1、基因工程的主要技术原理,由于提取DNA的目的、种类、所用的生物、组织材料、实验条件等不同，DNA的提纯有很多方法。其中最常用的是碱抽提法。,第一节 DNA的提取与纯化,大肠杆菌基因组DNA,plasmid DNA,The genomic DNA of E.coli:a single circular double-stranded DNA,with the contour length about 850 times longer than the cell.,Genomic DNA,一、质粒DNA的提取,闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；,（1）原理,1.碱抽提法提取质粒DNA
2、,DNA双链,变性,DNA单链,复性,强碱,中性,染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。,变性,原理：是基于染色体DNA与质粒DNA的变性 与复性的差异而达到分离目的.当PH12.6时，染色体DNA与质粒 DNA的变性.当PH7时，质粒DNA复性，溶解在溶液中.而染色体DNA不能复性，形成缠 连的网状结构，离心后沉淀下来.,（2）所用的试剂作用,溶菌酶,能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的-1，4糖苷键。在碱性条件（pH8）下有活性。,葡萄糖,增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力（震荡
3、）的作用而降解。,EDTA,Mg2+、Ca 2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。,NaOH-SDS,NaOH：强碱，提供pH12的碱性条件，使DNA双链变性。SDS:溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白SDS”复合物，使蛋白质（包括DNA酶）变性沉淀。,冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到4.8。用来中和NaOH变性液，使DNA复性。,高浓度的NaAc有利于变性的大分子（蛋白质、DNA、RNA等）沉淀。,用于沉淀DNA。,乙醇,DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。,NaAc-HAc缓冲液,RNase A,降解RNA渣滓。以免提取后的DNA中含有小分
4、子的RNA。,TE缓冲液,DNA保存液。由Tris-HCl和EDTA配制。,Tris-HCl不含金属离子（不同于磷酸缓冲液或硼酸缓冲液），有利于以后操作；EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。,蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。但苯酚会残留在DNA溶液中。（现多用各种商品化的层析柱纯化DNA)。,酚-氯仿,选用,以上试剂有商业试剂盒；也可以自己配制。,（3）碱抽提法提取质粒DNA的步骤,Solution I 的配制：,使用“溶液”溶解细菌细胞壁。,第一步：溶菌,50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA，4-5mg/ml溶菌酶，RN
5、ase A,溶液II 破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性。,第二步：破膜，蛋白质和DNA变性,Solution II 的配制：,第三步：中和,溶液III使DNA复性、并促使蛋白质-SDS复合物和染色体DNA、RNA沉淀。,Solution III的配制：,0.2N NaOH，1.0%SDS,3M 醋酸钠（用冰醋酸调pH至4.8）,溶液II 破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性。,第二步：破膜，蛋白质和DNA变性,Solution II 的配制：,第三步：中和,溶液III使DNA复性、并促使蛋白质-SDS复合物和染色体DNA、RNA沉淀。,Solution III的配制：,0.2N NaOH，1.0%SD
6、S,3M 醋酸钠（用冰醋酸调pH至4.8）,具体操作步骤,1挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于2mlLB(含相应抗生素)液体培养基中，37250转分钟振荡培养过夜(约12-14h)。2取1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心8000g lmin，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。3将细菌沉淀重悬于100ul预冷的溶液I中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。4加200ul新鲜配制的溶液，颠倒数次混匀(不要剧烈振荡)，并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞膜裂解(溶液为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清)。,5加入150ul预冷的溶液，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置3-5m
7、in。溶液为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K使SDS蛋白复合物沉淀。6加人450ul的苯酚氯仿异戊醇，振荡混匀，4离心12000g10min。7小心移出上清于一新微量离心管中，加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置2.5min，4离心12000g 15min。81ml预冷的70乙醇洗涤沉淀1-2次，4离心8000g 7min，弃上清，将沉淀在室温下晾干。9沉淀溶于20ulTE(含RNase A 20ugm1)，37水浴30min以降解RNA分子，20保存备用。,最重要的是：,2.影响质粒DNA产量的因素,菌株的遗传背景，质粒自身的拷贝数。
8、,一般要使用endA基因发生突变的大肠杆菌菌株。如DH5、JM109、XL1-Blue等。,（1）受体菌株,endA基因编码核酸内切酶，在Mg2+的存在下可将双链DNA消化成7bp的寡核苷酸片断。,这是直接决定DNA产量的重要因素之一。,（3）质粒大小,分子量大的质粒，拷贝数少。,（2）质粒拷贝数,质粒本身的性质所决定。,二、基因组或其他DNA的提取,一般过程及原理：,1.细菌基因组DNA的制备,（1）细胞裂解,10%SDS和蛋白酶K。37 oC温育。,不用NaOH!,（3）沉淀DNA,0.6倍体积的异丙醇。,（2）DNA纯化,CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)除去多糖，酚-氯仿-异戊醇除去蛋白
9、。,一般过程及原理：,动物组织剪成小块，置液氮中冻结后研磨成细粉末。组织培养的细胞用胰酶消化松散后直接使用。,（1）组织粉碎,2.哺乳动物细胞基因组DNA的抽提,0.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。50 oC温育。,（2）细胞裂解,（3）纯化DNA,用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污染。,SDS是离子型去垢剂（detergent），可以使细胞膜崩解。,（5）除去RNA污染,用RNase。,用2倍体积的无水乙醇。,（4）沉淀DNA,（可以加入1/10体积的3M醋酸氨辅助沉淀）,一般过程及原理：,（1）组织粉碎,用液氮冷冻后研磨成细粉末。,3.从植物组织中制备 DNA,（2）细胞裂解,用2%C
10、TAB/2-ME(十六烷基三甲基溴化铵/2巯基乙醇）。或1%SDS和蛋白酶K。65 oC温育。,用0.6倍体积的异丙醇（-20 oC）。,（3）纯化DNA,用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污染。,（4）沉淀DNA,（5）除去RNA污染,用RNase A。,（可以加入1/10体积的3M醋酸氨辅助沉淀）。,三、DNA的定量和纯度测定,1.紫外光谱法,DNA（或 RNA）在260nm波长处有特异的紫外吸收峰。并且吸收强度与系统中的DNA或RNA的浓度成正比。,用微量比色杯（10l）在紫外分光光度计直接测定。,原理：,蛋白质在280nm处有吸收峰,步骤：.用TE或dH2O稀释样品，1：20或更高。.用T
11、E或dH2O作空白，在波长260nm及280nm处调节 紫外分光光度计读数至零。.加入DNA稀释样品于上述二波长处读取OD值。计算浓度：dsDNA 50OD260 稀释倍数(ug/ml)ssDNAorssRNA 40OD260 稀释倍数(ug/ml)纯度：OD260/OD280 1.8,DNA OD260/OD280 1.8,DNA 被RNA污染 OD260/OD280 1.8,DNA被蛋白质污染 OD260/OD280 0.9,需重新抽提除去蛋白质 OD260/OD280 2,需重新抽提除去RNA特点：能测浓度和纯度，准确，简便，但需较贵重的仪器紫外 分光光度计。,2,溴化乙锭（EB）能插入
12、DNA分子中，紫外光照射下能发 红色荧光。,2.琼脂糖凝胶电泳估计,原理：,与已知浓度的DNA电泳带荧光强度对比，就可以估计出DNA含量。,一般使用琼脂糖凝胶电泳，与已知分子量的DNA标准混合液对比得知。,DNA分子量Marker有许多公司的商品，使用非常方便。如DNA的Hind酶切物等。,四、DNA分子量的估计,Marker,Marker,DNA ladder,28kb,2500bp,2300bp,1300bp,900bp,750bp,200bp,5000bp,20kb,1000bp,900bp,800bp,700bp,600bp,500bp,400bp,300bp,200bp,100bp,
13、DNA Marker,1.带电荷的分子在电场中会以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动，速度称为电泳迁移率。2.电泳迁移率同电场的强度和分子本身所带的净电荷数目成正比。3.电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数成反比。,一、电泳的基本原理,第二节 DNA的凝胶电泳,4.,如果电场强度一定（电压和电极距离）、电泳介质相同（电泳液和凝胶）：分子在电场中迁移的速度主要取决于分子本身的大小和形状。形状相似的分子的迁移速度主要与分子量相关:分子量越大，移动越慢。,摩擦系数主要与分子的大小、形状以及介质的粘度有关。,5.,Relaxed,supercoiled,Increasing degree of sup
14、ercoiling,相同分子量的DNA:,闭合环状卷曲超螺旋迁移最快，线性分子次之，伸展开环状最慢。,二、琼脂糖凝胶电泳,1.琼脂糖,2.琼脂糖凝胶,琼脂糖在水里（或电泳液）中加热到沸点后溶解，冷却后又凝固成均匀的的胶体“胨”。琼脂糖溶解后链间糖分子上的羟基由于氢键的作用相互连接，形成三维空间结构，随着琼脂糖浓度的不同会形成孔径不同的三维空间结构。,是一种线性多糖聚合物，从红色海藻产物琼脂中提取而来。琼脂糖由D半乳糖与L半乳糖通过糖苷健交替，形成相对分子质量为104105的长链。,琼脂糖的浓度决定凝胶的空隙（密度）。,浓度高,空隙小,大分子量的DNA移动的慢,小分子量的DNA移动的快,DNA加
15、样孔,大分子量的DNA移动的慢,小分子量的DNA移动的快,电泳缓冲液,阳极,阴极,DNA加样孔,空隙小，分辨率高：小分子较易通过，而大分子难通过；空隙大，分辨率低：大小分子几乎以同等速率通过。,3.琼脂糖凝胶的分辨力,空隙大小决定其分辨分子大小的能力。,三、凝胶电泳试剂,1.溴化乙锭,Ethidium bromide（EB）,EB是扁平分子，能插入DNA碱基之间，但不与琼脂糖结合。EB在300nm紫外光照射下能发红色荧光，即可显示DNA泳带在凝胶中所处的位置。荧光强度与DNA含量及大小成正比。,原理：,溴酚蓝(bromophenol blue，Bb)是带电荷的小分子化合物，呈蓝紫色。凝胶电泳的
16、过程可以通过可见的染料(示踪染料)来监测。把这种示踪染料配制成上样缓冲液，在电泳前就同DNA样品一起加到每一个样品孔中，当示踪染料泳动到胶底部时，电泳结束。如溴酚蓝所带电荷量相当于300bp的DNA分子，通过观察溴酚蓝的迁移位置，就可估计样品中DNA分子的迁移位置。,2.溴酚蓝,（1）凝胶缓冲液和电泳缓冲液：在制备凝胶和进行电泳所使用的缓冲液是同一种缓冲液，目前常用的缓冲液有TAE(40 mol/L Tris乙酸、lmmo1/L EDTA)、TBE(90 mmol/L Tris硼酸、1mmol/L EDTA)和TPE（50mmol/L Tris磷酸、lmmo1/L EDTA)。TAE缓冲液的缓
17、冲能力较低，适用于低电压长时间电泳；TPE缓冲液长时间使用后，需将正负极电泳槽的缓冲液混合后再使用；TBE有较强的缓冲能力，是比较通用的缓冲液。（2）上样缓冲液：为了不使样品扩散以及监测凝胶电泳的过程，样品加样前需和上样缓冲液(Loading Bufrer)混合。常用的加样缓冲液由蔗糖（40wv）、甘油（025）和染料（0.25溴酚兰）组成，其中蔗糖、甘油等是抗对流物质，染料(如溴酚兰)是指示剂。,3.缓冲液,1.制备凝胶 将电泳缓冲液和琼脂糖按质量百分比配制成浓度为0.5%1.5%的混合液（具体浓度根据具体实验选择）。加热熔化，冷却至55，到入制胶盒，插上样品梳。待样品凝固后（约30min）
18、，拔出样品梳，在胶上形成样品孔。将胶放入加有足够电泳缓冲液的电泳槽内，缓冲液高出凝胶表面约1mm。2.上样 用适量上样缓冲液制备DNA样品，把制备好的DNA样品用移液器将样品加入样品孔中，同时应在其它孔内加入DNA分子量标准物。3.电泳 接通电极，使DNA向阳极移动，在110V/cm凝胶电压下进行电泳。当上样缓冲液中的示踪染料（溴酚蓝）迁移至足够分离DNA片段的距离时，关闭电源。4.观察结果 已染色的凝胶直接放入紫外凝胶成像仪内观察、照相。否则先用0.5ug/ml溴化乙锭染色1030min再观察结果。,四、实验步骤,电泳操作基本程序,称样,溶解,加热,制板,倒胶,取样,点样,电泳,检测,UVP
19、全自动凝胶成像分析系统,OMEGA8-LOGO全自动凝胶成像分析系统,聚丙烯酰胺凝胶(PAG)是最常用来分离蛋白质的凝胶系统，也用于低分子量DNA片段的分离。PAG电泳有静电效应和分子筛效应，分辨力很高。在DNA顺序分析时，即使相差一个核苷酸的片段也能很好的分开。PAG是由丙烯酰胺(acr)和交联剂N,N一亚甲双丙烯酰胺(bis)，在催化剂N，N，N，N一四甲基乙二胺(TEMED)和过硫酸胺(APS)存在下聚合成网格状凝胶。凝胶的孔径与丙烯酰胺的浓度及丙烯酰胺与双丙烯酰胺比例相关。,五、聚丙烯酰胺凝胶电泳,优点是比琼脂糖凝胶的分辨率高的多。,琼脂糖凝胶电泳：100050000bp 聚丙烯酰胺凝
20、胶电泳：11000bp,凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关，凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。,蛋白质电泳,方法：变性与非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，前者常称之为SDS-PAGE。差别：有无变性剂 用途：非变性凝胶可用于蛋白质的分离纯化过程中，可直接用于酶促反应（颜色变化）SDS-PAGE可用于蛋白质分子量测定。mRNA翻译产物，基因表达产物测定等。,蛋白质电泳之前，蛋白质都要用十二烷基硫酸钠(SDS)处理。SDS会结合在蛋白质上，每一条布满SDS的蛋白质具有相似的电荷分子量比值。并将蛋白质的多条链分开
21、。这样，在电泳中，SDS蛋白质链就基本根据分子量的大小分开。一般10浓度的聚丙稀酰胺凝胶电泳可分离分子量20一200 KDa的蛋白质。,DNA-DNA或DNA-RNA链杂交。用放射性同位素（32P或125I）标记的DNA或RNA探针。,第三节 核酸的分子杂交,DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern印迹技术。RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被趣称为Northern印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为western blot。原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维
22、素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态,如是否有点突变、扩增重排等。,一、Southern blot,Southern blot 筛选结果,原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。,二、Northern bl
23、ot,Southern blot与Northern blot不同点,(1)转移的对象不同:Southern 印迹是将DNA转移到固相支持物上；Northern印迹是将RNA变性及电泳分离后，将其转移到固相支持物上的过程。(2)变性方法不同:RNA电泳前不需要像DNA那样进行酶 切,但也需要变性。但是不能用碱变性，在进样前用甲基氢氧化银、乙二醛或甲醛使RNA变性，不用NaOH，因为它会水解RNA的2-羟基基团，导致RNA的降解。,三、原位杂交,对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。,需要目的基因的探针。,聚合酶链式反应简称PCR技术,能在体外快速特异地扩增所需的目地基因或DNA片段。
24、扩增的数量是2n，n为循环周期。,第四节 聚合酶链式反应（Polymerase chains reaction,PCR),DNA，生命的蓝图,故事发生在1983年的春夏之交,1.PCR的发明,Kary B.Mullis(1944-)，在Cetus公司工作期间，发明了PCR。他原本是要合成DNA引物来进行测序工作，却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物（而不是一个引物）去扩增模板DNA 的想法.,很少有在公司工作的科研人员得诺贝尔奖，Mullis是其中之一,Mullis开车的时候,瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面
25、开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成DNA，,Mullis的第一个PCR实验,1983年9月中旬。Mullis在反应体系中加入DNA聚合酶后在37一直保温。结果第二天在琼脂糖电泳上没有看到任何条带。于是他认识到有必要用加热来解链，每次解链后再加入DNA聚合酶进行反应，依次循环。1983年12月，他终于看到了被同位素标记的PCR条带。,PCR的发展史,1983年春，Mullis发展出PCR的概念；1983年9月，Mullis用大肠杆菌DNA聚合酶做了第一个PCR实验，只用一个循环；1983年12月，用同位素标记法看到了10个循环后的49 bp长度的第一个PCR片断；1985年12月20日，Mu
26、llis的同事Saiki在Science上发了一篇论文，方法中用了PCR技术，导致Mullis的文章到处被拒；1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202），这回Mullis是第一发明人。,PCR的发展史,1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法；1986年6月，Cetus公司纯化了第一种高温菌DNA聚合酶，Taq DNA polymerase，这是85年春天Mullis建议做的；1988年，第一台PCR仪问世；1991，Cetus公司以3亿美元的转让费将PCR相关专利转让给瑞士Hoffman LaRo
27、che公司，并在此后的经营中又获得了数亿美元的分红；Mullis于1993年获得诺贝尔化学奖，PCR和DNA重组技术一样意义深远。,2.PCR的过程及原理,5,3,5,3,94,30s（热变性）,55,45s（退火）,5,3,3,5,5,3,3,5,72,1min（延伸）,进入下一个循环,5,3,3,5,5,5,3,3,引物,引物,Mg 2+dNTP,引物，Taq酶,双链DNA在受热后，配对碱基的氢键断裂，DNA两条链分开成为单链。,TGCATGCAT,ATCTTGAAC,TAGAACTTG,ACGTACGTA,TGCATGCAT,ATCTTGAAC,3,5,5,3,3,5,5,3,TAGAA
28、CTTG,ACGTACGTA,95oC,（1）DNA模板变性,模板,模板（template）,95oC,TGCATGCAT,ATCTTGAAC,3,5,5,TAGAACTTG,ACGTACGTA,3,人工合成的单链DNA小片断，碱基顺序分别与所要扩增的模板DNA双链的5端相同。,（2）DNA模板与引物复性,模板,模板,ATCTTGAAC,5,3,ACGTACGTA,5,3,引物,引物,引物（primer）:,40-65oC,DNA聚合酶按碱基配对原则在模板上延伸DNA链。,（3）DNA链的延伸,TGCATGCAT,ATCTTGAAC,3,5,5,TAGAACTTG,ACGTACGTA,3,模板
29、,模板,ATCTTGAAC,5,ACGTACGTA,5,Taq,Taq,72oC,理论上25-30次循环就可以合成225-230条DNA。,变性复性延伸。,（4）1个循环的结果,（5）新一轮循环开始,DNA elongation,PCR 动画,1st cycle,2nd cycle,3rd cycle,过 程,变 性,引 物 退 火,DNA 复制,PCR,琼脂糖凝胶电泳,最终产物,紫外光观察,3-4 小时,PCR仪,需要的模板量极低。,3.PCR的特点,（1）特异性强,PCR使用专门合成的DNA引物。延伸过程是在高温下进行。,（2）敏感性高,这就避免了一般DNA聚合酶污染和非引物延伸形成的DN
30、A。提高了反映的特异性。,理论上只要一条模板链，32次循环就可合成约109条！,RT-PCR：,对模板的纯度要求低。,（5）可以扩增mRNA,（4）简便,先用逆转录酶将mRNA合成cDNA，再以cDNA为模板进行扩增。,（3）快速,整个PCR过程约4小时即可完成。,不需要纯化，甚至可以直接用细菌。已固定或包埋的组织切片也可以直接用于作模板。,自从H.A.Erilish分离出耐高温的Taq DNA聚合酶，代替大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片断（37 oC)，PCR技术才进入实用阶段。,（1）Taq DNA聚合酶,4.影响 PCR的因素,Taq DNA聚合酶的最大特点是热稳定性，耐高温，非常适合
31、PCR过程的反复高温变性要求。,热稳定性,最适温度：75-80 oC 延伸速度：约35-150nt/s.酶分子 最长延伸长度：6.7kb,最适温度高,Taq酶的功能缺点,具有53聚合酶活性和53外切酶活性，但没有35外切酶活性。因此不能修复错误的碱基配对！,合成超过600bp长度的DNA就有可能出现错配，用于克隆基因时必须测序。,金属离子敏感（尤其是Mg2+）。当dNTP的浓度为0.7-0.8mmol/L时，MgCl2的最佳浓度应是2.0mmol/L。,Taq DNA聚合酶的激活剂,50mmol/L KCl也能激活Taq DNA聚合酶的活性。,（2）其它耐热的 DNA聚合酶,Tth DNA聚合
32、酶,无3 5DNA外切酶活性，但高温下能逆转录cDNA，又能扩增DNA。,VENT DNA聚合酶,有35外切酶活性，能够校正碱基的错配。能耐受100oC高温。,Pfu DNA Polymerase,Taq Plus DNA Polymerase,有3-5的外切酶活性，5-3外切酶活性。,但PCR产物为平端！,是目前已发现的所有耐高温DNA 聚合酶中出错率最低的。,是Taq和Pfu DNA聚合酶的混合物。,Taq的PCR产物3端往往带有一个A。,与待扩增的模板DNA区段的两3端序列互补（5端相同）的短DNA。,（3）引物（primer),位置,3,3,即2.751011 bp的基因组中有一次完全
33、与19个核苷酸的序列相同的机会（或机会是约210-11）。,引物的长度,理论计算：,419=2.751011。,一般引物设计为长1530bp。,引物的碱基序列,5端根据需要可设计成某个内切酶的切点顺序、RNA聚合酶识别序列、突变位点或生物素标记等，方便与以后操作。,5ATGCAGAAACTGATCGATCGATCGAT3,3GCTAGCTACTTAAG5,3端必须与模板正确配对，5端可以不配对。,template,primer,尽可能提高G+C含量，以提高引物与模板的结合力,引物的碱基组成,避免连续相同碱基排列或内部回文序列.,5GGCAGTCTGCCAGTCTAC3,CTGCCAGTCTAC3,GACGG5,T,发卡结构,1）,2）,3）避免形成引物二聚体（dimer）,两个引物之间不能有两个以上的连续碱基序列互补。,5GGTCTGCCAGTCTAC3,3CAGGACTTAGTCACT5
