1、蛋白样本制备与免疫印迹蛋白样本制备与免疫印迹（Immunoblotting technique）南京中医药大学 生物化学与分子生物学系郭 军 教授郭 军 教授基本概念基本概念印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。19751975 年，年，SouthernSouthern 建立了将建立了将 DNADNA 转移到硝酸纤维素膜转移到硝酸纤维素膜（NCNC 膜）上，并利用膜）上，并利用 DNADNA RNARNA 杂交检测特定的杂交检测特定的DNADNA 片段的方法，称为
2、片段的方法，称为 Southern 印迹法。而后人们用类似的方法，对而后人们用类似的方法，对 RNARNA 和蛋白质进行印迹分析和蛋白质进行印迹分析，对，对 RNARNA 的印迹分析称为的印迹分析称为 Northern 印迹法，对单向电，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为泳后的蛋白质分子的印迹分析称为 Western 印迹法，对，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为 Eastern 印迹法Western Blot 基本原理 一种将凝胶电泳与固相免疫结合起来的分子生物学技术。在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来
3、检测。其基本过程主要有三个工序：1、将蛋白质经凝胶电泳按分子量大小不同依次分离；2、将分离的组分转印到印迹膜上；3、对转印到印迹膜上的蛋白成分进行免疫学检测。123Western Blot 一般流程蛋白样品的制备蛋白含量测定蛋白质变性SD S 聚丙烯酰胺 凝胶电泳转膜免疫学检测封闭一抗交杂二抗交杂底物色显曝光、影、定影显一 蛋白样本制备一 蛋白样本制备-成功蛋白分析的基础成功蛋白分析的基础1、制备蛋白样本的目的、制备蛋白样本的目的 体外活性测定（活性测定（in vitro assay）免疫印迹杂交 免疫印迹杂交(Immunoblot)免疫沉淀或共沉淀 免疫沉淀或共沉淀(Immunoprecip
4、itation)双向电泳（双向电泳（two-dimensional electrophoresis）电泳迁移率变动分析电泳迁移率变动分析（EMSA）染色质免疫共沉淀技术染色质免疫共沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation，ChIP)3、方法的选择、方法的选择2、蛋白质的性质、分类与分布、蛋白质的性质、分类与分布种类：细胞、组织、微生物、酵母种类：细胞、组织、微生物、酵母亚细胞定位：亚细胞定位：胞浆、胞膜、胞核、细胞器胞浆、胞膜、胞核、细胞器性质：水溶、脂溶性质：水溶、脂溶其他：含量多少、分子量大小、磷酸化等其他：含量多少、分子量大小、磷酸化等自行配制抽提试剂自行配制
5、抽提试剂,根据文献根据文献方法或方法或经验提取经验提取购买购买商品化试剂盒商品化试剂盒,按其说明按其说明书的方法提取书的方法提取二 细胞中总蛋白的制备二 细胞中总蛋白的制备高速离心收集高速离心收集高速离心收集高速离心收集上清即得全蛋上清即得全蛋上清即得全蛋上清即得全蛋白样本白样本白样本白样本细胞加入裂解细胞加入裂解液冰上放置液冰上放置10-1510-15 分钟分钟蛋白定量和蛋白定量和蛋白定量和蛋白定量和SDS-PAGESDS-PAGE检测检测检测检测裂解样品裂解样品离心收集离心收集定量检测定量检测1、组织或细胞破碎机械匀浆 组织分散机、玻璃超声破碎反复冻融 干冰反于零下复15 20 使之固，然
6、后慢地融冻缓解，反操作复低渗溶液 去污裂解液 表面活性有剂离子型阴（如脂肪酸、基磺酸及盐烷苯盐胆酸等），盐离子型阳（如化基二甲基等）及氧苄烷铵非离子型（Tri tonX-100、Ti rtonX-114、吐温 60及吐温 80）等。2、细胞裂解液、细胞裂解液表面活性剂表面活性剂缓冲液缓冲液蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂磷酸酶抑制剂磷酸酶抑制剂其它：其它：H2O、NaCl、等、等还原剂还原剂RIPA BufferCompany Logo2.1 缓冲液缓冲液 稳定稳定 pH 环境，使蛋白保持自然构象，增加溶解性环境，使蛋白保持自然构象，增加溶解性。有 有 Tris-HCl，HEPES(H+)，MOPS
7、等体系（等体系（pH7.5)2.2 表面活性剂表面活性剂 溶解膜与脂膜，溶解与稳定蛋白质（特别是膜蛋溶解膜与脂膜，溶解与稳定蛋白质（特别是膜蛋白）白）分为分为 1 阴离子型阴离子型:SDS，脱氧胆酸盐脱氧胆酸盐 2 阳离子型阳离子型:CPB 和 CTAB 3 双性离子型双性离子型:CHAPS 和 Zwittergent 系列 4 非离子型非离子型:Brij 系列、Triton-100、Nonidet P40、Tween 系列等2.3 蛋白酶抑制剂及其鸡尾酒蛋白酶抑制剂及其鸡尾酒 抑制蛋白酶的活性，防止蛋白被水解，使用前临时加抑制蛋白酶的活性，防止蛋白被水解，使用前临时加入入 2.4 磷酸酶抑制
8、剂选择磷酸酶抑制剂选择 抑制磷酸酶的活化，防止蛋白样本脱磷酸化抑制磷酸酶的活化，防止蛋白样本脱磷酸化，使用前临时加入 使用前临时加入磷酸酶主要包括非特异性的磷酸酶（例如：碱性磷酸酶，酸性磷磷酸酶主要包括非特异性的磷酸酶（例如：碱性磷酸酶，酸性磷酸酶），特异性的丝氨酸酸酶），特异性的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶（例如：苏氨酸磷酸酶（例如：PP1,PP2A,PP2B）、酪氨酸蛋白磷酸酶（例如：）、酪氨酸蛋白磷酸酶（例如：PTP）。）。常规的抑制剂主要包括：常规的抑制剂主要包括：试剂名称试剂名称抑制作用抑制作用氟化钠氟化钠酸性磷酸酶，丝氨酸酸性磷酸酶，丝氨酸/苏氨酸磷酸酶苏氨酸磷酸酶正钒酸钠正钒酸钠碱性磷酸
9、酶，酪氨酸蛋白磷酸酶碱性磷酸酶，酪氨酸蛋白磷酸酶焦磷酸钠焦磷酸钠丝氨酸丝氨酸-苏氨酸磷酸 苏氨酸磷酸.2.5 2.5 还原剂还原剂还原剂还原剂 防止蛋白质发生氧化，保护二硫防止蛋白质发生氧化，保护二硫键。键。DTT、巯基乙醇等。巯基乙醇等。2.6 2.6 其它其它其它其它 水；溶剂水；溶剂;NaCl。超纯水的电阻率就是单位厘米内的水的电阻值。即 18.25M*CM.2.7 全蛋白抽提时注意事项全蛋白抽提时注意事项可以适量加入甘可以适量加入甘油油,稳定蛋白稳定蛋白注意事项注意事项可以适量加入可以适量加入Benzonase/DNase I 等核酸等核酸酶酶,去除去除 DNA,充分提取蛋白充分提取蛋
10、白,降低提取的粘降低提取的粘度度.抑制蛋白酶及磷抑制蛋白酶及磷酸酶酸酶使用的使用的Detergent 的种的种类 纯度 浓度 类 纯度 浓度 干扰 去除等因干扰 去除等因素素Temperature 试剂和器皿冰上试剂和器皿冰上预冷预冷,低温低温 4操作操作细胞或组织的样细胞或组织的样本量本量裂解液的用量裂解液的用量2.8 细胞裂解液细胞裂解液-RIPA Buffer 的配方分析及技术要点的配方分析及技术要点三 蛋白样本制备产品选择三 蛋白样本制备产品选择1、核蛋白样本制备、核蛋白样本制备抽提原理抽提原理低渗裂解细胞膜低渗裂解细胞膜,释放出胞浆蛋白释放出胞浆蛋白与胞核与胞核;离心分离出胞核离心分
11、离出胞核;高渗破裂胞核高渗破裂胞核,释放出可溶性核蛋释放出可溶性核蛋白白;加核酸酶降解加核酸酶降解 DNA,释放出释放出 DNA 结结合蛋白合蛋白(组蛋白和转录因子组蛋白和转录因子)实验注意事项实验注意事项试剂和器皿冰上预冷试剂和器皿冰上预冷裂解液的用量裂解液的用量细胞总量细胞总量抑制蛋白酶：蛋白酶抑制剂抑制蛋白酶：蛋白酶抑制剂2、膜蛋白样本制备、膜蛋白样本制备3、亚细胞分级抽提、亚细胞分级抽提用用超离心技术超离心技术分离出分离出细胞细胞器、质膜和细胞核器、质膜和细胞核等成分等成分，再用适当的蛋白质溶解，再用适当的蛋白质溶解液进行溶解。其优点是不液进行溶解。其优点是不仅大大仅大大减少样品的复杂
12、性减少样品的复杂性，而且可对分离的蛋白质，而且可对分离的蛋白质进行进行亚细胞定位亚细胞定位。但该法。但该法需要专业仪器，有时会出需要专业仪器，有时会出现假阳性。现假阳性。根椐根椐胞浆胞浆/胞膜胞膜/胞核胞核/骨架蛋白骨架蛋白的亚细胞策略用的亚细胞策略用不同提取液逐级溶解不同提取液逐级溶解四种亚细胞组分分离提取的结果四种亚细胞组分分离提取的结果5、其它蛋白抽提产品、其它蛋白抽提产品高丰度蛋白去除试剂盒高丰度蛋白去除试剂盒信号蛋白提取试剂盒信号蛋白提取试剂盒糖蛋白提取试剂盒糖蛋白提取试剂盒细菌蛋白提取试剂盒细菌蛋白提取试剂盒酵母蛋白提取试剂盒酵母蛋白提取试剂盒植物蛋白提取试剂盒植物蛋白提取试剂盒四
13、 蛋白定量产品选择指南四 蛋白定量产品选择指南1、BCA 法蛋白定量法蛋白定量 BCA（bi ci nchoni ni c aci d）是理想的蛋白定量方法。方法因质该快速敏、定可靠，不同蛋白的系非常小而倍灵稳对种类质检测变异数受人士的。备专业青睐原理是，在性件下，蛋白碱条将 Cu2+原还为 Cu+，Cu+与 BCA形试剂成紫色的合物络，定其在测562nm的吸收，准曲比，处值并与标线对即可算待蛋白的度。计测浓BCA法定蛋白度不受大部分品中的化物的影。在测浓绝样学质响组织胞裂解中，低度的去垢细实验浓剂 SD S，Tri ton X-100，Tw een不影果，但响检测结螯合剂（ED TA，EGT
14、A）、还原剂（D TT，巯基乙醇）和脂类果有一定影。会对检测结响中，若实验发现品稀液或裂解液样释本身背景高，可用值较试Bradford法定蛋白度。测浓2、Bradford 法蛋白定量法蛋白定量考斯亮马兰 G-250染料，在酸性溶液中蛋白合，使染料的最大与质结吸收峰的位置（l m ax），由 465nm变为 595nm，溶液的色也由棕颜黑色色。变为兰原理：染料主要是蛋白中的与质性基酸（特是精酸）和芳香碱氨别氨族基酸基氨残相合。结定快速、便，测简只需加一种试剂。完成一品的定，个样测只需要 5分左右钟。由于染料蛋白合的程，大只要与质结过约2分即可完成钟，其色可以在颜1小保持定，且在时内稳5分至钟20
15、分之，钟间颜色的定性最好。稳由于各蛋白中的精酸和芳香族基酸的含量不同，因此种质氨氨Bradford法用于不同蛋白定质测时有大的偏差较。去、污剂Tri ton X-100、十二基硫酸（烷钠SD S）干此法的定扰测。3、Lowery 法蛋白定量法蛋白定量Low ry 法蛋白定法是质测最敏的方法之一灵。去此法是用最广泛过应的一方法。种原理：在性件碱条下，蛋白中的质合生成合物肽键与铜结复。Fol i n中的酚试剂磷酸钼盐磷酸被蛋白中的酪酸和丙钨盐质氨苯酸基原氨残还，生产深色兰（和的混合物）。在一定的件钼兰钨兰条下，色深度蛋白的量成正比。兰与定法的点是这个测优敏度高灵，缺点是费时间较长，要精确控制操作，
16、准曲也不是格的直时间标线严线形式，且一性差，干物专较扰质较多。DC Protein Assay免疫印迹（免疫印迹（Western Blot）二抗孵育二抗孵育蛋白提取与定量蛋白提取与定量一一抗孵育抗孵育封闭封闭转膜转膜SDS-聚丙聚丙烯酰胺电泳烯酰胺电泳蛋白变性蛋白变性显影显影五、蛋白质变性2SDS 电泳上样缓冲液：1M Tris-base(pH 6.8)2.5ml，-巯基乙醇 1.0ml，SDS 0.6 g，甘油 2.0ml，0.1%溴酚兰 1.0ml，ddH2O 3.5ml。总体积：10ml 加一倍体积的上样缓冲液，95 左右加热左右加热 5-10min5-10min六、六、SDS-SDS-
17、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基磺酸钠（十二烷基磺酸钠（SDS）是一种离子性的界面活性剂是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链.当 当 SDS 与蛋白质混合时与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用而以硫酸根离子外露与水分子作用.蛋白质结合固定比例之 蛋白质结合固定比例之 SDS 後後,由於 由於 SDS 带强负价带强负价,使蛋白质原使蛋白质原先的带电价微不足道先的带电价微不足道,且每单位重量之蛋
18、白质带电价一致 且每单位重量之蛋白质带电价一致(charge density),所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素。所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素。1、原 理：、原 理：2、SD S-蛋白质复合物的特点（1）具有相同的形，形像 一状状 棒。个长椭圆（2）平均 1 g 蛋白合质结1.4 g SDS（3）短不同的蛋白基轴对质亚-SDS束基本上是相同的。胶（4）的度基分子量的长轴长则与亚大小成正比。3、支持体：聚丙烯酰胺（Acr 和 Bi s）聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和 N，N 亚甲基双丙烯酰胺聚合而成的大分子。凝胶的网状结构是带有酰胺侧链的碳-碳聚合物，没有或
19、很少带有离子的侧基，因而电渗作用比较小，不易和样品相互作用。在水溶液中，单体和交联剂通过自由基引发的聚合反应形成凝胶。常用的引发剂和加速剂是过硫酸氨(AP)和 N，N，N，N-四甲基对乙二胺(TEM ED)。浓度可在 7.5%-15%之间变化。温度高聚合快，温度低聚合慢。凝胶成份凝胶成份丙烯酰胺(Acr)和 N,N-亚甲双丙烯酰胺 (Bi s)避光，保存时间SD S（十二烷基磺酸钠）Tri s-Cl 缓冲液 TEM ED 避光过硫酸铵 保存时间（用前加入）去离子水（ddH2O）4、不连续 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶：浓缩效应分离胶：电荷、分子筛效应分离胶浓缩胶胶浓度7.5%4%Tris
20、pH8.94.00Tris pH6.82.00Acr+Bis4.001.06H2O7.844.84SDS0.080.08TEMED10l10l10%AP用前加200100总体积16ml8ml堆积作用:凝胶浓度较小，孔径较大，pH=6.8负极 （低电导区，高电场强度）慢 GLy-(pI=5.97)中间 Pr-(pI 大多接近 5)快 Cl-正极 在浓缩胶(pH=6.8)中 HCl 几乎全部解离为 Cl-，但只有极少部分甘氨酸解离为 H2NCH2COO-。蛋白质的等电点一般在 pH5 左右，在此条件下其解离度在 HCl 和甘氨酸之间。当电泳系统通电后，这 3 种离子同向阳极移动。其有效泳动率依次为
21、 Cl-蛋白质 H2NCH2COO-，故 C1-称为快离子，而 H2NCH2COO-称为慢离子。电泳开始后，快离子在前，在它后面形成离子浓度低的区域即低电导区。电导与电压梯度成反比，所以低电导区有较高的电压梯度。这种高电压梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。在快离子和慢离子之间形成一个稳定而不断向阳极移动的界面。由于蛋白质的有效移动率恰好介于快慢离子之间，因此蛋白质离子就集聚在快慢离子之间被浓缩成一条狭窄带。这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数百倍。浓缩效应SDS-聚丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝胶最佳分离范围胶最佳分离范围不同分子量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度不同分子量范围的蛋白质应选用不同的凝胶
22、浓度5、电泳装置Bio-Rad 和国产天能和国产天能操作图示操作图示6、灌制、灌制 SDS-聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶灌制分离胶 隔绝空气灌好后一般室温放置灌好后一般室温放置 30 分钟左右分钟左右灌制浓缩胶灌制浓缩胶 插入 插入梳子梳子7、配胶注意事项过硫酸铵一般现配现用过硫酸铵一般现配现用，如连续实验可在，如连续实验可在 4 度放置度放置 2 3天。配制天。配制 30 丙烯酰胺储存液要过滤。丙烯酰胺储存液要过滤。配制过程中每加入一种试剂要充分混匀，防止胶出现浓度配制过程中每加入一种试剂要充分混匀，防止胶出现浓度不均的情况。不均的情况。要根据要根据温度调整温度调整 TEMED 或或 AP
23、的使用量的使用量。水封的时候水要慢慢加入，太快会导致胶面不平。水封的时候水要慢慢加入，太快会导致胶面不平。插梳子的时候要用力均匀，一次成型。插梳子的时候要用力均匀，一次成型。在上样前可在上样前可 20V 恒压预电泳恒压预电泳 20 分钟，可去除泳道中的杂分钟，可去除泳道中的杂质。质。8、电泳注意事项、电泳注意事项 原则上每次上样前将原则上每次上样前将蛋白重新煮沸变性蛋白重新煮沸变性。0.75mm 厚厚的的 SDS PAGE 的的 10 孔孔梳每孔最多可上蛋梳每孔最多可上蛋白体积为白体积为 20ul，15 孔孔梳每孔最多可上蛋白体积为梳每孔最多可上蛋白体积为 10ul。一般的蛋白每孔上样总量为一
24、般的蛋白每孔上样总量为 20ug 比较适宜比较适宜,特殊蛋白特殊蛋白特殊对待，特殊对待，0.75mm 厚度的胶，每泳道厚度的胶，每泳道最高承受能力为最高承受能力为100ug。为保持条带的美观，不同浓度的蛋白上样导致加样体为保持条带的美观，不同浓度的蛋白上样导致加样体积不同时，最好用积不同时，最好用 1 的上样缓冲液补平。的上样缓冲液补平。看看溴酚蓝压缩成一条线溴酚蓝压缩成一条线后把电压调为后把电压调为 100V。当溴酚蓝跑至离胶的下面还有当溴酚蓝跑至离胶的下面还有 0.4 0.6mm 时停止电泳时停止电泳。只要被检测蛋白量只要被检测蛋白量占总蛋白的占总蛋白的 1/105,即可被检测。即可被检测
25、。9 9、蛋白、蛋白 markermarkerNEB 蛋白 markerBio-rad 彩虹 marker在泳、泳后，以及膜后泳情和估移率。电时电转监测电况计迁得注意的是染蛋白值预M arker染料共价耦，泳移特性可能与联电时迁会生某些化，发变致一些偏差，不太适合精确定位蛋白导。10、胶上蛋白质的检测（染色）、胶上蛋白质的检测（染色）考马斯亮蓝染色银 染最小检出量为 0.1ug最小检出量为 0.1-1ng1、半干法 将凝胶和固相基质象三明治一样加将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液在用缓冲液湿润滤纸之间湿润滤纸之间，电转，电转 1030m i n。2、湿法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，将
26、凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液浸泡在转移装置的缓冲液中，电转中，电转45m i n或过夜。或过夜。七、转 膜七、转 膜 蛋白质带负电荷，凝胶在负极一侧，膜在正蛋白质带负电荷，凝胶在负极一侧，膜在正极一侧，接通电源以后，蛋白质由负极向正极转极一侧，接通电源以后，蛋白质由负极向正极转移至膜上。移至膜上。聚丙烯酰胺胶聚丙烯酰胺胶-膜三明治膜三明治半干转 快速，约 10-30m i n湿转 定，较稳250m A，1.5-2h 3、半干转仪、半干转仪4、湿转槽、湿转槽Mini Trans-Blot cell components5、三种膜的特点比较、三种膜的特点比较6、转膜注意事项、
27、转膜注意事项恒流恒流 250mA，1.5h-2h，根据，根据所需蛋白的分子量来调节所需蛋白的分子量来调节。PVDF 膜用前先在甲醇中浸泡膜用前先在甲醇中浸泡 15 秒钟秒钟，然后在转膜液中浸泡，然后在转膜液中浸泡 15 分钟分钟以上后方可使用。以上后方可使用。“三明治”的制作需在转膜液中进行，确保各层精确对齐且三明治”的制作需在转膜液中进行，确保各层精确对齐且不能留不能留有气泡有气泡，胶靠负极（黑色），膜靠正极（白色）。，胶靠负极（黑色），膜靠正极（白色）。半干转对胶、膜及滤纸的大小要求比较高，半干转对胶、膜及滤纸的大小要求比较高，滤纸不能大于膜和胶而直滤纸不能大于膜和胶而直接接触接接触，这样
28、会引起短路，湿转的要求不是很高。，这样会引起短路，湿转的要求不是很高。胶的左右方向要记牢，膜上做好标记胶的左右方向要记牢，膜上做好标记。为了为了防止过热因而导致在夹层中形成气泡或使凝胶变形防止过热因而导致在夹层中形成气泡或使凝胶变形，条带扭曲，条带扭曲，转移过程应在冷室中进行。转移过程应在冷室中进行。7、转膜后检测、转膜后检测丽春红染色丽春红染色 可逆，灵敏度较低，且红色不易拍照 可逆，灵敏度较低，且红色不易拍照氨基黑染色 氨基黑染色 不可逆不可逆，灵敏度为，灵敏度为 30ng/条带条带印度墨汁染色 印度墨汁染色 不可逆不可逆，灵敏度为，灵敏度为 6ng/条带条带胶体金染色 灵敏度最高，胶体金
29、染色 灵敏度最高，400pg/条带条带八、免疫学检测八、免疫学检测脱脂奶粉（脱脂奶粉（5）BSA（3%）Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供）膜封闭液（生物试剂公司提供）2、封闭液1、洗膜 TBST：Tris-base 2.42 g（pH 7.6），NaCl 8.0 g，Tween-20 1ml，定容至 1000ML 3、封闭注意事项封闭的作用是封闭膜上非特异性位点，防止抗体非特异性地结合在膜上。可 4度过夜或在常温 1-3h。尼龙膜及 PVD F 膜可适当延长封闭时间。奶粉封闭液最为物廉价美，但若牛奶中可能含有需 w estern的蛋白时，则不能用其作为封闭液。也可用 3%B
30、SA封闭。ProteinProteinBlocking AgentBlocking AgentBlocking Agent4、免疫学反应抗体：单克隆抗体，多克隆抗体一抗：种族特异性：H,R,M，来源:兔源，小鼠源，鸡源二抗：羊抗兔，兔抗小鼠，驴抗兔 酶偶联：AP、HRPProteinPrimary AntibodyE EE ESecondary Antibody5、多克隆抗体 抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组球蛋白，这就是免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体。抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由
31、一个 B 淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体（Monclone antibody）。由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，机体内所产生的抗体就是多克隆抗体；除了抗原决定簇的多样性以外，同样一类抗原决定簇，也可刺激机体产生IgG、IgM、IgA、IgE 和 IgD 等五类抗体。6、单克隆抗体抗体是由 B 淋巴细胞分化形成的浆细胞合成、分泌的。每一个 B 淋巴细胞在成熟的过程中通过随机重排只产生识别一个抗原的抗原受体基因。动物脾脏有上百万种不同的 B 淋巴细胞系，重排后具有不同基因不同的B 淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗
32、原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的 B 细胞。被激活的 B 细胞分裂增殖形成效应 B 细胞（浆细胞）和记忆 B 细胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。单克隆抗体由可以制造这种抗体的免疫 B细胞与骨髓瘤细胞融合后的细胞产生的，这种融合细胞即具有瘤细胞不断分裂的能力，又具有免疫细胞能产生抗体的能力。融合后的杂交细胞(杂种瘤)可以产生大量相同的抗体。7、一抗、二抗孵育、一抗、二抗孵育将膜放在将膜放在密闭塑料袋密闭塑料袋或者培养皿中，根据或者培养皿中，根据膜面积以膜面积以 0.1m l/cm
33、2的量加的量加入加入一抗溶液与滤膜温育。入加入一抗溶液与滤膜温育。37 2-4小时或小时或 4 过夜过夜。用用 TBST洗液洗膜洗液洗膜 3次次，每次，每次 5-10m i n。加入用加入用 TBST配制的二抗配制的二抗，摇床上缓慢摇动，摇床上缓慢摇动，常温常温 1小时小时。用用 TST洗液洗膜洗液洗膜 3次次，每次，每次 10m i n。抗体的结合抗体的结合常用抗体品牌：Cell Signaling，R&D，Chemicon，Rockland，BD，Santa-cruz，Sigma。抗体需分装，冰冻保存，避免反复冻融。一般抗体可反复使用两次（一周内）。抗体浓度过低则检测不出条带，但浓度高了也不行，一抗浓度过高易产生杂带，二抗浓度过高易发生背景，要在“平衡木”上保持平衡，找到一个平衡点。也可用洗脱液的盐离子浓度高低、洗膜时间长短，及洗膜力度的大小来调节抗体的结合程度。8、二抗与底物显色反应
