1、大豆分子育种研究doc 16页大豆分子育种研究(doc 16页)大豆分子育种摘要: 不同基因型的大豆子叶节在添加适宜BA 的M S 培养基上培养, 可从子叶节诱导出高频丛生芽, 并获得大量再生植株. 通过农杆菌介导法, 将深黄被孢霉6- 脂肪酸脱氢酶基因导入到栽培大豆吉林43 和黑农37品种中. 经过在含500mg鯨 卡那霉素的筛选培养基中连续筛选, 获得一批转基因植株. 经PCR 检测和DNA 分子杂交分析, 初步证明外源基因已导入并整合到大豆基因组中. 本文重点阐述了组培再生系统和基因转化系统的内在联系和不同点.型小豆；从相似系数平均值来看，半野生型小豆材料之间亲缘关系较近，而处在进化两极
2、的野生型材料之间、栽培型材料之间亲缘关系都较远；来自我国西南以及日本南部两地区的小豆材料遗传离散度较大，遗传分化系数、相似系数平均值较低。聚类分析结果表明，163 个小豆材料以遗传相似系数 0.32 为截值，可分为 8 大类，归类有较明显的地理相关性及遗传类型的趋同性。金文林，文自翔，濮绍京等，应用 分析小豆种质资源遗传多样性及遗传演化趋势，中国农业科学 2005,38(2):241-249摘要本文研究AFLP技术在大豆上的应用,在改进大豆种子DNA提取方法的基础上,比较同位素与银染检测方法的效果,筛选适宜于大豆AFLP分析的酶切和引物组合,从而建立了适用于大豆指纹图谱快速鉴定的AFLP操作程
3、序,并对我国野生大豆和栽培大豆代表性材料进行了AFLP分析。近年来,大豆种质资源研究中应用的分子标记大体可以分为两大类。一类是以分子杂交为基础的RFLP技术,另一类是以PCR反应为基础的各种DNA分子标记,包括有DAF、AP-PCR、RAPD、SSR、AFLP等技术。作为一种有效的分子标记,RFLP最先被应用到大豆遗传研究中(Apuya等1988)1。但是从建立品种指纹图谱来看,RFLP技术单个探针信息量少,鉴别效率不高2。RAPD技术以其快速简单的优点被用来鉴别大豆种质3,4,但由于所采用引物Tm值较低,扩增结果易受外界条件的影响。SSR标记在大豆种质研究中应用也较多5,6,其多态性远远高于
4、RFLP标记,但一次性检测的位点也有限。因此,发展一种既能高度揭示遗传变异多样性,又相对操作简单的分子标记,对于大豆指纹图谱研究具有重要的意义。分子标记AFLP(amplified fragment length polymorphism)是由Zabeau和Vos(1993)发明的7,8。它基于对基因组DNA进行双酶切,片段末端连接上一个接头,经一个与接头和邻接酶切位点相匹配的引物进行PCR选择性扩增,而后用变性聚丙烯酰胺凝胶分离扩增产物。这种方法结合了RFLP可靠性和PCR高效性的优点,已经成功地应用于大豆遗传图谱构建与遗传多样性研究中9,10,11。但是该方法受专利保护,分析试剂盒十分昂贵
5、,还需要同位素操作,用叶片提取DNA手续较多,也影响到分析的效率,因此有必要建立适用于大豆的优化操作程序。本研究旨在探索大豆种子提取DNA并用于AFLP分析的可能性,比较银染与同位素技术在检测效率上的相对效果,筛选适用于大豆的酶切和引物组合,完善大豆指纹分析的AFLP技术,为大豆材料真实性和纯度检验、种质亲缘关系的研究提供方法。1.2.1DNA的提取关于大豆DNA的提取,前人多采用叶片提取的方法。McDonald等(1994)12对DNA提取法进行了改进,从玉米、大豆、棉花等种子中提出质量较高的DNA。但是,作者在用该法提取大豆样品,尤其野生大豆时,由于色素及酚类、醌类等多糖类杂质较多,得到的
6、DNA呈淡红、红色,十分粘稠,溶解困难,260/280比值较低,而且降解严重,这样会影响DNA样品的酶切效果。因此,本研究在McDonald等基础上作了改进,详见结果部分。2.1大豆种子DNA提取方法的改进本研究在McDonald等(1994)12提取DNA方法的基础上,作了以下改进:(1)栽培大豆取半粒或单粒种子,野生大豆可取1-2粒种子,以确保DNA样品的纯度(2)取干种子,无须在液氮条件下研磨,即可保证DNA的完整性；(3)尽可能除尽种皮,减少种皮中所含杂质对DNA质量的影响(4)提高SDS提取液的浓度,由12%提高到4%,以增加DNA产量；(5)第一次离心采用10,000转/秒,以后离
7、心速度降为3000转/秒,以防止DNA的降解；(6)加入高浓度(3M)的盐离子(KAC),以去除多糖类及色素等杂质,对于野生大豆,还加入PVP或巯基乙醇,以防止酚类、醌类物质对DNA的降解；(7)增加酚/氯仿抽提步骤,而后再用氯仿进一步抽提,以除去杂质和多余的酚；(8)加0.2l的10g/lRNaseA,在4下过夜,以除去RNA,并进一步抽提,防止RNA对酶切的影响。本研究单粒野生大豆提取的DNA量约为3-20g,单粒栽培大豆提取的DNA量约为10-200g,而一次预扩增仅需DNA100ng左右,所以完全满足测定所需。与叶片提取方法相比较,直接从种子中提取DNA,不需发芽、光照培养、液氮研磨等
8、过程,可以提高种子的检验效率。银染法和同位素法检测的总带数相近,但同位素法多态性条带、多态性百分率较高,而银染法平均遗传多样度(Hav)和有效等位基因的数目和略高于同位素法。鉴于银染法结果与同位素基本相似,可以避免放射性同位素使用,而且经济快速,因而银染法AFLP是可以广泛应用的。不同的酶切组合和引物组合,扩增结果不相同,本实验通过比较不同酶切组合,发现EcoR -Mse 酶切时较容易找到多态性引物组合,而且具有较高的多态性。本研究还证实“3+3”引物组合用于大豆AFLP分析较为理想,同时找到了多对理想的引物组合,可以用于大豆种质的指纹分析研究。通常AFLP检测需要使用放射性同位素标记,而且,
9、一般认为,同位素法比银染法更灵敏,尤其使用33P标记效果较好14。本研究证实,用同位素33P检测所得到的带型上下较为均匀,分辨率较高;银染法带型较粗,对不同分子量的条带染色深浅不甚一致,容易出现分辨率上高下低的情况,因而需要更多的技巧。本研究通过比较还证实,银染法与同位素法除在一些弱带判别上有一定出入外,所得到的带型基本一致。在实际应用中,不同方法的检测效率是与研究者所掌握的技术水平和熟练程度紧密联系的。只要充分掌握各个技术环节,银染法可以在避免放射性污染、降低成本的同时,同样得到分辨率较高的指纹图谱。田清震，盖钧镒，喻德跃，大豆DNA扩增片段长度多态性(AFLP)研究，大豆科学，2000,1
10、9(3)：210-217摘要:利用大豆栽培品种科丰1号和南农1138-2杂交得到的重组近交系,通过、和4种分子标记的遗传连锁分析,构建了包含24个连锁群、由792个遗传标记组成的大豆较高密度连锁图谱,该图谱覆盖2320.7,平均图距2.9。标记的多态性较高,在基因组中的位置相对稳定,可以作为锚定标记,有利于连锁群的归并和不同图谱的比较整合;而标记对于增加图谱密度效率较高,但其容易出现聚集现象,从而造成连锁群上有很大的空隙()。另外,在连锁群中有21.7%的分子标记出现偏分离。该图谱为基因定位、比较基因组学和重要农艺性状的定位等研究打下了基础。分子标记连锁图为进行植物基因组的结构分析和比较提供了
11、有力的工具。较高密度的分子图谱已有效地应用于数量性状基因定位()、图位克隆基因、比较基因组学研究和分子标记辅助育种等研究中。因此,对于具有重要经济价值并得到广泛研究的大豆作物来说,发展一张高密度的遗传连锁图将具有重大意义。遗传作图中最常用的分子标记有、和标记。然而,对大豆而言,有两个缺点:一是的多态性程度不高,二是大豆的大多数标记为多个位点。标记虽然过程简单,但多态性低且重复性较差。微卫星标记()多样性高而位点基本单一稳定,所以利用标记作为锚定标记,则有助于图谱的连锁群或染色体的归并和不同连锁群的整合。技术结合了和的特点,在一次反应中能同时检测多个遗传位点,在大豆中平均一个泳道有50120条带
12、,信息量非常丰富,并且标记能够填补其他标记之间的空隙。所以适合用于构建饱和的分子遗传图谱研究。大豆遗传图谱的发展已经有了10多年的历史。1988年等首次用标记构建大豆遗传图谱,但是此图谱的标记仅为11个,组成4个连锁群1。随后,等用.种间杂交作为构图群体,构建了一个图谱,包括由130个标记组成的26个连锁群,覆盖大豆基因组12002。和将来源于不同群体的各种标记整合到一张连锁图谱上3。他们用栽培大豆杂交的近等基因系再杂交的2代群体构建了含有13个经典标记、7个同工酶标记、110个标记和8个标记的遗传图谱。通过使用一套锚定的探针,根据这些位点在和.作图群体中的分离情况,确定分子标记和经典标记图谱
13、间的连锁群同源性。后来等利用 101437.654构建的含有300个单株的群体,构建了饱和度较高的遗传图谱,该连锁图谱含有28个连锁群,长度为3441,共有165个标记、25个标记和650个标记。尽管经常成簇排列,相对于其他分子标记,更均匀地分布在所有连锁群中4。等将606个单一位点的标记整合到连锁图谱上,这套标记作为锚定标记,将3个不同群体的连锁图谱整合为一个公共图谱5。该图谱包括1423个不同类型的分子标记,其中有606个标记、689个标记、79个标记、11个标记、10个同工酶标记和26个经典标记。由于标记是单一位点,不仅增加了遗传图谱中分子标记的数目,同时根据不同图谱上的公共的标记,使连
14、锁群数目减少到20个,这与大豆染色体数目相吻合。如今在所有图谱上共检测出2950个位点。3.1图谱构建构建高密度遗传图谱是大豆基因组研究的重要内容之一。等5应用606个标记补充已构建的3张图谱使其所包含的单一位点的总数达到1423个,包括606个,689个,79个,11个,10个同工酶和26个经典性状标记,建立20个保守连锁群,但仍有几个小连锁群( ,54,24)不能整合进去。我们在构建高密度大豆遗传图谱时,主要借助于标记进行锚定连锁群,利用标记加密图谱。标记由于其优点是可以用来进行连锁群的锚定,使图谱间的比较易于进行。虽然构建遗传图谱的效率比较高,但是由于平均每对引物在两个亲本间可以检测到6
15、5条带,平均可产生10.6条多态带,在进行不同图谱比较或者用于筛选分子标记时,应用起来比较不便。最近,由于分析软件的出现和配套技术的完善已经可以做到在1周的时间内,对70000条带进行基因型分析12。如果将不同的群体的亲本同时进行标定,这样可以准确地将信息量非常大的整合到公共连锁图谱上,这对于建立高密度的公共连锁图谱是非常有益的,也有利于基因的精细定位。目前番茄和大麦等作物的整合的图谱密度已经低于113,14。本研究构建的大豆分子遗传图谱有24个连锁群,共计792个标记,是国内最为致密的图谱。目前大豆遗传图谱构建的缺憾是还没有将大豆的连锁群与对应的染色体联系起来。这主要是因为大豆的基因组是复杂
16、的古四倍体起源。大豆多基因家族含有两个独立亚组的发现也证明了这一点15。不过随着大豆全套(20个)初级三体的应用,这20个连锁群与大豆20条染色体的对应关系将很快能够确定。3.2偏分离现象偏分离现象普遍存在17。高密度分子连锁图谱的构建,为在整个基因组中调查表现偏分离的位点提供了可能18。有人认为由于遗传搭车效应,与影响偏分离的遗传因子紧密连锁的分子标记则表现有严重偏分离16。目前还有另外两种假说解释偏分离现象,一种认为是配子体选择的结果,2群体中偏分离的比例为021(亲本1正常亲本2)。另外一种观点认为是花粉选择的结果,这种模式的偏分离位点在群体中以011的比例分离13。张德水等6利用栽培品
17、种(.)长农4和半野生种(.)新民6的2代群体以及刘峰等7利用同一对亲本的群体进行了大豆分子图谱构建和基因组分析,研究表明绝大多数偏分离标记都偏向于栽培品种长农4,雄配子体选择是标记偏分离的主要影响因素。在本研究中,虽然偏分离的标记数高达21.7%,但没有发现明显偏向于某一亲本的趋势。这里的偏分离可能主要与遗传搭车效应有关,当然也不排除个别配子体选择现象。3.3标记聚集()和标记空隙()构建遗传图谱都期望标记间距尽可能小,并且标记在基因组上应均匀分布。但是,我们构建的连锁图谱上的分子标记,在每个连锁群上的分布并不是均匀的,很多标记聚集在一起,形成12个集聚区,相应地增加了聚集区以外的标记间距,
18、从而形成比较大的空隙区域()。分子标记的聚集现象在番茄13、大麦14、玉米19、甜菜20、马铃薯21和大豆4等作物中都有报道。据推测在番茄、大麦和玉米上+标记的聚集区域是着丝点附近的异染色质区,但是在大豆、甜菜和马铃薯上还不能肯定这种聚集区是在异染色质区。和22发现异染色质区的联会丝复合体上的重组节频率比常染色质的低。等13发现番茄图谱上+标记在聚集区中的比例与异染色质区中的比例(77%)是一致的。在我们构建的连锁图谱上,69%的标记存在于聚集区中。+标记的聚集现象可能与异染色质区重组率低有关。所以利用对甲基化敏感的限制性内切酶代替,可以在非甲基化的常染色质区识别酶切位点,而不是在异染色质区。
19、这样虽然+标记虽然少,但是要比+标记分布均匀,+标记在水稻群体中分布比较均匀23。因此,要根据不同研究目的选择的限制性内切酶。在大多数研究中,特别是定位,+标记更合适。但是这种标记系统往往受基因型和植株发育的影响,因为基因组甲基化程度随着基因型和植株发育状态不同而变化。在基因精细定位和图位克隆基因时,要根据基因处于异染色质区还是常染色质区,来选择合适的标记。例如番茄抗病基因 9位于常染色质区,精细定位采用+标记24。而位于异染色质区的番茄抗病基因图位克隆采用了+标记25。在等5构建的大豆图谱上,也发现了若干标记和标记的密集区,如:.图谱中的1连锁群,上部16个标记中,13个为标记,相邻的有11
20、个和18个标记组成的两个密集区,中间被8个标记(其中包括7个标记)隔开。由于标记均来自基因组克隆,因为是对甲基化敏感的内切酶,这些克隆大多为单拷贝或低拷贝,可能并不是随机分布于整个基因组中,因此他们推测,标记密集区很有可能与位点而不是位点有关。在本图谱中有些连锁群仍存在分子标记分布不均匀现象,甚至有的存在大于20的空隙。这主要与图谱上的大多数标记聚集现象有关。另外,也可能是因为所用亲本之间在某些染色体区段缺乏多态性,某些染色体结构发生了大的变异,导致在这一段染色体上分子标记不能用连锁规律定位。等5在构建高密度大豆遗传图谱时也遇到同样的问题,为了在空隙间找到标记,他们利用空隙两边的作探针,筛选库
21、,但是在空隙间很难找到合适的标记。因此发展来源于不同杂交组合的作图群体,以及发展包括微卫星标记,标记,标记等新型分子标记都是填补图谱中的缺口,构建覆盖整个基因组的遗传图谱的有效手段。3.4基因定位构建高密度的遗传图谱和筛选与基因紧密连锁的分子标记是图位克隆基因的前提。大豆连锁群上含有多个抗性基因,如抗花叶病毒病基因1、抗花生斑点病基因1和抗蚜虫根腐病基因326,最近又报道大豆抗细菌枯病基因1也定位在这个区域5。因此,大豆连锁群的构建和抗性基因密集区的精细作图对于图位克隆抗性基因将具有重要意义。另外,我们将抗大豆花叶病毒基因的标记定位在连锁群、控制花色的基因和绒毛有无基因定位于1连锁群。抗花叶病
22、毒基因和定位正在进行中。吴晓雷，贺超英，王永军等，大豆遗传图谱的构建和分析，遗传学报，2001，28(11):10511061王晓丹，吕慧颖，张敬等，以PCR为目的的大豆叶片DNA提取方法的比较研究，分子植物育种，2004,2(6)：891-894PCR 反应的性质决定其对模板DNA 的纯度要求不十分严格。因此, 许多实验室发展了适合于不同作物的模板DNA 快速分离法1- 。用叶盘PCR 法筛选转化体, 省去不必要的报告基因序列, 以减少有害的变异, 是植物转化实用化的发展趋势4 。我们用花粉管通道法进行大豆基因转移获得了大量待筛选的种子, 用特异引物通过 PCR 技术初步筛选转化体, 具有简
23、便、快速、经济等优点。但由于样品数量大, 模板DNA 的分离成了决定筛选效率的关键环节。尤其是如何解决大批量小样品的研磨问题至关重要。经过反复探索, 用自动螺钉旋具改制成微量样品研磨器, 在 1. 5m l的微量离心管内研样, 解决了大豆鲜组织的大批量小样品的无损耗快速研磨问题, 并简化了DNA 提取的程序, 收到了很好的效果。本文报道具体的操作程序和结果。1.微量样品研磨器的改制用中国机械进出口总公司生产的自动螺丝批(螺旋棘轮螺钉旋具)改制微量样品研磨器。将产品配带的三个十字花形的转头在砂轮上磨一下, 使之与微量离心管的下部形状(圆锥形) 相吻合。2.样品的制备 取单株收获的大豆种子, 每株
24、 4- 5 粒, 放入 50m l 离心管内发芽(将离心管挤牢在饭盒等容器内, 每次可处理数十份), 28两到三天。取下胚轴和胚根 0. 1- 0. 2g(或生长在大田的大豆幼苗的未展开叶 0. 1- 0. 2g)放入 1. 5m l微量离心管内, 将离心管放入液氮中冻几秒钟后置工作台上, 将微量研样器的转头放入离心管并迅速按动手柄数次。样品研好后将转头取出, 用镊子或硬毛刷剔出转头沟槽中的样品, 用蒸馏水涮洗两次, 然后用干净纱布擦净转头(或更换转头)可进行下一个样品的操作。研好的样品放入冰中或- 20备用。3.提取缓冲液成分 试验采用两种提取缓冲液: SDS: 100mM T ris- H
25、Cl(pH 8. 0) , 500mM N aCl, 50mM EDTA , 1. 25% SDS。 CTAB: 1. 0% W V CTAB, 0. 7M N aCl, 10mM EDTA , 50mM T ris- HCl(pH 8. 0) ,0. 1% 巯基乙醇。4.DNA 提取程序 a. 每管加入 500ul 在 65水浴中预热的 SDS 提取缓冲液, 混匀; b. 放入 65- 80水浴中, 颠倒离心管数次, 放出管内冷气, 保温 5- 20 分钟; c. 每管加入 150ul 5M KAC, 混匀, 冰浴 10 分钟并不断混匀; d. 4, 10000 RPM , 离心 10 分钟
26、; e. 将上清移入另一离心管内, 加入等体积的氯仿异戊醇(24 : 1) , 快速颠倒离心管直至形成乳状液不再很快分层; f. 4, 8000 RPM 离心 5 分钟; g. 小心将上清移入另一离心管中, 加入 2 倍体积的冷乙醇, 混匀, 放置 5- 10 分钟; h. 4, 10000 RPM 离心 10 分钟; i 倒掉上清, 用 70% 乙醇洗管壁和沉淀两次, 将离心管倒置在纸巾上, 干燥 20- 30分钟; j. 每管加入 200ul TE 缓冲液溶解沉淀。1微量样品研磨器的效果中国机械进出口总公司出品的螺旋棘轮螺钉旋具的转头的直径和长度与 1. 5m l的离心管最为匹配, 用其改
27、制的微量样品研磨器效果最好。快速按动手柄, 转头的转速可达300 RPM 左右, 转头上的十字沟槽与离心管壁形成较大研磨力, 使经液氮冷冻的样品很容易被研碎。研磨一个样品只需 0. 5- 1 分钟。大豆下胚轴经液氮冷冻后较硬, 如用国产离心管容易破裂, 需用进口离心管进行研磨。叶片、幼苗等不太硬的样品可用国产离心管,以降低成本。 本文的大豆模板DNA 分离程序, 只用氯仿异戊醇抽提一次, 并且提取时间可缩短到5 分钟, 是目前最简单、快速的方法。用该程序每天可处理近百个样品(取决于离心机转头的孔数)。程序中两个关键步骤是: 氯仿抽提时应反复颠倒离心管(30 秒钟以上)直至停止时形成的乳浊液不很
28、快分层; 最后一步DNA 溶解时, 体积不能太小(100- 200ul)。体积太小, 溶解困难, 并影响 PCR 扩增的效果。我们用 0. 1- 0. 2g 的样品量, 最后溶解体积为 200ul, 再稀释 10- 50 倍用作模板, PCR 扩增的效果很好。周思君，小样品大批量大豆模板DNA 快速分离法，大豆科学，1999，18(4)：318-321应用从6000多份大豆种质资源中筛选出的21个抗大豆花叶病毒病的品种或品系及7个感病的品种或品系,选用20个随机引物,对总DNA进行了随机扩增。有18个引物扩增得到了稳定的RAPD图谱,OPH-06和OPH-10未能扩增到RAPD产物。扩增出的片
29、段分子量在0.6-4.6Kb之间。随机引物扩增出的条带数在5-17条之间,共扩增出165个条带,品种间相同的条带有104个,多态性条带有61个,多态性条带占37%。这20个引物可分为1无扩增产物的引物;2扩增产物无多态性的引物;3扩增产物多态性低于15%的引物;4扩增产物多态性在15%-30%之间的引物;5扩增产物多态性在30%-50%之间的引物;6扩增产物多态性超过50%的引物。依据遗传距离进行聚类分析的结果表明,这些材料可以明确地聚成5组。各组内姊妹系衍生出的品种或品系首先聚在了一起,其次有一定血缘关系的聚在了亚组里。另外,各组内或亚组内的品种或品系在地理分布上具有一定相关性。3RAPD反
30、应20个10-mer随机引物购自Operon公司,所用引物的编号为OPH-01-OPH-20,其碱基序列参见Operon10-merkitsproductinformation。所用随机引物的G+C含量为60-70%。扩增反应在25l体积中进行,其中模板DNA2l(5ng/l),随机引物2l(50mol/L),2.5mMdNTPs2l,10xbuffer2.5l,TaqDNA聚合酶1u,超纯水16.5l,上面覆盖20-30l液体石蜡。热循环条件为:94变性1分钟,35退火2分钟,72延伸2分钟,5个循环。接着940.5分钟,351分钟,721.5分钟,40个循环,然后72延伸10分钟。扩增产物在1.4%琼脂糖凝胶,1TAE缓冲
