1、IL33TLRs信号通路在A549细胞上皮间质转化中的作用IL-33/TLRs信号通路在A549细胞上皮-间质转化中的作用摘要目的 观察生长转化因子1（TGF-1）对上皮来源的A549细胞增殖及相关细胞标记物的影响，探讨IL-33/TLR4信号通路在上皮来源的A549细胞上皮-间质转化中的作用。方法 培养A549细胞，用5ng/ml的TGF-1刺激A549细胞；在不同时间点，MTT法检测TGF-1对A549细胞增殖的影响；Real-time PCR方法检测IL-33/TLR4信号通路中关键因子IL-33，TLR4、PI3K基因的表达改变；western blot方法检测-SMA， E-cad，
2、 p-AKT蛋白的动态表达。结果 （1）.MTT结果显示，各组细胞生长良好，随时间的延长，细胞数量逐渐增多，但加入5ng/ml TGF-1刺激12h，24h，48h后，A549细胞的增值与对照组相比，无统计学意义（P0.05）。（2）.在5ng/ml的TGF-1刺激下，A549细胞与对照组相比，E-cad蛋白表达量逐渐下降（P0.05），而-SMA的表达呈逐渐上升的趋势（P0.05）。提示，A549细胞上皮细胞特征逐渐减少，而间质细胞特征逐渐增多，即A549细胞发生了上皮-间质转化。（3）. Real-time PCR结果显示，经5ng/ml的TGF-1处理的A549细胞与对照组相比，在12h
3、、24h、48h，IL-33/TLR4信号通路的关键基因IL-33、TLR4均呈先升高后下降的趋势，在24h时表达量最高，差异有统计学意义(P0.05)。（4）.western blot结果显示，经5ng/ml的TGF-1处理的A549细胞，随时间的延长，在12h、24h、48h，p-AKT的表达量逐渐升高，与对照组相比，差异有统计学意义(P0.05）.(2)With the stimulation of the TGF1(5ng/ml).The expression of the epithelial cell marker protein E-cad decreased gradually
4、（P0.05）.But the expression of -SMA showed an increasing tendency（P0.05）.The results suggested that the characteristics of the epithelial cells decreased gradually. But the characteristics of the mesenchymal cells increased gradually. Epithelial mesenchymal transition happened in the A549 cells.(3)Th
5、e results of the Real-time PCR showed that the expression of the IL-33 and TLR4 in the IL-33/TLR4signalpathway of the A549 cells treated by TGF1 (5ng/ml) were first increased and then decreased In 12h,24h,48h compared with the control group. Theexpressionin the 24h was the highest,the difference was
6、 statistically significant(P0.05).(4) The results of the western blot showed that the expression of the p-AKT in the A549 cells which is treated by TGF1 (5ng/ml) increased gradually compared with the control group with theextension of time(in 12h,24h,48h).The difference was statistically significant
7、(P0.05).Conclusion:(1) After the stimulation of the TGF1 in the A549 cells. The expression of the epithelial cell marker protein E-cad decreased gradually. But the expression of the Mesenchymalcellmarker protein -SMA increased gradually. The results showed that epithelialmesenchymal transitionisindu
8、ced by TGF1 in A549 cell. It confirmed that epithelialmesenchymal transition is closely related topulmonary fibrosis.(2) In the processof epithelialmesenchymal transition induced by TGF1 in A549 cell. The expression of IL-33, TLR4, p-AKT increased, It was inferred that in the process of the epitheli
9、al cell injury and the excessive repair of the mesenchymal cell, the over expression of IL-33 and TLR4 played a role in IL-33/TLR4 signaling pathway.(3)The expression of the p-AKT increased gradually with the extension of the time. So in the process of epithelialmesenchymal transition, PI3K/AKT sign
10、aling pathway is activated. TLR4 can bind to PI3K andthe activation of TLR4depended on IL-33.It was inferred that theactivation of the PI3K/AKT pathwaywas associated with the overexpression of IL-33.(4) With the extension of time, IL-33 and TLR4 increased first and then decreased. Combined with our
11、previous study, we speculated that when lung was injured, IL-33 played a role of warning. It started the repair of lung tissue. With the extension of the time, the effect of the IL-33 decreased. TLR4 which is the downstream of the IL-33 alsoincreased firstly and then decreased,andthe activation of P
12、I3K/AKT pathway presents thecascade. The downstream moleculesgraduallyactivated,ultimately involved in the processof pulmonary fibrosis.Keywords:epithelialmesenchymaltransition(EMT);Interleukin-33(IL-33);Tolllike receptors(TLRs);phosphatidylinositol -3-kinase(PI3K).第一章 绪论1 间质性肺病的概述及研究进展间质性肺疾病（ILD，in
13、terstitial lung disease），又称为弥漫性肺实质性疾病(diffuse parenchymal lung disease，DPLD)，是由多组疾病组成的一类不同性质的疾病，包括200多个病种。基本病理变化为弥漫性肺实质、肺泡炎症和间质纤维化，临床上主要表现为X线胸片弥漫性浸润阴影、进行性加重的呼吸困难、限制性通气障碍、弥散功能降低和低氧血症。目前国际上将ILD/ DPLD分为四类：(1)已知病因的间质性肺疾病：如药物，结缔组织疾病相关的肺部病变等；(2) 少见的间质性肺疾病，如慢性嗜酸性粒细胞性肺炎、朗格罕斯细胞肉芽肿病、淋巴管平滑肌瘤病、肺出血-肾炎综合征即Goodpas
14、ture 综合征等； (3) 肉芽肿性间质性肺疾病，如外源过敏性肺泡炎、结节病、Wegenerr肉芽肿等； (4)特发性间质性肺炎（idiopathic interstitial pneumonia，IIP）：寻常性/特发性即UIP/IPF、脱屑性间质性肺炎（DIP）、非特异性间质性肺炎（NSIP）、淋巴细胞性间质性肺炎（LIP）、急性间质性肺炎（AIP）、呼吸性细支气管炎性间质性肺病（RB-ILD）、隐源性机化性肺炎（COP）1。特发性肺纤维化（IPF，idiopathic pulmonary fibrosis）是最常见的肺间质疾病，也是肺间质纤维化的主要原因。2011年美国胸科学会（ATS
15、），欧洲呼吸学会（ERS），日本呼吸学会（JRS），拉丁美洲胸科学会（ALAT）共同发表了关于IPF的最新研究概况的循证指南，为IPF的诊疗提供了更加完善的方案。IPF是一种不明原因的、慢性、进展性的肺部弥漫性疾病，病变部位局限于肺组织，主要表现为呼吸困难和肺功能的障碍。该指南提出诊断IPF时，需排除其他已知原因的引起的ILD，同时强调了高分辨率CT（HRCT）在IPF诊断中的重要性2。疾病的发展是一个动态过程，在临床上需结合症状、体征、职业史、用药史、环境因素、影像学检查、肺功能、病理活检、支气管肺泡灌洗等相关检查，对IPF进行全面细致的诊断。由于诊断技术的不断提高，IPF的检出率不断增加，
16、但目前的治疗手段并未获得满意的疗效。在药物治疗治疗方面，指南提出目前尚无有明确疗效的药物。糖皮质激素、秋水仙碱、环孢素A、免疫抑制剂、乙酰半胱氨酸、干扰素-等传统药物的治疗效果尚不肯定，对于愿意接受药物治疗的诊断明确的IPF患者，指南推荐的治疗方案是乙酰半胱氨酸+硫唑嘌呤+泼尼松，抗凝治疗，乙酰半胱氨酸，吡非尼酮；非药物治疗在一定程度上能够缓解部分患者病情，如长期氧疗、肺康复训练、肺移植等2。IPF明确诊断后，患者的中位生存时间约为35年，预后极差，患者生活质量明显下降，因此对IPF的发病机制、治疗方案有待深入研究。IPF病理改变的特点为肺组织内变化不均，分布不均，可见正常组织，间质的炎症，纤
17、维增生，蜂窝肺等病理表现共存，主要位于两肺的周边部和基底部。病变早期以肺泡炎为主，同时伴少量的纤维增生；中期肺泡炎症的消退，但出现大量成纤维细胞的增殖，胶原纤维的增生；后期肺组织纤维化的形成。IPF的发病原因尚不清楚，可能与长期接触粉尘、毒物、病毒感染、吸烟、自身免疫、遗传因素、环境污染和放射线等有关。目前，全世界IPF患者有一千余万人，在我国的发病率也有35/10万每年，且呈逐年升高的趋势。发病后的平均存活时间为2.53年.据统计，男性发病率为20.2/100,000，女性发病率为13.2/100,000，且发病率呈上升趋势。美国一项研究表明，在十年（19922003）内死于特发性肺纤维化的
18、人数已经上升了50%3-5。流行病学调查结果显示，IPF的男性发病率较女性高（1.5-1.7:1），吸烟、粉尘及木屑等环境是其危险因素，仅0.5-3.7%的患者可能与遗传因素有关8-9。目前尚无治疗IPF的特效药物，虽然肺移植是唯一能延长IPF患者生存期的措施，但因供体极少、且价格昂贵、移植后生存率低6-7等原因，不能广泛应用于临床。尽管对其开展研究已有数十年之久，但是仍未找到明显的致病因素，尚不能完整陈述其致病机制。经典的发病机制认为，IPF可能是炎症、组织损伤、修复持续叠加和恶性循环的结果。各种致病因素包括炎症，组织损伤等，可损伤肺泡上皮细胞、毛细血管内皮细胞与上皮下基底膜，启动成纤维细胞
19、募集、增生和分化，引起肺泡中巨噬细胞活化，淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等炎性细胞浸润，促进炎症介质和细胞因子的释放，导致早期肺损伤；在随后肺纤维化的形成过程中，炎症细胞释放的炎性介质与多种细胞因子起到重要作用10 。因此，认为慢性损伤和纤维增生修复最终导致了肺纤维化，起主导作用的细胞主要是肺泡上皮细胞和活化的成纤维细胞（即肌成纤维细胞）。肺腺癌细胞来源的A549细胞在纤维化过程中呈现的变化与人肺泡上皮细胞相似，因此本试验选用A549细胞为研究对象。2 IL-33/TLRs-PI3K信号转导通路 白细胞介素-33（IL-33）是近年来新发现的细胞因子，2005年被鉴定为属白介素-1类家族新
20、成员11。IL-33广泛表达于许多组织，但其表达亦受细胞类型的限制12。人类和小鼠的IL-33 mRNA在胃、肺、脊髓、脑、皮肤出表达水平较高，而在淋巴组织、脾、胰腺、肾脏和心脏出现表达较低。在细胞水平上IL-33主要出现在间质细胞包括上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞等13，而且，IL-33在呼吸道、消化道等与外界接触的黏膜系统具有更高的表达水平。IL-1 和IFN- 刺激后，正常人皮肤成纤维细胞、肺成纤维细胞、肺泡上皮细胞以及在支气管平滑肌细胞中均出现了IL-33 mRNA 的高水平表达。牛肺泡蛋白沉积症以及皮癣皮肤样品中IL-33 mRNA 的表达呈现显著升高的趋势 14。 向志
21、光等15对IL-33转基因小鼠的肺组织检查发现，肺组织存在着炎症性病理改变，在气管和血管周围的炎性病灶出现嗜酸性粒细胞等炎性细胞的浸润，杯状细胞增生，粘液在呼吸道积聚。IL-33信号通路的靶细胞主要包括Th2细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞等，嗜酸性粒细胞可以驱动和激活炎症信号，可以认为IL-33参与了肺部炎症反应。在外伤或感染引起组织损伤时，作为警报素的IL-33分泌增多，启动组织的修复反应16。Prefontaine D等在动物实验中研究发现哮喘者气道平滑肌的IL-33表达量高于无哮喘者，特别是在严重哮喘发作时更明显17，且国外学者发现抗IL-33抗体能防止小鼠哮喘的进展18，表
22、明IL-33在哮喘的发病过程中发挥了一定的作用。 本课题组前期通过小鼠IPF模型证明肺纤维化过程中存在IL-33/ST2信号通路的异常激活，IL-33表达量升高，在第14天表达达到最高，提示IL-33可能参与了肺纤维化过程19。同时，在细胞层面本课题组研究结果提示IL-33能与ST2受体结合，激活IL-33/ST2信号转导通路，在肺纤维化的发病机制中起了重要作用20。 Toll样受体（Toll like receptor,TLRs）是一类进化高度保守的病原分子识别受体，是连接天然免疫和特异性免疫的跨膜信号转导受体，属型跨膜蛋白, 要包括胞外区、跨膜区、胞内区三部分。胞外区富含亮氨酸重复序列，其
23、功能是作为模式受体可以检测到微生物的病原体相关模式分子，跨膜区富含半胱氨酸，主要负责信号的传导，胞内区与白细胞介素-1的胞内区相似，简称TIR结构，该结构与其他含有TIR结构的蛋白相互作用，并招募MyD88分子等蛋白。迄今为止，哺乳动物体内已发现13种TLRs，即：TLR1-TLR13。TLR4是其中一种，在肺部分布较多，与许多肺部疾病有的发生发展有关。TLR4介导的信号通路分为MyD88依赖途径和TRIF依赖的信号途径。研究发现TLR4在肝纤维化、肾纤维、胆囊纤维化中发挥了重要作用，在肺纤维化的作用少有研究。经典的TLR4/MyD88信号通路为研究的热点 21-23。 近年来发现除MyD88
24、经典信号通路外，MyD88还可以募集PI3K，形成TLR4/PI3K-AKT信号通路。PI3K/AKT信号通路主要发现于各种肿瘤疾病，能够抑制细胞的凋亡而促进细胞的增殖。肺纤维化的形成与肺成纤维细胞凋亡不足有关，有学者发现PI3K/AKT信号通路的抗凋亡促进增殖的作用在肺纤维化疾病的发病机制中起了作用24-25。TLR4与ST2同属白介素-1受体超家族，有极其相似的TIR结构，可以作为IL-33的受体，结合后激活IL-33/TLR4信号通路，进而发挥作用，用IL-33刺激肺泡巨噬细胞后，TLR4受体有增高的趋势26。1.3 本研究的目的、方法、意义及技术路线设计1.3.1 研究目的 通过体外实
25、验，以TGF-1刺激上皮来源的A549细胞，观察其对细胞增殖及相关细胞标记物的影响，探讨IL-33/TLRs信号通路在A549细胞上皮-间质转化（epithelialmesenchymaltransition，EMT）中的作用机制。1.3.2 研究方法 采用细胞生物学和分子生物学研究方法。具体技术方法包括细胞培养，MTT比色法，Real-time PCR，Western blot等。1.3.3 研究意义 目前国内外对于IL-33在肺纤维化方面的研究较少，在本实验旨在通过TGF-1诱导型肺泡上皮来源的A549细胞EMT过程，制备细胞层面的肺纤维化模型，探讨IL-33/TLR4信号通路与肺纤维化之
26、间的关系，从而为肺纤维化寻求新的治疗靶点提供理论基础。1.3.4 实验设计流程图第二章IL-33/TLRs信号通路在TGF-1诱导A549细胞上皮-间质转化中的作用1材料与方法1.1仪器光学显微镜日本Olympus公司台式低速离心机江苏海门市其林贝尔仪器制造公司台式冷冻温控低速离心机, 5702 RH德国eppendorf公司电热恒温水浴箱江苏金坛市医疗仪器厂超净工作台苏州尚田洁净技术有限公司Mini-Protean III蛋白电泳仪美国Bio-Rad公司TY-200S脱色摇床金坛市医疗仪器厂小型台式高速冷冻离心机，5417R型德国Eppendorf公司台式高速离心机美国THERMA公司CO2
27、恒温细胞培养箱德国Forma公司紫外凝胶成像仪Ultrospec2000德国SYNGENE公司蛋白电泳转移装置美国Bio-Rad公司凝胶成像及分析系统美国Gene公司核酸检测仪德国Eppendorf公司ABI2720普通PCR仪美国Applied Biosystem 公司MX3000荧光定量PCR仪美国Bio-Rad公司Typhoon 9000扫描系统美国GE公司1.2试剂及材料DMEM培养基、胰蛋白酶、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)均购自WISENT公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天公司，TGF-1购自Perotech公司，鼠抗人-平滑肌肌动蛋白(-smooth muscle actin,-SMA)抗体，兔抗人E钙粘蛋白（E-cadherin，E-cad）抗体，ECL显色试剂盒均购自武汉博士德公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，GAPDH多克隆抗体均购自SANT CRUZ公司。DMSO购自CALBIOCHEM公司，MTT购自Sigma公司。Trizol试剂购自Invitrogen公司，逆转录试剂盒及荧光定量试剂盒均购自TaKaRa公司。1.3主要溶液及成份实验主要溶液及其配方如下所示：溶液 成分Tris-
