）克隆动物以表现早衰、生理缺陷等健康问题陷等健康问题 1970 1970年，有两位科学家年，有两位科学家做了一个著名的实验：做了一个著名的实验：人人鼠细胞融合的实验，鼠细胞融合的实验，以证明细胞膜上的蛋白以证明细胞膜上的蛋白质分子是运动的。质分子是运动的。人人鼠细胞是怎样实现鼠细胞是怎样实现融合的？动物细胞融合有什融合的？动物细胞融合有什么实践意义呢？么实践意义呢？三、三、动物细胞融合与单克隆抗体动物细胞融合与单克隆抗体1.1.细胞融合：细胞融合：是指两个或两个以上的细胞是指两个或两个以上的细胞融合为
6、一个细胞的过程。融合为一个细胞的过程。自然发生：自然发生：受精卵受精卵人工诱导：人工诱导：利用诱导剂诱导动物细胞融利用诱导剂诱导动物细胞融合合 诱导因素：聚乙二醇、诱导因素：聚乙二醇、灭活的灭活的病毒病毒或电激等。或电激等。仙台病毒仙台病毒紫外线紫外线灭活灭活丧失感染活性（不感染细胞）丧失感染活性（不感染细胞）保留融合活性（诱导细胞融合）保留融合活性（诱导细胞融合）什么是什么是病毒的灭活？病毒的灭活？灭活是指用物理或化学手段使病毒失去感染能灭活是指用物理或化学手段使病毒失去感染能力，但是并不破坏病毒的抗原结构。力，但是并不破坏病毒的抗原结构。灭活病毒诱导细胞融合的原理灭活病毒诱导细胞融合的原理
7、 病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。细胞发生融合。因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合 正在融合的正在融合的淋巴细胞与骨髓瘤细胞淋巴细胞与骨髓瘤细胞 正在融合的鸡正在融合的鸡血细胞血细胞动物细胞融合的原理：动物细胞融合的原理：细胞膜的流
8、动性细胞膜的流动性 把两个不同的动物把两个不同的动物细胞放在一起，用灭活细胞放在一起，用灭活的病毒处理细胞，它们的病毒处理细胞，它们先发生质融合，再出现先发生质融合，再出现核融合，进而形成杂交核融合，进而形成杂交细胞。细胞。融合后的杂交细胞融合后的杂交细胞经过有丝分裂后仍能形经过有丝分裂后仍能形成两个完整的杂交细胞成两个完整的杂交细胞2.动物细胞融合技术的应用：动物细胞融合技术的应用：突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能；突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能；为制造为制造单克隆抗体单克隆抗体开辟了新途径开辟了新途径 使用相应的抗体检测乙肝病毒使用相应的抗体检测乙肝病毒抗原抗原3.单克隆
9、抗体的制备单克隆抗体的制备 医院一般怎样检测人体内是否存在乙肝病毒？医院一般怎样检测人体内是否存在乙肝病毒？乙肝病毒模式图乙肝病毒模式图乙肝病毒模式图乙肝病毒模式图 凡能够引起机体产生特异性凡能够引起机体产生特异性免疫应答的物质叫做抗原免疫应答的物质叫做抗原。什么是抗原？什么是抗原？例如花粉、病菌、病毒等。有时自身的组例如花粉、病菌、病毒等。有时自身的组织或细胞也会成为抗原，如癌细胞等。织或细胞也会成为抗原，如癌细胞等。抗原决定簇：抗原决定簇：抗原表面具有的某抗原表面具有的某些些特定的化学基团特定的化学基团，能决定抗原特异性能决定抗原特异性，是免疫细胞识别抗是免疫细胞识别抗原的重要依据。原的重
10、要依据。各种抗原的决定簇各种抗原的决定簇数目不同，同一抗数目不同，同一抗原的决定簇可能有原的决定簇可能有多种。多种。什么是什么是抗体抗体？由何种细胞产生？主要分布？由何种细胞产生？主要分布在哪里在哪里?起何作用？起何作用？当机体受到抗原刺激剂后由效应当机体受到抗原刺激剂后由效应B B细胞（浆细细胞（浆细胞）产生的，并且能与该抗原发生胞）产生的，并且能与该抗原发生特异性结合特异性结合的具的具有免疫功能的球蛋白有免疫功能的球蛋白抗体。抗体。抗体分布于血清中，也分布于组织液及外分泌抗体分布于血清中，也分布于组织液及外分泌液中。液中。抗体与相应抗原特异性结合抗体与相应抗原特异性结合 抗体由何种细胞产生
11、？主要分布在哪里抗体由何种细胞产生？主要分布在哪里?血清抗体（也称多克隆抗体）血清抗体（也称多克隆抗体）由由血清血清中提取的抗体是由不同淋巴细胞产生的中提取的抗体是由不同淋巴细胞产生的多种抗体的混合物，可达百万种以上，称为多种抗体的混合物，可达百万种以上，称为多克隆多克隆抗体。抗体。特点：特点：产量低、纯度低、特异性差、反应不够灵敏。产量低、纯度低、特异性差、反应不够灵敏。抗原不纯抗原不纯抗体不纯抗体不纯 抗原抗原 动物体内动物体内刺激刺激效应效应B B 抗体抗体 每一个每一个B B淋巴细胞只分泌一种淋巴细胞只分泌一种化学性质单化学性质单一，特异性强的抗体一，特异性强的抗体。如果利用单个如果利
12、用单个B B淋巴细胞进行无性繁殖（克隆）淋巴细胞进行无性繁殖（克隆），形成细胞群，这样的细胞群就有可能产生出，形成细胞群，这样的细胞群就有可能产生出化学化学性质单一性质单一、特异性强特异性强的抗体的抗体单克隆抗体单克隆抗体。问题：问题：怎样获得化学性质单一、特异性强的抗体呢？怎样获得化学性质单一、特异性强的抗体呢？在体外培养的条件下，一个在体外培养的条件下，一个B B淋巴细胞能淋巴细胞能无限增殖形成细胞群无限增殖形成细胞群吗？吗？什么样的细胞能够在体外无限增殖呢？什么样的细胞能够在体外无限增殖呢？肿瘤细胞！肿瘤细胞！科勒科勒米尔斯坦米尔斯坦荣获荣获19841984年诺贝尔生理学或医学奖年诺贝尔
13、生理学或医学奖 如果把一种如果把一种B B淋巴细胞与能在体外大量增殖的淋巴细胞与能在体外大量增殖的骨髓瘤细胞进行融合，所得到的骨髓瘤细胞进行融合，所得到的融合细胞融合细胞既能大量既能大量增殖，又能产生足够数量的特定抗体。增殖，又能产生足够数量的特定抗体。如何诱导融合？如何诱导融合？加入聚乙二醇加入聚乙二醇（PEG）如何得到如何得到B B淋巴细胞？淋巴细胞？3.3.制备制备单克隆抗体的单克隆抗体的过程过程细胞两两融合后，有哪细胞两两融合后，有哪些类型？些类型？B-B B-B B-B-瘤瘤(杂交瘤细胞杂交瘤细胞)瘤瘤-瘤瘤 如何筛选出杂交瘤细胞？如何筛选出杂交瘤细胞？单克隆抗体制备过程中，总共有两
14、次筛选，第单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不相同的。相同的。首先用选择培养基筛选出杂交瘤细胞首先用选择培养基筛选出杂交瘤细胞细胞合成细胞合成DNADNA有有D D和和S S两条途径，其中两条途径，其中D D途径能被氨途径能被氨基嘌呤阻断。基嘌呤阻断。人淋巴细胞中有这两种人淋巴细胞中有这两种DNADNA的合成途径，但一般的合成途径，但一般不分裂增殖。不分裂增殖。鼠骨髓瘤细胞中只有鼠骨髓瘤细胞中只有D D途径，没有途径
15、，没有S S途径，可是能途径，可是能不断分裂增殖。不断分裂增殖。你想到筛选杂交瘤细胞的方案了么？你想到筛选杂交瘤细胞的方案了么？小资料：小资料：在培养液中加入氨基蝶呤，收集增殖细胞！在培养液中加入氨基蝶呤，收集增殖细胞！加入氨基嘌呤后，使加入氨基嘌呤后，使 D 合成途径阻断，仅有合成途径阻断，仅有 D 合成途径的骨髓瘤细胞及其彼此融合的细胞就不合成途径的骨髓瘤细胞及其彼此融合的细胞就不能增殖，能增殖，但人淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂种但人淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂种细胞因为可以利用淋巴细胞中的细胞因为可以利用淋巴细胞中的 S 途径合成途径合成DNA而增殖。而增殖。通常通常采用有限稀释克隆
16、细胞的方法采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔细胞培养板上培养，使细胞多倍稀释，接种在多孔细胞培养板上培养，使每孔细胞不超过一个，每孔细胞不超过一个，再由这些单细胞克隆生长，再由这些单细胞克隆生长，然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体，那些上清然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体，那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。最终选出最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。再筛选出再筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞能分泌所需抗体的杂交瘤细胞阳性孔阳性孔方法方法方法方法抗原抗原抗原抗原-抗体杂交法抗体杂交法抗体杂交法抗体杂交法 在单克隆抗体制备过程中，两次筛选的原理和在单克隆抗体制备过程中，两次筛选的原理和方法是不相同的。方法是不相同的。如何得到大量的单克隆抗体？如何得到大量的单克隆抗体？体内培养体内培养体外培养体外培养单克隆抗体单克隆抗体 化学性质单一、特异性强化学性质单一、特异性强 抗体抗体 抗原抗原 应答应答 抗体的不纯性抗体的不纯性 动物细胞受到抗原刺激动物细胞受到
