1、纯化水微生物限度检查法验证方案和验证报告 *有限公司验证文件纯化水微生物限度检查法验证案题目：纯化水微生物限度检查法验证案编号：VDP-JY-01-1共 页第 页起草：日期：审核：日期：批准：日期：颁发部门：质量部生效日期：分发部门：工程设备部、质量部纯化水微生物限度检查法验证案起草、审核、批准：起草人：起草日期：审核人：审核日期：批准人：批准日期：颁发部门：质量部分发部门：质量部验证组织：验证小组名称： 纯化水微生物限度检查法验证案验证小组组 长质量部经理负责组织、实施组 员1QC主管负责验证案的起草负责检测数据的复核负责出具检验报告2QA主管负责验证案的确认负责法评价3微生物限度检验员负责
2、测试操作和操作原始记录1.验证目的2.验证人员职责3.参照标准4.验证项目容5.评价合格标准6.验证试验材料7.验证实施计划8.菌液制备9.供试液制备10.计数法验证11.控制菌检查法验证12.验证结论和评价纯化水微生物限度检查法验证案1. 验证目的：纯化水微生物限度试验采用薄膜过滤法检查。确认该法适合于纯化水细菌、霉菌及酵母菌数测定，控制菌的测定。2验证人员职责2.1验证领导小组：2、1、1负责验证案及报告的批准2、1、2组织协调验证工作2、1、3签发验证证书。2.2.项目验证小组长2.2.1.负责验证案的起草2.2.2.负责验证的协调工作，以保证本验证案的顺利实施。2.2.3.负责验证报告
3、的起草。2.2.4.负责再验证期的确认。23. 质量部23.1.负责验证案审核23.2.负责取样及对样品的检验23.3.负责收集验证记录，并加以分析后，协助项目验证小组长起草验证报告。23.4.负责验证数据及结果的审核3. 参照标准：2010版中国药典一部附录XIII微生物限度检查法。4. 验证项目容：细菌、霉菌及酵母菌计数法的验证，控制菌检查法验证。5. 评价合格标准：试验组的菌回收率和稀释剂对照组的菌回收率均不得低于70%。6. 验证试验材料：6.1. 被验证产品：品名 纯化水 取样点：（1）4T/h纯水系统二级反渗透装置进纯水箱口;(2) 4T/h纯水系统液体制剂二楼洁具间用水点；(3)
4、 4T/h纯水系统三楼固体制剂纯水箱总回水口。检验量 5ml /次 6.2. 仪器设备：6.2.1. YX.400A电热蒸汽压力消毒器6.2.2 YS840净化工作台6.2.3. 101型电热干燥箱6.2.4. SPX-250B型生化培养箱6.2.5.PYX-DUS-X型隔水式电热恒温培养箱6.2.6 303A-4型电热培养箱6.2.7 天平6.3. 稀释剂：PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液；0.9%的无菌氯化钠溶液6.4. 验证用培养基 名称批号生产厂家营养琼脂培养基营养肉汤培养基玫瑰红钠琼脂培养基改良马丁培养基改良马丁琼脂培养基 6.5. 验证用菌株：验证菌株代号（代数）来源培养基培养温度培
5、养时间（小时）大肠埃希菌营养肉汤3035金黄色葡萄球菌营养肉汤3035枯草芽孢杆菌营养肉汤3035白色念珠菌改良马丁培养基2328黑曲霉菌 改良马丁琼脂培养基23287、验证设施计划序号项目确认名称实施负责人起始和完成日期1细菌、霉菌及酵母菌计数法验证2验证结果评定、验证期确认、验证报告和发放验证证书8. 菌液制备 8.1.大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌菌悬液的制备取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜斜面培养物1白金耳接种至10ml营养肉汤培养基中，35培养1824小时。取经3536培养1824小时的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、与枯草芽孢杆菌营养肉汤新鲜培养物1ml加入到
6、9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-610-7约为50100cfuml的菌悬液备用。8.2白色念珠菌、黑曲霉菌悬液的制备取白色念珠菌的新鲜斜面培养物1白金耳接种至10ml改良马丁培养基中，25培养2448小时。取培养物1ml，加入9%灭菌生理盐水9ml，混匀，10倍稀释至10-510-6细菌数约50100cfuml的菌悬液备用。接种黑曲霉的新鲜培养物于改良马丁琼脂斜面培养基上，25培养57天至大量孢子产生。加0.9%无菌氯化钠溶液10ml将孢子洗脱。然后吸出孢子悬液，加入蒙有灭菌纱布的无菌试管中。取此孢子悬液1ml加到9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，逐管10倍稀释至10-5约为5
7、0100cfuml的菌悬液备用。9.供试品制备 供试品名称及取样点： 纯化水 取样点（1）4T/h纯水系统二级反渗透装置进纯水箱口;(2) 4T/h纯水系统液体制剂二楼洁具间用水点；(3) 4T/h纯水系统三楼固体制剂纯水箱总回水口。法建立：2010版中国药典规定纯化水微生物限度试验采用薄膜过滤法检查。但没规定取样量,由于所使用的滤膜径不大于0.45um ，直径为50mm, 规定每片滤膜上的菌落数应不超过100个。如果取样量过大,样品含菌量较多,就会造成细菌不宜分散, 点计困难; 如果取样量过少,不能有效反映样品染菌量。为此采用每滤膜取样品5ml。10.计数法验证10.1试验组 取纯化水5ml
8、，以无菌操作加入过滤器，用PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜3次，每次100ml，在最后一次的冲洗液中分别加入上述的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉菌菌液（50100cfu/ml）各1ml，平行两滤膜，过滤后，取滤膜，将其菌面朝上贴于相应培养基上培养。10.2菌液组 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌分别取1ml面液分别注入平皿中，并立即倾注营养琼脂培养基，每个面液分别制备二个平皿，置3536培养24小时；白色念珠菌、黑曲霉分别取1ml面液分别注入平皿中，并立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每个面液分别制备二个平皿，置2425培养48小时。菌落计数结果（2个平皿
9、计数取平均值）见下表菌落计数结果（cfuml）试验次数10-5稀释10-6稀释10-7稀释12122大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉10.3 供试品对照组 取纯化水5ml，以无菌操作加入过滤器，用0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜3次，每次100ml，平行两滤膜，过滤后，取出滤膜，菌面朝上贴于琼脂培养基平板上培养。细菌、霉菌及酵母菌各制备2个平皿，测定供试品本底菌数。10.4. 稀释剂试验组 取0.9%无菌氯化钠溶液300ml，以无菌操作加入过滤器，每次100ml，在最后一次的冲洗液中分别加入上述的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉菌菌液（50100c
10、fu/ml）各1ml，平行两滤膜，过滤后，取滤膜，将其菌面朝上贴于相应培养基上培养。10.5.稀释剂对照组 取0.9%无菌氯化钠溶液300ml，以无菌操作加入过滤器，平行两滤膜，减压抽干后,取出滤膜，菌面朝上贴于琼脂培养基平板上培养，平行制备2个平皿，置适宜温度培养4872h，观察结果，测定菌数。10.6. 结果见附表11、控制菌检查法验证（常规法）11.1 试验组 取纯化水5ml，以无菌操作加入过滤器，用PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，冲洗滤膜3次，每次100ml，在最后一次的冲洗液中分别加入上述的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉菌菌液（50100cfu/ml）各
11、1ml，平行两滤膜，过滤后，取滤膜，接入胆盐乳糖培养基100ml中，按相应控制菌检查法进行检查。试验结果：上述试验组检出试验菌，按此控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查。故可按常规法进行控制菌检查。12 验证结论和评价根据验证试验结果，纯化水微生物限度检查按照2010版中国药典二部附录XIII微生物限度检查法检验，细菌、霉菌及酵母菌计数可采用薄膜过滤法检查。附表1： 独立试验一 ：各试验组菌落计数（回收率%） 取样点 ： 试验时间 年 月 日 完成时间 年 月 日验证菌株平皿号菌液组菌落数(cfu)供试品对照组菌落数(cfu)试验组菌落数(cfu)稀释剂对照组菌落数(cfu)试验组菌回收率(%
12、)稀释剂对照组菌回收率(%)大肠埃希菌(培养48小时计数)12平均值金黄色葡萄球菌(培养48小时计数)12平均值枯草芽孢杆菌(培养48小时计数)12平均值白色念珠菌(培养72小时计数)12平均值黑曲霉(培养72小时计数)12平均值结论：本次试验各试验组的菌回收率和各稀释剂对照组的菌回收率均不低于70%,按标准规定, 本次试验结果符合规定。复核人(签名)： 试验人(签名)： 附表2：独立试验二 ：各试验组菌落计数（回收率%） 取样点 ： 试验时间 年 月 日 完成时间 年 月 日验证菌株平皿号菌液组菌落数(cfu)供试品对照组菌落数(cfu)试验组菌落数(cfu)稀释剂对照组菌落数(cfu)试验
13、组菌回收率(%)稀释剂对照组菌回收率(%)大肠埃希菌(培养48小时计数)12平均值金黄色葡萄球菌(培养48小时计数)12平均值枯草芽孢杆菌(培养48小时计数)12平均值白色念珠菌(培养72小时计数)12平均值黑曲霉(培养72小时计数)12平均值结论：本次试验各试验组的菌回收率和各稀释剂对照组的菌回收率均不低于70%,按标准规定, 本次试验结果符合规定。复核人(签名)： 试验人(签名)： 附表3：独立试验三 ： 各试验组菌落计数（回收率%） 取样点 ： 试验时间 年 月 日 完成时间 年 月 日验证菌株平皿号菌液组菌落数(cfu)供试品对照组菌落数(cfu)试验组菌落数(cfu)稀释剂对照组菌落
14、数(cfu)试验组菌回收率(%)稀释剂对照组菌回收率(%)大肠埃希菌(培养48小时计数)12平均值金黄色葡萄球菌(培养48小时计数)12平均值枯草芽孢杆菌(培养48小时计数)12平均值白色念珠菌(培养72小时计数)12平均值黑曲霉(培养72小时计数)12平均值结论：通过三次独立试验,证明所采用的供试液制备法及薄膜过滤法适合于纯化水细菌、霉菌及酵母菌数测定。复核人(签名)： 试验人(签名)： *有限公司验证文件纯化水微生物限度检查法验证报告题目：纯化水微生物限度检查法验证报告编号：VDP-JY-01-2共 页第 页起草：日期：审核：日期：批准：日期：颁发部门：质量部生效日期：分发部门：1、验证目
15、的2、参照标准3、验证项目容4、评价标准5、验证实施时间6、验证法7、验证结论和评价一、验证目的根据中国药典2010年版的要求，纯化水微生物限度试验采用薄膜过滤法检查。为了确认该法适合于本公司纯化水细菌、霉菌及酵母菌数计数测定，控制菌的测定。特对此检测法进行验证。二、参照标准中国药典2010版二部附录微生物限度检查法。三、验证项目容细菌、霉菌及酵母菌计数法验证，控制菌的验证。四、评价标准试验组的菌回收率和稀释剂对照组的菌回收率均不得低于70%。五、验证实施我们项目验证小组从(微生物限度检验室完成验证时间开始)开始，进行各种菌液、供试液的制备，开始验证工作。1、菌液制备 1.1大肠埃希菌、金黄色
16、葡萄球菌、枯草芽孢杆菌菌悬液的制备取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜斜面培养物1白金耳接种至10ml营养肉汤培养基中，35培养1824小时。取经3536培养1824小时的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、与枯草芽孢杆菌营养肉汤新鲜培养物1ml加入到9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-610-7约为50100cfuml的菌悬液备用。1.2白色念珠菌、黑曲霉菌悬液的制备取白色念珠菌的新鲜斜面培养物1白金耳接种至10ml改良马丁培养基中，25培养2448小时。取培养物1ml，加入9%灭菌生理盐水9ml，混匀，10倍稀释至10-510-6细菌数约50100cfuml的菌悬液备用。
17、接种黑曲霉的新鲜培养物于改良马丁琼脂斜面培养基上，25培养57天至大量孢子产生。加0.9%无菌氯化钠溶液10ml将孢子洗脱。然后吸出孢子悬液，加入蒙有灭菌纱布的无菌试管中。取此孢子悬液1ml加到9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，逐管10倍稀释至10-5约为50100cfuml的菌悬液备用。2.供试品制备 供试品名称及取样点： 纯化水 。取样点（1）4T/h纯水系统二级反渗透装置进纯水箱口;(2) 4T/h纯水系统液体制剂二楼洁具间用水点；(3) 4T/h纯水系统三楼固体制剂纯水箱总回水口。按照验证案，采用每滤膜取纯化水5ml。六、验证法（一）、细菌、霉菌及酵母菌计数法1、试验组 取纯化水5ml，
18、以无菌操作加入过滤器，用0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜3次，每次100ml，在最后一次的冲洗液中分别加入上述的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉菌菌液（50100cfu/ml）各1ml，平行两滤膜，过滤后，取滤膜，将其菌面朝上贴于相应培养基上培养。计数。2、菌液组 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌分别取1ml面液分别注入平皿中，并立即倾注营养琼脂培养基，每个面液分别制备二个平皿，置3536培养24小时；白色念珠菌、黑曲霉分别取1ml面液分别注入平皿中，并立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每个面液分别制备二个平皿，置2425培养48小时。菌落计数结果（2个平皿计数取平
19、均值）见下表菌落计数结果（cfuml）试验次数10-5稀释10-6稀释10-7稀释121212大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉3 供试品对照组 取纯化水5ml，以无菌操作加入过滤器，用0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜3次，每次100ml，平行两滤膜，过滤后，取出滤膜，菌面朝上贴于琼脂培养基平板上培养。细菌、霉菌及酵母菌各制备2个平皿，测定供试品本底菌数。4. 稀释剂试验组 取0.9%无菌氯化钠溶液300ml，以无菌操作加入过滤器，每次100ml，在最后一次的冲洗液中分别加入上述的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉菌菌液（50100cfu/ml）各1m
20、l，平行两滤膜，过滤后，取滤膜，将其菌面朝上贴于相应培养基上培养。5.稀释剂对照组 取0.9%无菌氯化钠溶液300ml，以无菌操作加入过滤器，平行两滤膜，减压抽干后,取出滤膜，菌面朝上贴于琼脂培养基平板上培养，平行制备2个平皿，置适宜温度培养4872h，观察结果，测定菌数。6.附表（二）控制菌检查法验证（常规法）试验组 取5ml的纯化水，以无菌操作加入过滤器，用PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，冲洗滤膜3次，每次100ml，在最后一次的冲洗液中分别加入上述的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉菌菌液（50100cfu/ml）各1ml，平行两滤膜，过滤后，取滤膜，接入胆盐乳
21、糖培养基100ml中，按相应控制菌检查法进行检查。试验结果：上述试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查。故可按常规法进行控制菌检查。七、验证结论和评价通过三次独立试验,证明所采用的供试液制备法及薄膜过滤法适合于纯化水细菌、霉菌及酵母菌数测定。控制菌可按常规法进行检查。本次验证各试验组的菌回收率和各稀释剂对照组的菌回收率均不低于70%,按标准规定, 本次试验结果符合规定。根据验证试验结果，纯化水微生物限度检查按照2010版中国药典二部附录XIII微生物限度检查法检验，细菌、霉菌及酵母菌计数采用平皿法检查，符合规定。附表1： 独立试验一 ：各试验组菌落计数（回收率
22、%） 取样点 ： 试验时间 年 月 日 完成时间 年 月 日验证菌株平皿号菌液组菌落数(cfu)供试品对照组菌落数(cfu)试验组菌落数(cfu)稀释剂对照组菌落数(cfu)试验组菌回收率(%)稀释剂对照组菌回收率(%)大肠埃希菌(培养48小时计数)12平均值金黄色葡萄球菌(培养48小时计数)12平均值枯草芽孢杆菌(培养48小时计数)12平均值白色念珠菌(培养72小时计数)12平均值黑曲霉(培养72小时计数)12平均值结论：本次试验各试验组的菌回收率和各稀释剂对照组的菌回收率均不低于70%,按标准规定, 本次试验结果符合规定。复核人(签名)： 试验人(签名)： 附表2：独立试验二 ：各试验组菌
23、落计数（回收率%） 取样点 ： 试验时间 年 月 日 完成时间 年 月 日验证菌株平皿号菌液组菌落数(cfu)供试品对照组菌落数(cfu)试验组菌落数(cfu)稀释剂对照组菌落数(cfu)试验组菌回收率(%)稀释剂对照组菌回收率(%)大肠埃希菌(培养48小时计数)12平均值金黄色葡萄球菌(培养48小时计数)12平均值枯草芽孢杆菌(培养48小时计数)12平均值白色念珠菌(培养72小时计数)12平均值黑曲霉(培养72小时计数)12平均值结论：本次试验各试验组的菌回收率和各稀释剂对照组的菌回收率均不低于70%,按标准规定, 本次试验结果符合规定。复核人(签名)： 试验人(签名)： 附表3：独立试验三
24、 ： 各试验组菌落计数（回收率%） 取样点 ： 试验时间 年 月 日 完成时间 年 月 日验证菌株平皿号菌液组菌落数(cfu)供试品对照组菌落数(cfu)试验组菌落数(cfu)稀释剂对照组菌落数(cfu)试验组菌回收率(%)稀释剂对照组菌回收率(%)大肠埃希菌(培养48小时计数)12平均值金黄色葡萄球菌(培养48小时计数)12平均值枯草芽孢杆菌(培养48小时计数)12平均值白色念珠菌(培养72小时计数)12平均值黑曲霉(培养72小时计数)12平均值结论：通过三次独立试验,证明所采用的供试液制备法及薄膜过滤法适合于纯化水细菌、霉菌及酵母菌数测定。复核人(签名)： 试验人(签名)： 11. 验证结论和评价根据验证试验结果，纯化水微生物限度检查按照2010版中国药典二部附录XIII微生物限度检查法检验，细菌、霉菌及酵母菌计数可采用薄膜过滤法检查。
