1、分子生物实验指导实验1 大肠杆菌感受态细胞的制备【实验目的】掌握制备大肠杆菌感受态细胞的方法。【实验原理】体外连接的重组DNA分子导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、增殖和表达。细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。CaCl2法是目前实验室常用的制备感受态细胞的方法，其原理是使细菌处于0、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性发生改变，外源DNA附着于细胞膜表面，经42短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物。本实验以JM109菌珠为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态。转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。利用pBS-T质粒转化制备的感受
2、态菌，可用于所制备感受态菌的转化鉴定。pBS-T质粒携带有氨苄青霉素，可使接受了该质粒的受体菌具有了氨苄青霉素抗性，将经过转化后的受体细胞经过适当稀释，在含氨苄青霉素的平板培养基上培养，只有转化子才能存活，而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡。【实验内容与方法】1感受态细胞的制备（1）从新活化的JM109菌平板上挑取单菌落，接种于5ml LB液体培养基中（不含Amp），37振荡培养12h左右，至对数生长期，将该菌液以1:1001:50转接于100ml LB培养基中，37振荡培养23h（OD600约0.20.4）。（2）将菌液冰浴10min后，转入离心管中，于4离心4000rpm
3、，10min，去上清，收集菌体。 （3）. 用10ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2悬浮细胞，冰浴1530min。（4）04，离心4000rpm，10min。（5）弃上清液，每50ml初始培养物加入2ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置30min。（6）制备好的感受态细胞悬浮液可在冰上放置24h内直接用于转化实验，也可加入1/10高压灭菌甘油, 置-70冻存。2感受态(JM109)转化鉴定(无菌操作) 1 取感受态细菌100l，加入pUC18（或pBR322）质粒(0.3mg/ml)10ul混匀。2 冰浴30min后,42水浴热休克2min，再于冰浴2mi
4、n,加入LB液体培养基0.5ml, 37振荡培养40min。3分别取菌液30100ul加到含Amp的LB固体培养基平皿上， 用三角玻璃刮刀铺板室温放置2min，然后倒置放入37恒温培养箱培养过夜,观察是否有菌落。4结果分析：在培养基平板上应可以观察到转化子形成的菌落。【实验准备】1LB培养基 取胰蛋白胨2g, 酵母提取物1g, 氯化钠2g, 加水160mL溶解后用1mol/L氢氧化钠调pH至7.0, 定容至200mL，高压灭菌。2固体培养基 取胰蛋白胨2g, 酵母提取物1g, 氯化钠2g, 琼脂粉1.2g, 加水160mL溶解后用1mol/L氢氧化钠调pH至7.0, 定容至200mL，高压灭菌
5、。临用前将固体培养基融化后倒入平皿中, 待凝固后备用。30.1mol/L CaCl2 取CaCl2 1.11克加双蒸水定溶至100mL，然后用0.22m微孔滤膜过滤除菌。【注意事项】1. 实验中所用的器皿均要灭菌，以防止杂菌和外源DNA的污染。2. 实验过程中要注意无菌操作，溶液移取、分装等均应在无菌超净工作台上进行。3. 应收获对数生长期的细胞用于制备感受态，OD600不应高于0.6。4. 制备感受态细胞所用试剂如CaCl2等的质量要好。 5. 整个实验一定要在冰浴条件下操作，温度时高时低会影响转化效率。642热处理很关键，温度要准确，转移速度要快。【思考题】1 何谓感受态细胞？2制备感受态
6、细胞时需注意什么？实验2 DNA的转化及阳性克隆的筛选【实验目的】学习DNA体外重组技术及转化方法了解蓝白斑实验筛选转化子的原理和方法。【实验原理】外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这种重新组合的DNA叫做重组子。DNA在体外的连接重组是基因工程操作的核心技术之一，其本质是一个酶促反应过程。即在一定的条件下，DNA连接酶催化两个双链DNA片段的5端磷酸和3端羟基之间相互作用，形成磷酸二酯键的过程。常用的DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。其中T4噬菌体DNA连接酶对底物的要求低，能更有效地连接DNA的平末端，应用更广泛。T4噬菌体DNA连接酶需要镁离子和A
7、TP作为辅助因子，在一定的温度和pH条件下进行连接反应。体外连接的重组DNA分子必须导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、增殖和表达。本实验利用pUC18作为载体，经T4 DNA连接酶作用，将外源基因插入其多克隆位点，构建重组质粒，转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中，利用蓝白斑实验筛选出转化子。【实验内容与方法】(1) 将冻存的感受态细胞置于冰上，缓慢解冻；(2) 加入待转化的质粒DNA，轻轻混匀，冰浴30 min；(3) 42 热激90 s；(4) 立即置冰上5 min；(5) 加入无抗性的800 l LB液体培养基，37 缓慢震荡活化1 h到1.5h；(6) 活化好的菌体室温5 000
8、 r/min，5 min离心；(7) 弃上清，用200 l没有抗性的LB液体培养基吹打悬浮菌体，蓝白筛选时，向悬浮的菌液中加入16 l 50 mg/mL IPTG和40 l 20 mg/mL X-gal；然后将全部液体涂布于含有相应抗生素的LB固体培养基上；超净工作台上，将培养皿口半开，等培养基表面的液体完全蒸发后再完全盖好培养皿；(8) 37 倒置培养至菌体适当大小时，大约12-16 h，再进行下一步实验。【实验准备】1载体DNA，外源DNA2T4 DNA连接酶310T4 DNA连接酶缓冲液4感受态细菌5LB液体培养基6LB固体培养基平皿（含amp）7X-gal8IPTG【注意事项】1根据具
9、体情况调节酶的用量。平端连接效率比粘端连接低得多，因而应加大酶的用量。2正确调整载体DNA和外源DNA之间的比例有助于获得高产量的重组产物。一般外源DNA的摩尔数应控制在载体DNA摩尔数的310倍。实验3 DNA的限制性酶切反应【实验目的】掌握DNA限制性内切酶酶切的基本原理。【实验原理】限制性内切酶能特异地识别、结合于一段被称为限制性酶序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类，其中类限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA技术的基本工具酶。绝大多数类限制酶可识别长度为4至6个核苷酸的回文序列，其切割位点在识别序列中, 有的在对称轴处切割双链DN
10、A, 产生平末端的DNA片段; 有的切割位点在对称轴一侧, 产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端。 【实验内容与方法】1）以鉴定为目的的酶切在无菌的1.5 mL Eppendorf 管中加入：10 buffer 1 l质粒DNA 1 l限制性内切酶 0.2 l（10 U/l）加入dd H2O至总体积 10 l37 温育2-4 h，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，注意：质粒是以1.5 mL菌液所提质粒用10 l ddH2O溶解所得的。2）以回收酶切产物为目的的酶切在无菌的1.5 mL Eppendorf管中加入：10 buffer 5 l质粒DNA 3-10 l限制性内切酶 1-2 l（1
11、0 U/l）加入ddH2O至总体积 50 l37 温育过夜，通过琼脂糖凝胶电泳回收目的片段。【实验准备】1pBS-T质粒2Hind 酶及其酶切缓冲液3EcoR I 酶及其酶切缓冲液【注意事项】(1) 限制性内切酶需保存于-20，操作时应将酶保持在冰浴中，避免长时间置于高温中。(2) 在酶切反应中，应最后加入酶，尽量减少室温接触机会。(3) 加样时吸头垂直进入试剂管，避免碰到管壁，加酶时吸头深入不可过深。每加完一样要换一个吸头，同时在已加的样品前做个记号以防止错加或漏加，避免污染。(4) 注意酶的用量，加入的酶量按1-3U/ug DNA计算，酶的体积应低于反应总体积的10%，以避免酶液中甘油干扰
12、反应。酶量过大时，有产生星号活性的可能，即在识别序列以外的位点进行切割。(5)酶解消化反应温度及时间根据该酶使用说明书而定。【思考题】1酶切时应注意什么？2. 如果一个DNA酶解液在电泳后发现DNA未被切动,可能是什么原因？蓝白筛选的原理实验材料介绍1）载体质粒和转化受体菌株：实验所使用的载体质粒DNA为pBS,转化受体菌为E. coli DH5菌株。E. coli DH5菌株带有-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。载体质粒DNA pBS上带有-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。(这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏lacZ的阅读框架,不
13、影响其正常功能。)在各自独立的情况下,pBS和DH5编码的-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在pBS和DH5融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的-半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫-互补。2）实验用显色方法实验中使用X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)和IPTG(异丙基硫代-D-半乳糖苷)而非直接使用-半乳糖。X-gal 以及 -半乳糖 均为 -半乳糖苷酶底物，但是X-gal不能诱导-半乳糖苷酶操纵子。实验中使用IPTG以诱导-半乳糖苷酶操纵子。X-gal在-半乳糖苷酶作用下生成深蓝色产物。 实验原理1
14、）初步筛选载体质粒DNA pBS上带有Ampr 基因而外源片段上不带该基因,故转化受体菌后只有带有pBS DNA的转化子才能在含有Amp的LB平板上存活下来;而只带有自身环化的外源片段的转化子则不能存活。此为初步的抗性筛选。2）蓝白筛选 当外源片段插入到pBS质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变, 表达蛋白失活, 产生的氨基酸片段失去-互补能力, 含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。而没有重组质粒的转化子产生-互补，在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(异丙基硫代-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。 实验干扰在实际操作中,蓝白筛选出现
15、是浅蓝色重组子的原因是：插入小片段时，质粒仍可以表达有缺陷N-末端a肽与B连互补形成活力有缺陷的半乳糖苷酶 重组子形成浅蓝斑。即而出现假阴性。实验4 植物基因组DNA的提取一、实验目的掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。二、实验原理通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴
16、化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。三、实验材料水稻幼叶四、主要试剂配方2% CTAB抽提缓冲溶液: CTAB 4g NaCl 16.364 g 1M Tris
17、-HCl 20ml( PH8.0) 0.5M EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌, 冷却后0.2-1% 2-巯基乙醇 （400ul）氯仿-异戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再加4ml异戊醇，摇匀即可。五、实验步骤1.植物基因组DNA的提取提取缓冲液（CTAB Buffer）：CTAB 2（w/v）Tris-HCl（pH 8.0） 100 mMEDTA（pH 8.0） 20 mMNaCl 1.4 M提取步骤：(1) 将CTAB Buffer放于65 水浴中预热，（大量提取则是同时将50 mL离心管置于冰上预冷）；(2) 将新鲜的叶片，无菌水洗后剪成小段，
18、约0.15 g，放到1.5 mL EP管中，EP管再开口放到液氮中，迅速用烧过的1 mL枪头捣碎（大量提取则是取1 g叶片在液氮中迅速研磨成粉末）；(3) 向EP管中加入2%的预热的CTAB缓冲液600 l，再加入巯基乙醇10 l至终浓度1%（v/v），迅速置于65 水浴1h，每隔5 min颠倒混匀；（大量提取则用在液氮中预冷过的药匙迅速把磨碎的样品转移至预冷的50 mL离心管，立即加入10 mL预热的CTAB Buffer；同时加入巯基乙醇至终浓度1%（v/v），在65 水浴中轻轻摇动1 h）；(4) 加入等体积的氯仿:异戊醇（24:1，v/v），室温下颠倒离心管约100次（气体过多时开盖放
19、气），保证样品与溶液充分作用；室温12 000 r/min，15 min（大提则是6 000 r/min离心15 min）；(5) 将上清转移至另一个1.5 mL离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀后静置10 min。（大提则是加入至少2/3体积的异丙醇，同时加入NaAc至终浓度为0.1 M（每10 mL上清中加入7 mL异丙醇，580 l 3 M NaAc），轻轻旋转混匀，-20 沉淀1-2 h）；(6) 用弯曲的Tip头挑出团状DNA并转移至1.5 mL Eppendorf管中，6 000 r/min离心10 min，除去残余液体；若无絮状物质出现或者絮状物质不易挑出则可以5 000 r/m
20、in 离心5 min；(7) 用预冷的70%乙醇（900 l）和0.1 M KAc/HAc pH 6.0（100 l）洗涤2次，低速离心（6 000 r/min，10 min或13 000 r/min，5-10 min）除去残余液体；(8) 用预冷的无水乙醇浸泡DNA沉淀5 min，12 000 r/min离心5-10 min，除去上清，吸除管壁上残余的乙醇，于37 干燥约15 min；(9) 用TE溶解干燥的DNA，加入RNase A至终浓度20 g/mL，37 过夜；若大提基因组则继续以下步骤，小提基因组则到此步就结束；(10) 将DNA悬浮液转移到15 mL具盖离心管中，加入2 mL T
21、E、1 mL 10 M NH4Ac和8 mL预冷的无水乙醇，轻轻混匀（如果此时管中小气泡不够多，说明提取的DNA量不多，需离心沉淀DNA）；(11) 用弯曲的Tip头挑出团状DNA并转移至1.5 mL EP管中，用预冷的无水乙醇浸泡，于1 2 000 r/min离心5 min；(12) 尽可能除去管中多余液体，37 干燥5-10 min；用ddH2O重新溶解干燥的DNA；(13) 用紫外分光光度计测量DNA的浓度，用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，-20 保存备用。2. DNA质量检测 琼脂糖电泳检测，原理和方法见实验二。六、 注意事项 （1）叶片磨得越细越好。 （2）移液器的使用。
22、（3）由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。思考题：1. 本实验中所用到的各试剂的作用是什么? CTAB, 氯仿, 异丙醇, 75%乙醇, EDTA2提取基因组DNA的方法有哪些？各有何优缺点？实验5 多聚酶链式反应( polymerase chain reaction, PCR) 基因扩增及琼脂糖凝胶电泳检测一、 实验目的 通过本实验学习PCR反应的基本原理，掌握PCR的基本操作技术以及琼脂糖凝胶电泳技术。二、 实验原理PCR用于扩增位于两端已知序列之间的DNA区段，即通过
23、引物延伸而进行的重复双向DNA合成。基本原理及过程如下：PCR循环过程中有三种不同的事件发生：（1）模板变性；（2）引物退火；（3）热稳定DNA聚合酶进行DNA合成。1 变性：加热使模板DNA在高温下（94-95）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。2 退火：在体系温度降至37-65，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，使引物与模板链3端结合，形成部分双链DNA，即退火阶段。3 延伸：体系反应温度升至中温72，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5到3方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。上述3步为一个循环
24、，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过2530个循环后DNA可扩增106109倍。典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两条合成的DNA引物、耐热DNA Taq聚合酶。琼脂糖凝胶电泳的原理：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时
25、的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度与DNA的含量成正比。用肉眼观察，可检测到5 ng以上的DNA。三、实验材料及相关试剂 基因组DNA，基因特异性引物，PCR扩增相关试剂，等四、实验步骤1模板DNA的抽提：实验一所得的水稻基因组DNA。2PCR操作 (在冰上操作)： （1）PCR反应混合液的配制：反应体系25 L, 在无菌的0.2 mL离心管中按下
26、列操作程序加样：以质粒或提取的基因组为模板，按顺序加入以下试剂，建立20 l PCR反应体系：试剂（Reagent）体积（Volume，l）ddH2O13.010 PCR buffer2dNTP Mix (2.5 mmol/L each)2cDNA2上游引物（10 M）1下游引物 (10 M)1Taq DNA polymerase (5 U/l)0.5Total20（2）将反应混合液混匀, 然后每个PCR管中分装24 L反应混合液，再加1 L模板DNA，最后加1滴石蜡油，防止水分蒸发, 然后稍离心。（3）将PCR管放到PCR热循环仪中，按下列程序开始循环：94 4 min (预变性) 94 3
27、0 sec, 60 30 sec, 72 2 min 72 7 min 35个循环（4）注意事项由于PCR灵敏度非常高，所以应当采取措施以防反应混合物受痕量DNA的污染。a. 所有与PCR有关的试剂，只作PCR实验用，而不挪作它用。b. 操作中所用的PCR管、离心管、吸管头等都只能一次性使用。c. 每加一种反应物，应换新的枪头。3PCR产物的检测： 琼脂糖浓度（1.2%）；EB浓度（5 l / 100 ml TBE）（1）制胶（以150 mL为例） a. 称取1.8 g 琼脂糖，加入150 ml 的TBE缓冲液（pH 8.0），摇匀，用电子天平称三角瓶的总重量。 b. 电炉上加热，至琼脂糖完全
28、溶解；然后在天平上加蒸馏水至原重量; c. 用凝胶将制胶板两端封好，插入适当的梳子，将溶解的琼脂糖（约50），倒入其中，直至厚度为46 mm（如有气泡要把气泡赶出），在室温下冷却凝固(约30 45 min)； d.将制胶板置于电泳槽中，小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。 （2）点样 a. 将2.0 l 溴酚蓝加入到PCR产物中，然后稍微离心； b. 每孔点样10.0 l，蓝色样品混合物将沉入点样孔下部。（3）电泳 打开电源开关，调节电压至35 V/cm(约100 V)，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约1小时后即可观察。（4）染色 将电泳好的凝胶放入含EB的水溶液中, 染色15-20分
29、钟。（5）观察将电泳好的胶置于紫外透射检测仪上，戴上防护观察罩，打开紫外灯，可见到橙红色核酸条带，根据条带粗细，可粗略估计该样品DNA的浓度。如同时有已知分子量的标准DNA进行电泳，则可通过线性DNA条带的相对位置初步估计样品的分子量。（6）注意事项a. 煮胶时，胶液的量不应超过三角瓶容量的1/3，否则易溢出。 b. 煮好的胶应冷却至50左右时再倒，以免制胶板变形，并减少漏胶的机会。c. 倒胶注意厚度（4-6 mm），充分凝固后再拔出梳子，以保持齿孔形状完好。也可待胶稍凝固后，放入4冰箱10多分钟，以加速胶的凝固。d. 加样前赶走点样孔中的气泡，点样时吸管头垂直，切勿碰坏凝胶孔壁，以免使带型不
30、整齐。e. 一般情况下不必每点一个样品都换枪头，吸电泳缓冲液洗几次即可再点下一个样品。凝胶中含有EB，切勿直接用手接触胶，废弃胶应集中处理，勿乱丢。思考题：1 PCR反应液中主要成分是哪些？在PCR反应过程中各起什么作用？2 为什么在PCR反应过程中，使用三个不同的温度变化？3 用PCR扩增目的基因，要想得到特异性产物需注意哪些事项？实验6 RT-PCR（设计性实验）实验设计目的：掌握RT-PCR的基本原理； 了解利用RT-PCR分析目的基因表达的方法。RT-PCR原理：1、 提取RNA，进行反转录，然后以cDNA为模板进行PCR；2、 在一定范围内，PCR产物的亮度与cDNA为模板的浓度成正比；3、 根据PCR产物的亮度变化，可推测目的基因在mRNA水平上的表达量的变化趋势。研究课题：在研究烟草抗花叶病毒（TMV）过程中，从烟草叶片中克隆到一个cDNA片段，已完成DNA序列的测定。现提供烟草种子、TMV及相关的RT-PCR试剂，拟利用RT-PCR技术分析该基因在TMV侵染烟草过程中的表达模式，从而推测该基因在烟草抗TMV过程中可能具有的功能。实验设计要求：要求给出比较详细周全的实验方案，可以是技术路线的形式，但不要求一一列出具体的实验步骤。重要提示：1、 如何处理相关的实验材料以分析目的基因在时间维度上的表达模式？2、 如
