1、第5章+遗传图谱第5章 遗传图谱遗传图谱是应用遗传学技术构建能显示基因以及其它序列特征在基因组上的位置的图。遗传学技术包括杂交育种实验、人类家族的系谱分析。1 遗传图谱的标记1.1 基因基因是首先被使用的标记。最初的遗传图谱是在20世纪初对果蝇等生物构建的，使用基因作为标记。一个遗传性状必须以两种替换形式或表型存在才能用于遗传学分析。如孟德尔首先研究的豌豆茎的高或矮。每种表型是由相应基因的不同等位基因所决定的。起初只有那些能通过视觉区分的基因表型能用于研究。比如，第一张果蝇遗传图显示了负责身体颜色、眼睛颜色、翅膀形态等基因的位置，这些表型都可在低倍显微镜下或肉眼观察果蝇而看到。早期觉得这种方法
2、很精确，但遗传学家们很快发现，只有有限的几种可见表型的遗传可用于研究，而在许多情况下，由于不止一个基因影响一个物理特征，分析起来并不太容易。例如，到1922年，有超过50个基因被定位在4条果蝇染色体上，而其中9个基因负责眼睛的颜色，想在此领域有所贡献的每一个初涉者必须首先学会辨别果蝇眼睛的颜色是红、淡红、朱红、石榴石红、康乃馨色、肉桂色、深褐色、猩红色或深红色。为了使基因图更加全面，有必要找到一些比可见的性状更多、更明确而且更简单的性状。解决的方法是应用生物化学方法区分表型。这对于微生物与人类尤为重要。细菌与酵母只有为数很少的可见性状，因此这类生物的基因作图只能依赖于生化表型。人类以血液分型为
3、代表的生化标记研究从20世纪20年代就开始了。血液分型研究不仅包括如ABO系统的标准血型，还有血清蛋白以及人类白细胞抗原（HLA系统）等免疫蛋白的等位基因可变体。这些标记相对于可见表型的一个巨大优点是其相关基因往往为复等位基因。HLA-DRB1基因至少有59个等位基因，而HLA-B至少有60个。这正是与人类基因作图相关的。与在果蝇或小鼠等生物中建立的杂交实验不同，人类基因遗传的数据只能通过检查一个家族中各成员的表型来获得。如果对所研究的基因而言，所有的家族成员都为纯合子，就得不到有用的信息。这对于只有两个等位基因的基因较为常见。因为婚配偶然地发生于同一个等位基因纯合子个体之间。而当所研究的基因
4、有60个而不是2个等位基因时，这就很少见了。1.2 DNA标记基因是非常有用的标记，但绝不是理想的。特别是对于像脊椎动物及开花植物的较大基因组来说，仅依赖基因作出的图不够精细。即使是每个基因都在图上定位，情况依然如此，这是因为在这些生物的基因组中，基因散在分布而且它们中间有大的间隙，此外基因中仅有一部分以比较容易区分的等位形式存在，从而使这一问题更为严重。因此遗传图谱就不够全面。故我们需要其它类型的标记。除基因外用于作图的DNA特征称为DNA标记（DNA marker）。与基因标记一样，DNA标记必须有至少两种等位形式。有三种序列特征满足此要求：1.2.1限制性酶切片段长度多态性（RFLP）R
5、FLP（restriction fragment length polymorphism）是第一种用于研究的DNA标记。限制性内切酶限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）是结合在DNA分子的特定序列上，并在识别序列或其附近将双链DNA分子切开的酶。限制性内切酶有三种：类和类的切割位点和识别序列不存在严格的关系，而类限制性内切酶则在识别序列或非常接近的位置进行切割。用限制酶处理一个DNA分子时，即产生限制片段。如类限制酶EcoR(从大肠杆菌中分离得到)只在6核苷酸5-GAATTC-3处切割。这种序列特异性意味着用一种限制酶处理一种DNA分子总会产生同样的片段。但对于
6、基因组DNA来说，并不总是这样。这是因为有些限制位点具多态性，以两种等位形式存在。一种等位形式有正确的限制位点序列，能被酶切开；另一等位形式的序列有改变，从而该限制位点不能被识别。后者的结果使在限制性核酸内切酶处理后，两个相邻的限制片段仍然连接在一起，从而导致了多态性。现在已分离到2500种以上的类限制性内切酶，其中有300多种已在实验室种使用。人类基因组中大约有105个RFLP。 限制性片段长度多态性的检测 为了量化RFLP，有必要在很多不相关片段的背景中判定一个或两个限制片段的长度。这不是一个小问题，核酸内切酶如的识别序列长6bp，那么大约每46（4096bp）能切割DNA一次，因此如果切
7、割人基因组DNA，可产生近750 000个片段。所以必须采用一定技术检测特定的限制片段。目前检测RFLP的方法主要有Southern杂交和PCR。Southern杂交(Southern hybridization)它是用于对RFLP的第一种技术，限制性内切核酸酶酶切产生的DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳而相互分离，待研究的片段是用于探针杂交检测。其步骤如下：第一步：酶切第二步：凝胶电泳凝胶电泳是分离不同长短DNA分子和RNA分子的标准方法。电泳是带电分子在电场中的运动。带负电荷的分子（如DNA）向阳极移动，带正电荷的分子则向阴极移动。电泳技术起初是在水溶液中进行的，但对DNA分子的分离来说，这样并
8、不适用，因为在水溶液中影响迁移率的主要因素是分子形状和它所带的电荷。而大多数DNA分子性状相同（线性），虽然其所带电荷依赖于它的长度，但由此产生的电荷差异不足以产生有效的分离。当电泳在凝胶中进行时，情形就有所不同，此时分子形状和电荷的影响降低，而分子长度成为决定迁移率的最重要因素。因为凝胶形成一个网状孔道，DNA分子从中穿过到达阳极。较短的分子受孔道的阻碍较小，能够比较长的分子更快地穿过凝胶。从而不同长度的分子在凝胶上形成不同的条带。制备琼脂糖凝胶时，将适量琼脂糖粉末混入缓冲液中，加热使其溶解，然后将熔化的凝胶注入到有机玻璃板上，板四周用胶带封闭以防止渗漏。在胶中插入梳子以形成加样孔。待凝胶凝
9、固后，将其置于缓冲液中进行电泳。加样前，向DNA样品中加入一种或两种已知迁移率的染料，便于电泳过程中观察进度。电泳完毕后，将凝胶浸泡于溴化乙锭溶液中使DNA带显现，因为溴化乙锭可嵌入DNA分子碱基对间，并在紫外线照射下发出荧光。第三步：Southern印迹由于琼脂糖凝胶易碎，不便于随后的分子杂交操作，所以需要将凝胶上的片段转移到尼龙膜上。第四步：分子杂交杂交探针是一个被标记的DNA分子，其序列与我们希望检测的靶DNA互补，它们能形成碱基配对，因此能通过检测探针上的标记发出的信号来确定靶限制性片段在膜上的位置。探针可以是合成的寡核苷酸或克隆的DNA片段。为检测RFLP，探针通常是覆盖多态限制位点
10、的克隆的DNA片段。将膜置于含标记探针以及一些缓冲液的玻璃瓶中，将玻璃瓶缓慢旋转数小时以使探针有充分时间与其靶DNA杂交，洗膜以去除杂交的探针，然后检测信号。探针通常是放射性标记的，信号通过放射性自显影（autoradiography）来检测。放射性自显影图上看到的带是与探针互补的片段。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）DNA分子选定区域的指数级扩增。反应时，将靶DNA分子与核苷酸、两条合成的寡核苷酸引物（primer）以及耐热DNA聚合酶混合。两条引物与待扩增区域的靶DNA两端复性，从而能够合成合适的寡核苷酸。PCR可持续进行3040个循环。一个初
11、始分子可以扩增出成千上万个相同的片段，相当于几微克。因为它比Southern杂交分析更快速，现在更常用。在DNA经限制性核酸内切酶处理之前，先将含RFLP的DNA区段扩增成多拷贝。然后RFLP可通过用溴化乙锭对载有限制性片段的琼脂糖凝胶染色而看到。1.2.2 简单序列长度多态性（SSLP）SSLP(simple sequence length polymorphism)是一系列不同长度的重复序列，不同的等位形式含有不同数目的重复单位。与RFLP不同，由于每个SSLP可能有很多不同的长度变异体，所以它可以是多等位形式。SSLP有两种类型：小卫星（minisatellite）：也称为可变数目的串联
12、重复（variable number of tandem repeat,VNTR）。重复单位长度为几十个核苷酸。微卫星或简单串联重复（simple tandem repeat, STR）：它的重复单位长度短得多，通常为二、三或四核苷酸单位。微卫星比小卫星更常用作DNA标记。这有两个原因：第一，小卫星在基因组中并不是均匀分布，只是更常见于染色体末端。用地理学术语来讲，相当于试图用灯塔图来找出一个岛中央得路一样。而微卫星在基因组中的分布更便于用来定位。第二，用于长度多态性分型的最快的方法是通过PCR，而PCR分型对于300bp以下的序列更快也更准确。但大多数小卫星由于其重复单位相对较长，而且在一个
13、序列中常有许多重复，因此长度大于300bp。典型的微卫星含有1030个长度不超过4bp的重复，因此它们更适合于PCR分型。在人类基因组图上，已发现大约104个微卫星。1.2.3 单核苷酸多态性（SNP）基因组中存在单个的点突变（point mutation），且数量极大，有些也可产生RFLP，但许多并不能，这是因为它们所处的序列不能被限制性内切核酸酶所识别。在人类基因组中，据认为有200 000个以上的SNP(single nucleotide polymorphism)位于基因内，而可能有10倍于这个数字甚至更多的SNP位于非基因的DNA中。SNP的优点是它的数目庞大，而且对SNP分型所用的
14、方法不需凝胶电泳。这非常重要，因为已证明凝胶电泳很难实现自动化，所以使用它的检测方法相对缓慢而且费力。SNP以寡核苷酸杂交分析（oligonucleotide hybridization analysis）为基础，故其检测更快速。寡核苷酸是在试管中合成的通常小于50个核苷酸的短单链DNA分子。在适当的条件下，一个寡核苷酸与另一个DNA分子仅在可形成完全的碱基配对结构时才能杂交。如果有一个错配，寡核苷酸上就有一个位置不能形成碱基对，则不能杂交。因此寡核苷酸杂交能区分一个SNP的两个等位形式。通过DNA芯片可以筛选到SNP。DNA芯片DNA芯片是一块面积为2cm2或更小的硅片，以高密度排列方式携带
15、有许多不同的寡核苷酸，芯片密度可以达到每平方厘米一百万个寡核苷酸探针，探针位于芯片表面，可以是合成的寡核苷酸或其它短DNA分子（如cDNA）。待测DNA用荧光标记后加到芯片的表面，用荧光显微镜观察杂交情况，显示荧光信号的位置即表示该处的寡核苷酸与待测DNA发生了杂交。2. 遗传作图的方法2.1 连锁分析遗传图谱是应用遗传学技术构建能显示基因以及其它序列特征在基因组上的位置的图。遗传学技术包括杂交育种实验、人类家族的系谱分析。遗传作图技术都是以遗传连锁（genetic linkage）为基础。2.1.1 连锁20世纪早期的遗传学家就认识到基因位于染色体上，每条染色体作为一个完整的单位遗传，换句话
16、说，如果一对基因位于同一条染色体上，那么它们就物理地连接在一起，应该一起遗传。但遗传学家发现只有极少数几对基因表现为完全连锁。成对的基因或者像不同染色体上的基因那样独立遗传，或者只表现为部分连锁（patial linkage）：有时一起遗传，有时不一起遗传。2.1.2 交换部分连锁的原因在减数分裂过程中同源染色体联会形成二价体，这二价体中每条染色体含有两条染色单体。在减数分裂末期产生4个配子，每一个染色体拷贝进入4个配子中的一个。在二价体中，染色单体可以发生断裂以及DNA片段的交换，这称为交换或重组。现在我们考虑100个相同的细胞减数分裂的结果。如果从未发生过交换，那么产生的配子为：200个A
17、B和200个ab。这是完全连锁，在减数分裂中基因A和基因B作为一个单位。但如果一些核中发生了A和B之间的交换，那么这对等位基因将不能作为一个单位遗传。如果在100个细胞的减数分裂中有40个出现交换，将产生下列的配子：160个AB、160ab、40个Ab、40个aB。这时是不完全连锁，即部分连锁。除了两个亲代基因型（AB、ab）以外，还出现了重组基因型（Ab、aB）的配子。其重组率为重组率重组型配子数/配子总数（4040）/400202.1.3 遗传作图在理解了减数分裂中的交换可以解释部分连锁后，摩尔根的学生Arthur Strurtevant提出一个假设：交换是一个随机事件，在一对并列的染色单
18、体的任何位置发生交换的机率是相同的。如果这种假设是正确的，那么相邻的两个基因由于交换而分开的机率将低于距离较远的两个基因。进一步说，基因间因交换而去连锁的机率与它们在染色体上的距离成比例。因而重组频率是衡量两个基因间距离的单位。计算出不同基因对间的重组频率，就可以构建出显示基因在染色体上相对位置的图，即连锁遗传图。 遗传连锁图上的距离单位为厘摩（cM）,1cM=1%重组率。习题：下表是果蝇X染色体上一些基因的重组频率，请根据这些数据绘制遗传连锁图。基因重组率黄体(y)和白眼(w)1%黄体(y)和辰砂眼(v)32.2%黄体(y)和小翅(m)35.5%辰砂眼(v)和小翅(m)3%白眼(w)和辰砂眼
19、(v)30%白眼(w)和小翅(m)32.7%白眼(w)和斜截翅(r)45%辰砂眼(v)和斜截翅(r)26.9%答案：现在已经知道交换随机性的假设并不完全正确。染色体上一些称为重组热点（recombination hotspot）的区域比其它区域更容易发生交换，这意味着遗传图上的距离并不一定能显示两个标记间的物理距离。但是，连锁分析通常能正确推断出基因的顺序，而且对基因间距离的估计的精确度足以构建出可为基因组测序计划提供框架的遗传图。2.2 连锁分析方法对于不同类型的生物，所采用的连锁分析的方法不同 杂交实验：适用于果蝇、小鼠、拟南芥等； 系谱分析：适用于人类； 细菌的连锁分析：适用于不发生减数
20、分裂的原核生物。2.2.1 杂交实验遗传作图的关键是确定减数分裂所产生的配子基因型。其方法有两种：一、直接检查配子例如一些微小真核生物（如酿酒酵母）产生的配子可以长成单倍体细胞的克隆，其基因型可以通过生物化学方法判断。应用DNA标记也可以对高等真核生物配子直接进行基因分型，例如可以对一个个体的精子的DNA做PCR，从而进行RFLP、SSLP、SNP的分型。但精子分型很费力，因而不是常规的方法。二、测交（test cross）分析假设Aa和Bb是果蝇2号染色体上的两对等位基因，现在通过测交分析计算它们的遗传距离。测交分析亲本的基因型：1双杂合子，即AB/ab2双纯合子，即ab/ab实验的目的是推
21、断双杂合子亲本产生的配子的基因型，以计算重组体的比例。对于双纯合子无论是亲本型还是重组型配子，都具有ab基因型。结果双纯合子的减数分裂对后代的基因型没有影响。这意味着从二倍体后代的基因型可以确定地推断出双杂合子亲本来源配子的基因型，可以对一次减数分裂进行直接分析，从而计算出重组频率。如果使用显性与隐性的基因标记，则双纯合子亲本必须是双隐性纯合子（即ab/ab），但如果使用共显性的DNA标记，那么双纯合子亲本就可以为任意组合的纯合等位基因（例如AB/AB、Ab/Ab、aB/aB、ab/ab）。原理如下：2.2.2 系谱分析对于人类，不可能为了作图的需要而预先选择亲本基因型以设计特定的杂交。用于计
22、算重组率的资料只能通过检测现存家庭连续的几代成员的基因型获得。这意味着只能获得有限的资料而且经常很难解释。因为人类的婚姻很少导致测交，而且经常由于一个或多个的家庭成员死亡或不愿合作而不能获得他们的基因型。如下图所示，是一个具有一种遗传病的家庭的系谱。遗传病常用作人类的基因标记，疾病状态相当于一个等位基因，健康状态相当于另一个等位基因。为了对这一个遗传病进行基因定位，为此研究了这一基因于微卫星标记M的连锁情况。现存的家庭成员中有4个M的等位形式M1、M2、M3、M4，那么有多少子女是重组体呢？巴黎人类多态性中心（CEPH）收集家庭的培养细胞系，它包括4个祖父母和外祖父母及至少8个第二代子女。CE
23、PH可以为那些愿意将研究成果送CEFP中心数据库的研究人员提供这一标本用于DNA标记作图。2.2.3 细菌的遗传作图细菌等单倍体生物不发生减数分裂。所以需要设计其它的方法以诱导细菌DNA同源片段间的交换。下列三种方法可用于将DNA片段从一个细菌转移到另一个细菌。（1）接合（conjugation）：两个细菌形成物理性接触，DNA从一个细菌（供体）转移到另一个细菌（受体）。转移的DNA可以是供体细胞染色体的一部分或全部拷贝，或整合在质粒上的染色体DNA片段，后者称为附加体转移（episome transfer）。（2）转导（transduction）：是指通过噬菌体将小片段DNA（可达50Kb左
24、右）从供体转移到受体菌。（3）转化（transformation）：是指受体细胞从环境中摄取供体细胞释放的DNA片段（通常不大于50Kb）。DNA转移之后，必须发生双交换，才能将来源于供体细菌的DNA整合到受体细胞的染色体上。否则受体细胞分裂时转移的DNA就会丢失。生化标记经常用于细菌遗传连锁分析。显性或野生型（wild type）表型具有某种生化特征（如合成色氨酸的能力、对抗生素敏感），隐性或突变型具有其互补性状（例如不能合成色氨酸、抗生素抗性）。基因转移通常建立在具有野生型等位基因的供体株与具有隐性等位基因的受体株之间，通过观察受体株是否获得了所研究基因的生化功能从而判断有无基因的转移。在
25、接合作图中，供体DNA作为连续的线性转移到受体，通过对野生型等位基因进入受体进行计时而确定基因的位置。由于转移的DNA片段较短（小于50Kb）,所以转导和转化作图只能用于距离较近的基因，两个基因同时转移的机率依赖于它们在细菌染色体上的距离。习题：有5个大肠杆菌Hfr品系其DNA转移到F细菌中去的基因顺序如下：Hfr品系转移顺序1BKARM2DLQEOC3OEQLDN4MCOEQLDN5RAKBN请画出这些基因在染色体上顺序。答案：2.3 人类遗传图谱 人类基因组计划的最初目标之一是作出密度为每1Mb基因组就至少有一个标记的遗传图。这个目标在1994年已经实现。人类遗传图谱使用的标记主要是微卫星标记，人类基因组计划将5264个标记分配到染色体的2335个位置上，位置的数目比标记的数目少是因为一些微卫星靠得太近而不能分开，从而定位在同一个位置。对于整个图来说，平均密度是599kb一个标记。最密的是17号染色体，每495kb一个标记，最疏的是9号染色体，每767kb一个标记。
