1、会计学,1,血型分子诊断技术进展与应用,主要内容,红细胞血型系统分子诊断红细胞血型系统分子基础ABO血型系统Rh血型系统H血型系统(类孟买型)红细胞血型系统分子诊断技术及其应用小结,有关分子生物学概念,点突变同义突变无义突变有义突变起始密码突变缺失插入重排,有关分子生物学概念,基因结构异常或表达异常点突变插入缺失易位和重排拷贝数扩增DNA多态性基因的检测,常见突变示意图,ATG CGG TAG CGT AGT CTGATG CGA TAG CGT AGT CTGATA CGG TAG CGT AGT CTGATG CGGG TAG CGT AGT CTGATG CG TAG CGT AGT C
2、TG,新等位基因形成,红细胞血型系统,40个基因1250个等位基因(截止2012年5月12日)参见Blood Group Antigen Gene Mutation Database,红细胞血型分子机制,点突变同义突变、无义突变、有义突变、起始密码突变、拼接接受位点插入缺失基因重组（RHD/RHCE）基因部分重复http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gv/mhc/xslcgi.cgi?cmd=bgmut/systems,ABO血型分子生物学研究,1990年Yamamoto等首次克隆基因定位于染色体9q34ABO基因cDNA，其分子量为41,000 Dalton
3、，DNA长度为1062bpABO血型系统为三复等位基因，有A、B、O三个基因ABO基因包括7个外显子，长度大于18kb大多数编码序列位于第6和7外显子,ABO基因示意图,常见等位基因,A和B基因 编码的蛋白都是353个氨基酸，O基因编码的蛋白只有 115个氨基酸A101、A102、B101、O01、O02A101作为参考序列A102等位基因 C467T(Pro-Leu)B101基因在297、526、657、703、796、803、930、1096位有8个核苷酸与A101基因不同但只有526、703、796、803四个核苷酸的变化造成了氨基酸序列的变化（A101依次是精氨酸、甘氨酸、亮氨酸和甘氨
4、酸，B101依次是甘氨酸、丝氨酸、蛋氨酸和丙氨酸）O01基因在261位的G缺失,提前终止,ABO亚型频率分布,ABO血型中存在ABO亚型临床输血和献血者检测中常见440617份A亚型22份AxB 11例，AelB 3例，Ax 3例，Ael 2例，Amh 2例，A3 1例B亚型41份Bx11例，B39例，ABx7例，AB3 5例，Bel3例，Bm 2例，ABel 1例，ABend 1例，ABm 1例，Bend 1例。B(A)1例CisAB2例A2 14例A2B 35例引自中国输血杂志2006，19（1）：25,ABO亚型的分子研究,通过检测261、526、703、796、803位的核苷酸可以确认
5、大多数典型的ABO血型的基因型近年来对血清学分类的ABO血型亚型抗原，应用PCR、DNA测序等技术，在核苷酸和酶蛋白氨基酸序列水平上进行研究结果表明：原为同一亚型的抗原存在异质性，即血清学上同一亚型，在核苷酸和酶蛋白氨基酸序列水平上有可能存在差异。几个位点以外的核苷酸变化引起的ABO血型亚型常会引起检测结果的偏差发现的等位基因数为290个（2012年05月22日）,A等位基因,可简要分为7大类等位基因A1、A2、A3、Ax、Ael、Aw、AmA101等位基因序列作为参照标准A102(C467T)（在中国人群中比例大于A101)A103(C467T,C564T)A104(A297G)A105(A
6、297G,B-O1重组)A106(B-O02重组)A205(A1009G),B等位基因型,可简要分为5大类等位基因B1、B3、Bx、Bel、BwB等位基因中297、703、796、803位基本恒定B101-B118B101:A297G;C526G;C657T;G703A;C796A;G803C;G930A;G1096AB301-B308B301:A297G,C526G,C657T,G703A,C796A,G803C,G930A,G1096A,C1054T,O等位基因,O01O74 大多数261nt缺失，13个261nt不缺失O01:261delGO02:261delG、T646A、G681T、
7、C771T、G829A人群中常见003:261G、A297G,C526G,G802AO50,CisAB和B(A)等位基因,CisAB01-06CisAB01:C467T,G803CCisAB02:C526G,C657T,G703A,G803C,B(A)01-06B(A)型单克隆试剂应用于临床后，抗A试剂偶尔与原定为B型的红细胞发生反应，这类含有大量B抗原极少A抗原的红细胞称之为B(A)型B(A)01:A297G,C526G,796A,G803C,G930A,G1096AB(A)02:A297G,C526G,C657T,C700G,G703A,C796A,G803C,G930A,G1096A,实
8、验室发现的ABO等位基因,A208 allele*C467T;G539CA210 allele*268TC;467CT A211 allele*266CT;467CT B112 allele*297AG;526CG;559CT;657CT;703GA;796CA;803GC;930GA B305 allele*297AG;425TC;526CG;657CT;703GA;796CA;803GC;930GA B307 allele*297AG;410CT;526CG;657CT;703GA;796CA;803GC;930GA Bw12 allele*C278TCisAB05 allele*A297
9、G;C526G;C657T;G703A;C 796A;G930A O61 allele*261del 743C,ABO基因诊断,PCR-SSPPCR-RFLPPCR-SSOPCR-SSCPPCR-SBT261G干扰正反定型不一致,ABO亚型分子机制和诊断,凝集强度改变正反定型不一致点突变为主PCR-SSP261GPCR-SBTSNP(单核苷酸多态性),ABO亚型分子机制和诊断,PCR-SBT常见为6-7外显子扩增双向测序存在风险：扩增引物SNP多态性位点在其它位置其它机制：表观遗传、其它,ABO亚型分子机制和诊断,PCR-SBT1-7外显子扩增技术和策略全长18kb一般3对引物以上外显子上的突
10、变ATG位置突变其它机制？,ABO亚型分子机制和诊断,基层实验室如何有效获取信息血清学结果家系分析保存抗凝全血-20以下寻求分子诊断实验室帮助,Rh血型基因,基因位于1号染色体短臂上，即1P3436两个基因：RHD编码D抗原，RHCE编码CcEe抗原RHD和RHCE基因同源性高达96%以上RHD和RHCE基因均有10个外显子,RHD基因第1、2、8、10外显子的编码序列与RHCE的相对应序列相同RHD基因第3、4、5、6和第9外显子序列与RHCE基因有区别两个RH基因紧密连锁，相隔30000bp两个基因的3末端面对面两个基因之间有一个独立的基因SMP1RHD和RHCE两个基因之间以及外侧分别有
11、1个Rhesus盒SMP1基因距中间一个Rhesus盒下游仅15bp,RHCE和RHD基因组成示意图,1p34-p36,Rh血型等位基因,RHAGRHDRHCE突变和缺失、基因转换、基因重组RHD 218RHCE 104RHAG 23,RHD等位基因,RhD阳性正常RhD阳性弱D(weak D)部分D(partial D)DelRhD阴性RHD基因缺失RHD基因功能丧失,部分弱D的分子突变点,RHD weak D type 1 T809GRHD weak D type 1.1 C5G;T809GRHD weak D type 2 G1154ARHD weak D type 3 C8GRHD w
12、eak D intron 55A intron3 5 G5ARHD weak D type33(Taiwan1)G520ARHD weak D type Taiwan2 T809ARHD weak D type 51 A594T;C602GRHD weak D type 52 92TC RHD weak D type 53 T740G分子机制碱基突变缺失mRNA拼接位点变异,部分D分子机制,Partial D 发现等位基因70多个-RHD Va 2 T667G;G697C;G712A;G1273C RHD Va 3 G697A RHD Va 4 hybrid D(1-4)CE5 D(6-10)
13、RHD VI type I hybrid(D1-3)CE(4,5)D(6-10)RHD VI type II hybrid D(1-3)CE(4-6)D(7-10)RHD VI type III hybrid D(1,2)CE(3-6)D(7-10)RHD VI type IV hybrid D1 Ce(2/3-5)D(6-10)分子机制基因交换RHD-CE-D点突变,部分D分子机制示意图,Del分子机制,Del（D elution）亚洲人群常见RHD DEL(Cde)1 intron 3 G1ARHD DEL(Cde)2 G885TRHD DEL(Cde)3 intron 9 G1A;G12
14、27ARHD DEL(Cde)4 intron 5 38delCTCTRHD DEL(Cde)5 1252insTRHD DEL(Cde)6 T1203ARHD Del(Cde)7 G3ARHD Del(Cde)8 C28TRHD Del(Cde)9 T53CRHD Del(Cde)10 T251CRHD DEL T1222CRHD Del intron 8-9:del 1013RHD DEL exon8 del 995nt including 3intron7+exon8+5intron8,RhD阴性的机制,不同Rh阴性表现型频率不同RHD阴性的可能机制RHD基因缺失RHD基因发生改变RHD
15、-CE-D融合基因RHD基因的第3到9外显子被RHCE基因取代RHD阴性个体中约1/3具有完整的RHD基因非洲D阴性个体具有RHD（假基因）,RHCE等位基因,RHCE等位基因104个正常RHCERHce 48C RHCE G48CRHCE(1)D(2-10)RHCE(1)D(2-10)RHCE D-Chinese RH(D1-9CE10)RH(CE1 D2-7 CE8-10)hybrid CE(1)D(2-7)CE(8-10)RHCE 685-687del 685-687delAGA RHCE null amorph 2 Intron 4:G1T,9例弱D样本RHD 845A 5例（RHD
16、weak D type 15）RHD 1227A 3例（D-el(CDe);minimal expression of D antigen;）RHD 1013C 1例（RHD weak D type 24）10例部分D样本Dva(Kou)1例Dva(Hus)1例DVa-like(YH)1例DVI type III 7例Molecular basis of D variants in Chinese persons.Transfusion.2007;47(3):471-7,本实验室部分检测结果,RHD血型分子诊断,RhD阴性多重PCR技术FQ-PCRPCR-RFLPD VariantPCR-SS
17、P测序技术,RHD血型分子诊断,分子机制复杂RhD阴性分子机制基因交换RHD-CE-D疑难标本单一技术难以判定多种技术并存血清学结果,H血型系统,H抗原与ABO血型，Lewis血型密切相关，属于Hh血型系统（ISBT018）,其它血型系统,血清学特性分子机制点突变基因重组PCR-SSP基因芯片,其它血型系统,罕见表型血清学特性基因定位测序技术体外表达,红细胞血型系统分子诊断技术的应用,红细胞血型的诊断人群遗传的分析谱细胞血型的诊断罕见表型分子机制研究疑难血型的判断多次输血后的血型检测产前血型的诊断,红细胞血型系统分子诊断技术的应用,罕见表型多次输血病人ABO、RhD血型的不一致RhD变异体弱表
18、达的基因情况RHD杂合度筛选稀有系统（抗体缺乏）谱细胞,红细胞血型中采用的技术,PCR-RFLPPCR-SSP多重PCR技术PCR-SBTPCR-SSCPPCR-RQ基因芯片方法的优缺点与血清学方法的比较,红细胞血型系统基因分型技术 PCR-RFLP(限制性片段长度多态性),通过PCR扩增出包含突变位点的特定片段利用限制性内切酶消化片段经凝胶电泳不同的片断大小检测便能确认基因型方法特性操作较简单酶切过程需要控制,PCR-RFLP,复合PCR-RFLP技术检测ABO基因型.中华医学遗传学杂志,1999年第2期,复合PCR 技术在ABO 血型基因分型中的应用,北京医学2007 年第29 卷第2 期
19、,PCR-SSP,利用3碱基特性分别设计一系列序列特异性引物直接扩增出目的基因片段通过凝胶电泳观察方法特性简单快捷易于操作基于已知序列,PCR-SSCP,选择性扩增基因片段加热或用变性剂解开DNA双链由于等位基因的核苷酸顺序的不同，二级结构产生差异在聚丙烯酰胺凝胶电泳中电泳迁移率不同分析电泳带型即可区别开等位基因,DNA测序法,通过PCR扩增基因的主要片段，然后对产物进行序列分析测定，分析发生突变的碱基便可确认血型血型及其亚型的分子基础本方法结果准确可靠需要特殊的仪器设备操作烦琐，成本高,测序技术,测序技术双脱氧终止法化学降解法高通量测序,Partial sequence in exon 6,
20、O01 allele,Bw12 allele,A novel allele,基因芯片技术,2005年Transfusion 45(5):654-9 Transfusion 45(5):667-679高通量同时分析多个系统多个位点(等位基因）快速可靠可自动化国外产品为主,实时荧光技术(PCR-RQ),Prediction of fetal Rh D and Rh CcEe phenotype from maternal plasma with real-time polymerase chain reaction.Transfusion and Apheresis Science 27(2002
21、)217223实时定量荧光基团特异性探针产前诊断,RT-PCR,逆转录mRNA和cDNA全部编码序列无内含子区域功能研究克隆体外表达突变功能,RT-PCR to amplify the full length cDNA of RHD,2000bp1000bp,1 2 M,Primer:RHF&RHR,国内红细胞血型系统基因诊断情况,基因分型方法的建立分子遗传多态性检测罕见表型分析RHD基因ABO血型亚型类孟买型其他功能表达,红细胞血型基因分型,不能完全取代传统的血清学方法，其原因有：血清学方法快速、简单，易于操作血清学试验比PCR方法成本低DNA技术不能用于抗体筛选，至少目前尚没有合适的方法D
22、NA技术只能预测血型表现型基因分型方法：样本来源更广，保存时间更长稀有表型鉴定、疑难样本鉴定、阐明分子机理等目前DNA分型结果应该与血清学结果相互补充,血型分子诊断发展,小结：血型分子机制ABORHDFUT1诊断技术,血型分子诊断发展,高通量技术表观遗传RNA干扰等位基因数量分子机制表达调控,谢谢各位同仁的支持！不当之处请指正,有关分子生物学概念,点突变同义突变无义突变有义突变起始密码突变缺失插入重排,RHD基因第1、2、8、10外显子的编码序列与RHCE的相对应序列相同RHD基因第3、4、5、6和第9外显子序列与RHCE基因有区别两个RH基因紧密连锁，相隔30000bp两个基因的3末端面对面
23、两个基因之间有一个独立的基因SMP1RHD和RHCE两个基因之间以及外侧分别有1个Rhesus盒SMP1基因距中间一个Rhesus盒下游仅15bp,RHD等位基因,RhD阳性正常RhD阳性弱D(weak D)部分D(partial D)DelRhD阴性RHD基因缺失RHD基因功能丧失,9例弱D样本RHD 845A 5例（RHD weak D type 15）RHD 1227A 3例（D-el(CDe);minimal expression of D antigen;）RHD 1013C 1例（RHD weak D type 24）10例部分D样本Dva(Kou)1例Dva(Hus)1例DVa-
24、like(YH)1例DVI type III 7例Molecular basis of D variants in Chinese persons.Transfusion.2007;47(3):471-7,本实验室部分检测结果,其它血型系统,罕见表型血清学特性基因定位测序技术体外表达,实时荧光技术(PCR-RQ),Prediction of fetal Rh D and Rh CcEe phenotype from maternal plasma with real-time polymerase chain reaction.Transfusion and Apheresis Science 27(2002)217223实时定量荧光基团特异性探针产前诊断,血型分子诊断发展,小结：血型分子机制ABORHDFUT1诊断技术,谢谢各位同仁的支持！不当之处请指正,
