1、 实验二实验二 食品中大肠菌群的检验一、实验目的一、实验目的l1.1.了解大肠菌群在食品检验中的意义。了解大肠菌群在食品检验中的意义。l2.2.掌握检验的程序和步骤。掌握检验的程序和步骤。l3.3.通过通过MPNMPN检索表的检索得出实验结果。检索表的检索得出实验结果。二、基本原理二、基本原理l大肠菌群系指一群在大肠菌群系指一群在32323737下下24hr24hr内，能发酵内，能发酵乳糖产酸、产气、需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性乳糖产酸、产气、需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌群主要来源于人畜粪便，故以无芽孢杆菌。该菌群主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标，来评价食品卫生质量，具此
2、作为粪便污染指标，来评价食品卫生质量，具有广泛的卫生学意义。有广泛的卫生学意义。l食品中大肠杆菌群数是以每食品中大肠杆菌群数是以每100mL100mL（g g）检样内大）检样内大肠菌群最近似数（肠菌群最近似数（MPNMPN）来表示，据此含义，所有）来表示，据此含义，所有食品卫生标准中所规定的大肠菌群数均应为食品卫生标准中所规定的大肠菌群数均应为100mL100mL（g g）食品内允许含有大肠菌群的实际数值，）食品内允许含有大肠菌群的实际数值，为报告标准。为报告标准。l1 1、牛天贵主编、牛天贵主编食品微生物学实验技术食品微生物学实验技术实验十二实验十二 大肠菌群检验大肠菌群检验l2 2、GB
3、4789.3-2010 GB 4789.3-2010 大肠菌群计数大肠菌群计数l3 3、大肠菌群大肠菌群PetrifilmTM测试纸片法测试纸片法l4 4、美国、美国FDAFDA标准方法（标准方法（行业标准采用两步法）行业标准采用两步法）：用于对出口食品中大肠菌群进行检验用于对出口食品中大肠菌群进行检验三、检测方法三、检测方法一、牛天贵主编一、牛天贵主编食品微生物学实验技术食品微生物学实验技术 实验十二实验十二 大肠菌群检验大肠菌群检验初发酵分分离离培培养养复发酵（证实试验）复发酵（证实试验）实验操作步骤：实验操作步骤：乳糖发酵试验乳糖发酵试验分离培养分离培养证实试验证实试验样品稀释后，样品稀
4、释后，选择三个稀释选择三个稀释度，每个稀释度，每个稀释度接种三管乳度接种三管乳糖胆盐发酵管。糖胆盐发酵管。361培养培养482h，观察是，观察是否产气。否产气。将产气发酵管将产气发酵管培养物转种于培养物转种于伊红美蓝琼脂伊红美蓝琼脂平板上，平板上，361培养培养18-24h，观察菌落，观察菌落形态。形态。挑取平板上的挑取平板上的可疑菌落，进可疑菌落，进行革兰氏染色行革兰氏染色观察。同时接观察。同时接种乳糖发酵管种乳糖发酵管361培养培养242h，观察产，观察产气情况。气情况。根据证实为根据证实为大肠杆菌阳大肠杆菌阳性的管数，性的管数，查查MPN表，表，报告每报告每100ml（g）大肠菌群的大肠
5、菌群的MPN值。值。实验所需培养基及作用l乳糖胆盐发酵管乳糖胆盐发酵管（初发酵）（初发酵）l伊红美蓝琼脂培养基伊红美蓝琼脂培养基（鉴别培养基（鉴别培养基 分离培养）分离培养）l乳糖发酵管乳糖发酵管（复发酵）（复发酵）1、乳糖胆盐发酵管、乳糖胆盐发酵管l成分：蛋白胨成分：蛋白胨20g、猪胆盐、猪胆盐5g、乳糖、乳糖10g、0.04%溴甲酚紫水溶液溴甲酚紫水溶液25mL、蒸馏水、蒸馏水1000mL，pH值值7.4l制法：略制法：略l实验现象：如图实验现象：如图2、伊红美蓝琼脂培养基（、伊红美蓝琼脂培养基（EMB）l成分：成分：蛋白胨蛋白胨10g10g、乳糖、乳糖10g10g、K2HPOK2HPO4
6、 42g2g、琼脂、琼脂17g17g，2%2%伊红伊红Y Y溶液溶液20mL20mL、0.65%0.65%美蓝溶液美蓝溶液10mL10mL，蒸馏水，蒸馏水1000mL1000mL，pHpH值值7.1 7.1 l制法：制法：将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，校正校正pHpH值，分装于烧瓶内，值，分装于烧瓶内，121121高压灭菌高压灭菌15min15min备备用；临用时加入乳糖（用；临用时加入乳糖（115 20min115 20min）并加热融化琼）并加热融化琼脂，冷至脂，冷至505055 55，加入伊红和美蓝溶液），摇匀，加入伊红和美蓝溶液），摇匀后倾
7、注平板。后倾注平板。l现象及原理现象及原理大肠杆菌：大肠杆菌：菌落深紫色，且有菌落深紫色，且有绿色金属光泽；绿色金属光泽；产酸能力较弱的几种肠道菌：产酸能力较弱的几种肠道菌：也有相应的棕色；也有相应的棕色；不发酵乳糖的肠道菌：不发酵乳糖的肠道菌：菌落是菌落是无色透明的，比如变形菌属，无色透明的，比如变形菌属，沙门氏菌属沙门氏菌属2、伊红美蓝琼脂培养基（、伊红美蓝琼脂培养基（EMB）3、乳糖发酵管乳糖发酵管l成分成分：蛋白胨蛋白胨20g、乳糖、乳糖10g、0.04%溴甲酚紫溴甲酚紫水溶液水溶液25mL、蒸馏水、蒸馏水1000mL，pH值值7.4l制法：制法：将蛋白胨及乳糖溶于水中，校正将蛋白胨及
8、乳糖溶于水中，校正pH值，加值，加入指示剂，分装入指示剂，分装3mL试管，并放入一个小倒管，试管，并放入一个小倒管，115灭菌灭菌15min。实验操作步骤：1）检样稀释）检样稀释（无菌操作）无菌操作）将将25mL（或（或g）检样置于含）检样置于含225mL灭菌生理盐水的灭菌玻灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶，充分振摇（固体检样用匀浆器，用璃瓶，充分振摇（固体检样用匀浆器，用800010000r/min的速度处理的速度处理1 min）制成制成1：10的均匀稀释液。的均匀稀释液。用用1mL灭灭菌菌吸吸管管吸吸取取1：10稀稀释释液液1mL，注注入入含含有有9mL灭灭菌生理盐水的试管内，混匀，制成菌生理盐水
9、的试管内，混匀，制成1：100的稀释液。的稀释液。另另取取1mL灭灭菌菌吸吸管管，按按操操作作依依次次做做10倍倍递递增增稀稀释释液液，每每稀释一次，换用一支稀释一次，换用一支1 mL灭菌吸管。灭菌吸管。2）乳糖发酵实验）乳糖发酵实验 接接种种1mL待待检检样样品品于于乳乳糖糖胆胆盐盐发发酵酵管管内内。接接种种3个个稀稀释释度度，每每一一稀稀释释度度接接种种3管管，置置（36土土1)温温箱箱内内培培养养（24士士2)h。如如所所有有乳乳糖糖胆胆盐盐发发酵酵管管都都不不产产气气，则则可可报报告告为为大大肠肠杆杆菌菌群群阴阴性性，如如有有产产气气者，则按下列程序进行。者，则按下列程序进行。3）分离
10、培养分离培养 将产气的发酵管分别转接在伊红美蓝将产气的发酵管分别转接在伊红美蓝琼脂平板上，置（琼脂平板上，置（36士士1)恒温箱内培养恒温箱内培养1824 h。取出，观察菌落形态，并做革兰氏。取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。染色和证实试验。4）证实试验证实试验 在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1一一2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置（管，置（36士士1)恒温箱内培养（恒温箱内培养（24士士2)h，观察产气情况。凡乳糖产酸产气、革兰氏染观察产气情况。凡乳糖产酸产气、革兰氏染色为阴性的无芽袍杆菌，即可报告为
11、大肠菌色为阴性的无芽袍杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。群阳性。取产酸产气的发取产酸产气的发酵管中培养液在酵管中培养液在伊红美兰平板上伊红美兰平板上进行划线进行划线取有核心和取有核心和带金属光泽带金属光泽的深紫色菌的深紫色菌落进行革兰落进行革兰氏染色氏染色乳糖蛋白胨培养乳糖蛋白胨培养液液镜检（镜检（革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌）37 培养培养48h证实产证实产气（阳气（阳性）结性）结果与否果与否37 培养培养24h37培养培养24h 实验报告实验报告 根根据据证证实实为为大大肠肠菌菌群群阳阳性性的的管管数数，查查MPN检检索索表表，报报告告每每100mL（或或g）大大肠肠菌菌群的群的MPN。结果表示方
12、法：结果表示方法：120MPN/100mL（g）附表：附表：大肠菌群最大可能数（大肠菌群最大可能数（MPN）检索表）检索表注：注：本表采用本表采用3 3个稀释度：个稀释度：1ML(g)1ML(g)，0.1mL(g0.1mL(g）和）和0.01 mL(g)0.01 mL(g)。每稀释度。每稀释度3 3管。管。表内所列检样量如改用表内所列检样量如改用10mL(g)10mL(g)，1mL(g1mL(g）和）和0.1mL(g0.1mL(g）时，表内数字应相应降低）时，表内数字应相应降低1010倍；如改倍；如改用用0.1ML(g),0.01ML(g0.1ML(g),0.01ML(g）和）和0.001mL
13、(g0.001mL(g）时，则）时，则表内数字应相应增加表内数字应相应增加1010倍，其余可类推。倍，其余可类推。表10毫升、1毫升、0.1毫升检样各接种3管的大肠杆菌最近似数检索表阳性管MPN阳性管MPN阳性管MPN10ml1ml0.1ml10ml1ml0.1ml10ml1ml0.1ml00131201123353002612115300230039122203013901031232430264011613016303950129131203104301312132243117502061332931212002192009313160022122011432093023162022032
14、115003092032632221003113210153232900321621120330240033192122733146010042133433211001017220213331100+1021122128103152223511072234211111230291121523136113192324450ml管阳性数10ml管阳性数1ml管阳性数每100ml的MPN000000110022010101120123020202130224030303150326100110131024103611031115112711391205121712210123121308l表表2-3
15、 502-3 50毫升检样接毫升检样接种种1 1管、管、1010毫毫升、升、1 1毫升检毫升检样各接种样各接种3 3管管的大肠杆菌的大肠杆菌最近似数检最近似数检索表索表相关视频lhttp:/ 4789.3-2010 GB 4789.3-2010 大肠菌群计数大肠菌群计数第一法：大肠菌群第一法：大肠菌群MPNMPN计数法计数法第二法：大肠菌群平板计数法第二法：大肠菌群平板计数法第第一一法法：大大肠肠菌菌群群MPN计计数数法法 需要用到的培养基需要用到的培养基（1 1）LSTLST肉汤培养基：月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤培养基：月桂基硫酸盐胰蛋白胨成分：成分：胰蛋白胨或胰酪胨（胰蛋白胨或胰酪胨（Try
16、ticaseTryticase）20g20g，NaCL NaCL 5.0g5.0g，乳糖，乳糖5.0g5.0g，K K2 2HPOHPO4 4 2.75g 2.75g，KHKH2 2POPO4 4 2.75g 2.75g，月桂基硫酸钠月桂基硫酸钠0.1g0.1g，蒸馏水，蒸馏水1000mL1000mL。制法：制法：将各成分溶解于蒸馏水中。分装到有倒立发酵将各成分溶解于蒸馏水中。分装到有倒立发酵管的管的20mm20mm150mm150mm试管中，每管试管中，每管10mL10mL。121121高压灭高压灭菌菌15min15min。最终。最终pH6.8pH6.80.20.2。（2 2）BGLBBGL
17、B：煌绿乳糖胆盐肉汤：煌绿乳糖胆盐肉汤成分：成分：蛋白胨蛋白胨10.0g10.0g，乳糖，乳糖10.0g10.0g，牛胆粉溶，牛胆粉溶液液200mL200mL，0.1%0.1%煌绿水溶液煌绿水溶液13.3mL13.3mL，蒸馏，蒸馏水水800mL800mL，pH7.2pH7.20.10.1。制法：略制法：略抑菌剂的选择抑菌剂的选择l大大肠肠菌菌群群检检验验中中常常用用的的抑抑菌菌剂剂有有胆胆盐盐、十十二二烷烷基基硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。l抑抑菌菌剂剂的的主主要要作作用用是是抑抑制制其其它它杂杂菌菌，特特别别是是革革兰兰氏氏阳阳性性菌菌的的
18、生生长长。国国家家标标准准中中LSTLST肉肉汤汤利利用用十十二二烷烷基基硫硫酸酸钠钠作作为为抑抑菌菌剂剂，BGLBBGLB肉肉汤汤利利用用煌煌绿绿和和胆胆盐盐作为抑菌剂。作为抑菌剂。l抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，而有利于大抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，而有利于大肠菌群细菌的生长和挑选，但对大肠菌群中的某肠菌群细菌的生长和挑选，但对大肠菌群中的某些菌株有时也产生一些抑制作用。些菌株有时也产生一些抑制作用。实验步骤及操作要点：1）无菌取样并制作梯度稀释液；）无菌取样并制作梯度稀释液；2）样品匀液的）样品匀液的pH 值应在值应在6.57.5 之间，必要时分之间，必要时分别用别用1 mol/L
19、 NaOH 或或1 mol/L HCl 调节。调节。3）从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超）从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过过15 min。l4）初发酵试验）初发酵试验 每个样品，选择每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管）肉汤，每管接种接种1mL（如接种量超过（如接种量超过1 mL，则用双料，则用双料LST肉肉汤），汤），361 培养培养24 h2 h，观察倒管内是否，观察倒管内是否有气泡产生
20、，有气泡产生，24 h2 h产气者进行复发酵试验，产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至如未产气则继续培养至48 h2 h，产气者进行复，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。LST结果判断结果判断l大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管。用手轻轻打动试管。5）复发酵试验）复发酵试验 用接种环从产气的用接种环从产气的LST
21、肉汤管中分别取肉汤管中分别取培养物培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，）管中，36 1培养培养48 h2 h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。阳性管。6）大肠菌群最可能数（）大肠菌群最可能数（MPN）的报告）的报告 按按5）确证的大肠菌群）确证的大肠菌群LST阳性管数，检阳性管数，检索索MPN表（见附录表（见附录B），报告每），报告每g（mL）样品中大肠菌群的样品中大肠菌群的MPN值。值。表表B.1 大大肠肠菌菌群群最最可可能能数数（MPN）检检索索表表第第二二法法：大大肠肠菌菌群群平平板板计计数数法法 需
22、要用到的培养基需要用到的培养基（1 1）VRBAVRBA：结晶紫中性红胆盐琼脂：结晶紫中性红胆盐琼脂成分：蛋白胨成分：蛋白胨7.0g7.0g，酵母膏，酵母膏3.0g3.0g，乳糖，乳糖10.0g10.0g，氯，氯化钠化钠5.0g5.0g，胆盐或，胆盐或3 3号胆盐号胆盐1.5g1.5g，中性红，中性红0.03g0.03g，结晶紫结晶紫0.002g0.002g，琼脂，琼脂15g15g18g18g，蒸馏水，蒸馏水1000mL1000mL，pH7.4pH7.40.11）样品的稀释）样品的稀释：如第一法：如第一法2）平板计数平板计数 选取选取2个个3个适宜的连续稀释度个适宜的连续稀释度,每个稀释度接种
23、每个稀释度接种2个个无菌平皿，每皿无菌平皿，每皿1 mL。同时取。同时取1 mL生理盐水加入无菌平生理盐水加入无菌平皿作空白对照。皿作空白对照。3）及时将）及时将15 mL20 mL冷至冷至46 的结晶紫中性红胆盐琼的结晶紫中性红胆盐琼脂（脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3 mL4 mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于覆盖平板表层。翻转平板，置于36 1 培养培养18 h24 h。实验步骤及操作要点：4）平板菌落数的选择）平板菌落数的选择 选取菌落数在选取
24、菌落数在15 CFU150 CFU 之间的之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径盐沉淀环，菌落直径为为0.5 mm 0.5 mm 或更大。或更大。5）证实试验）证实试验 从从VRBA 平板上挑取平板上挑取10 个不同类型的典个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于型和可疑菌落，分别移种于BGLB 肉汤管肉汤管内，内，36 1 培养培养24 h48 h，观察产气，观察产气情况。凡情况。凡BGLB 肉汤管产气，即可报告为肉汤管产气，即可报告为大
25、肠菌群阳性。大肠菌群阳性。6）大肠菌群平板计数的报告）大肠菌群平板计数的报告 经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以4）中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为）中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每每g（mL）样品中大肠菌群数。）样品中大肠菌群数。例：例：10-4样品稀释液样品稀释液1 mL，在，在VRBA平板上有平板上有100个个典型和可疑菌落，挑取其中典型和可疑菌落，挑取其中10个接种个接种BGLB肉汤肉汤管，证实有管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：1006/10104/g（mL）=6.0105CFU
26、/g（mL）。）。三三 大肠菌群大肠菌群PetrifilmTM测试纸片法测试纸片法四、美国四、美国FDAFDA标准方法标准方法行业标准采用两步法：行业标准采用两步法：用于对出口食品中大肠菌群进行检验用于对出口食品中大肠菌群进行检验 推测试验推测试验证实试验证实试验样品稀释后，样品稀释后，选择三个稀释选择三个稀释度，每个稀释度，每个稀释度接种三管度接种三管LST肉汤发酵管。肉汤发酵管。361培养培养482h，观察是，观察是否产气。否产气。将产气发酵管将产气发酵管培养物转种于培养物转种于煌绿乳糖胆盐煌绿乳糖胆盐（BGLBBGLB）肉汤）肉汤中，中，361培培养养482h ，观观察是否产气察是否产气。以以BGLBBGLB产产气为阳性，气为阳性，查查MPN表，表，报告每报告每ml（g）样品中大样品中大肠菌群的肠菌群的MPN值。值。思考题思考题1三三步步法法大大肠肠菌菌群群的的检检验验分分哪哪几几个个步步骤骤？各各有何作用？有何作用？2在在糖糖发发酵酵试试验验中中，若若发发现现发发酵酵倒倒管管内内存存在在极极微微小小的的气气泡泡，这这种种情情况况可可否否算算作作产产气气阳阳性？性？3造成本实验误差的主要原因有哪些？造成本实验误差的主要原因有哪些？
