1、微生物细胞破碎微生物细胞破碎n微生物代谢产物分泌到细胞外，称为微生物代谢产物分泌到细胞外，称为胞外胞外产物产物；目的产物存在于细胞内部，称为；目的产物存在于细胞内部，称为胞胞内产物内产物。第一节第一节 细胞壁的组成与结构细胞壁的组成与结构微生物微生物革兰氏革兰氏阳性细菌阳性细菌革兰氏革兰氏阴性细菌阴性细菌酵母酵母霉菌霉菌壁厚壁厚20-80nm20-80nm10-13nm10-13nm100-300nm100-300nm100-250nm100-250nm层次层次单层单层多层多层多层多层多层多层主要主要组成组成肽聚糖肽聚糖(40-(40-90%)90%)多糖多糖胞壁酸胞壁酸蛋白质蛋白质脂多糖脂多
2、糖(1-4%)(1-4%)肽聚糖肽聚糖 (5-10%)(5-10%)脂蛋白脂蛋白脂多糖脂多糖(11-22%)(11-22%)磷脂磷脂蛋白质蛋白质葡聚糖葡聚糖(30-(30-40%)40%)甘露聚糖甘露聚糖(30%)(30%)蛋白质蛋白质(6-8%)(6-8%)脂类脂类(8.5-(8.5-13.5%)13.5%)多聚糖多聚糖(80-90%)(80-90%)脂类脂类蛋白质蛋白质一、细菌细胞壁一、细菌细胞壁n主要化学成分：主要化学成分：肽聚肽聚糖糖；n主要阻力：主要阻力：肽聚糖的肽聚糖的网状结构网状结构。细菌细胞壁肽聚糖结构细菌细胞壁肽聚糖结构示意图示意图 二、酵母细胞壁二、酵母细胞壁n主要化学成分
3、：主要化学成分：葡葡聚糖、甘露聚糖、聚糖、甘露聚糖、蛋白质和脂类；蛋白质和脂类；n主要阻力：主要阻力：壁结构壁结构交联的紧密程度和交联的紧密程度和它的厚度它的厚度。酵母细胞壁的结构示意图酵母细胞壁的结构示意图三、霉菌细胞壁三、霉菌细胞壁n化学成分化学成分：几丁质：几丁质和葡聚糖；和葡聚糖；n主要阻力：主要阻力：几丁质几丁质或纤维素的纤维状或纤维素的纤维状结构结构。红面包霉菌细胞壁的结构示意图红面包霉菌细胞壁的结构示意图四、细胞壁结构与细胞破碎四、细胞壁结构与细胞破碎n细胞个体小、球形、壁厚、聚合物交联程度高细胞个体小、球形、壁厚、聚合物交联程度高是是最难破碎的最难破碎的。第二节第二节 常用破碎
4、方法常用破碎方法细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂一起快速搅拌，等研磨剂一起快速搅拌，研磨剂与细胞之间的互研磨剂与细胞之间的互相剪切、碰撞相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。，使细胞破碎，释放出内含物。一、珠磨法一、珠磨法(bead mill)(bead mill)珠磨法珠磨法破碎动力学方程破碎动力学方程 ln1/(1-R)=Ktln1/(1-R)=KtnRR破碎率（破碎率（%）nKK破碎速率常数（破碎速率常数（1/s1/s）ntt间歇操作时的破碎时间，连续操作时为细胞间歇操作时的破碎时间，连续操作时为细胞 悬浮液在破碎室内的平均停
5、留时间（悬浮液在破碎室内的平均停留时间（s s）与与K K有关的操作参数有关的操作参数n珠体直径珠体直径 实验室规模研磨机实验室规模研磨机0.2mm，工业规模不得小于，工业规模不得小于0.4mm；n珠体的装量珠体的装量 宜控制在宜控制在80%珠体体积珠体体积/腔体自由体积；腔体自由体积；n细胞浓度细胞浓度 最佳的细胞浓度应该用实验来确定；最佳的细胞浓度应该用实验来确定；n料液性质料液性质n搅拌器转速与构型搅拌器转速与构型n操作温度操作温度珠磨法珠磨法n总的来说：总的来说：延长延长t t，增加珠体装量，提高搅拌，增加珠体装量，提高搅拌转速和操作温度等都可有效提高转速和操作温度等都可有效提高R R
6、。n珠磨法的破碎率一般控制在珠磨法的破碎率一般控制在80%80%以下。以下。因为高因为高的的R R，能耗大；产热多，冷却难度大；产物失，能耗大；产热多，冷却难度大；产物失活损失增加；细胞碎片小，不易分离。活损失增加；细胞碎片小，不易分离。二、高压匀浆法二、高压匀浆法 利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压突然减压和和高高速冲击撞击环速冲击撞击环而使细胞破裂。而使细胞破裂。高压匀浆法高压匀浆法破碎动力学方程破碎动力学方程 ln1/(1-R)=ln1/(1-R)=K Kt tnpnpa anR R 破碎率破碎率nK Kt t与温度等有关与温度等有关的的破碎
7、常数破碎常数nn n 循环操作次数循环操作次数np p 操作压力操作压力na a 与微生物种类有关的常数与微生物种类有关的常数影响影响高压匀浆法高压匀浆法破碎的因素破碎的因素 n压力压力 工业生产中，通常压力为工业生产中，通常压力为555570MPa70MPan温度温度 高温只适用于非热变性产物高温只适用于非热变性产物n菌体种类菌体种类n菌体生长环境菌体生长环境高压匀浆法高压匀浆法n是是大规模大规模细胞破碎的常用方法细胞破碎的常用方法n适用于适用于酵母和大多数细菌细胞酵母和大多数细菌细胞n不适用于不适用于团状或丝状真菌、较小的革兰氏阳团状或丝状真菌、较小的革兰氏阳性菌及有包含体的基因工程菌性菌
8、及有包含体的基因工程菌高压匀浆法与珠磨法比较高压匀浆法与珠磨法比较 高压匀浆法高压匀浆法珠磨法珠磨法操作参数操作参数 少少易确定，适于大规模操作易确定，适于大规模操作多多凭经验估计凭经验估计操作次数操作次数 2-42-4次循环才达高的次循环才达高的R R一次可达高的一次可达高的R R菌种菌种除除丝丝(团团)状状真真菌、小的菌、小的G G+及及有包含体的基因工程菌有包含体的基因工程菌外外各种微生物各种微生物三、超声破碎法三、超声破碎法(UltrasonicationUltrasonication)n一般认为的机理是：一般认为的机理是：在超声波在超声波作用下，液体发生空化作用，作用下，液体发生空化
9、作用，空穴的形成、增大和闭合产生空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。胞破碎。n超声波法的超声波法的细胞破碎效率细胞破碎效率与与细细胞种类、浓度和超声波的声频、胞种类、浓度和超声波的声频、声能及处理时间声能及处理时间有关。有关。超声波破碎法的超声波破碎法的特点特点n适应于适应于实验室规模实验室规模的应用的应用n易失活物质不宜用易失活物质不宜用nG G-菌破碎效果好，酵母效果差菌破碎效果好，酵母效果差四、酶溶法四、酶溶法n利用利用酶反应，分解破坏细胞壁上的特殊键，从酶反应，分解破坏细胞壁上的特殊键，从而达到破壁的目的。而达到破壁的目的。n有两种酶溶
10、法：有两种酶溶法：外加酶法、自溶法。外加酶法、自溶法。1 1、外加酶法、外加酶法 n革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌溶菌酶溶菌酶n革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌溶菌酶和螯合剂溶菌酶和螯合剂EDTAEDTAn放线菌放线菌溶菌酶溶菌酶n酵母、霉菌酵母、霉菌蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶n植物细胞植物细胞纤维素酶、半纤维素酶纤维素酶、半纤维素酶酵母细胞：蛋白酶酵母细胞：蛋白酶蛋白质蛋白质-甘露聚糖甘露聚糖 葡聚糖酶葡聚糖酶葡聚糖层葡聚糖层 外加酶法的特点外加酶法的特点n优点优点：条件温和，核酸泄出量少，选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，选择性释放产物，细胞外形完整。细胞外形完整。n缺点缺点
11、：酶价格高，通用性差，产物抑制的存在。酶价格高，通用性差，产物抑制的存在。2 2、自溶法、自溶法 n利用微生物体自身产生的酶来溶胞，而不需外利用微生物体自身产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶。加其他的酶。n可控制一定的条件使微生物产生过剩的溶胞酶可控制一定的条件使微生物产生过剩的溶胞酶或激发该酶的活性。或激发该酶的活性。n缺点缺点：易引起所需蛋白质变性；自溶后，细胞：易引起所需蛋白质变性；自溶后，细胞悬浮液粘度上升，过滤速率下降。悬浮液粘度上升，过滤速率下降。五、化学渗透法五、化学渗透法n使用某些可以改变细胞壁或膜的通透性的化使用某些可以改变细胞壁或膜的通透性的化学试剂，使胞内物质有选择地渗透
12、出来，称学试剂，使胞内物质有选择地渗透出来，称为为化学渗透法化学渗透法。n表面活性物质表面活性物质：促使细胞壁或膜某些组分溶解：促使细胞壁或膜某些组分溶解 常用的表面活性剂：十二烷基硫酸钠、常用的表面活性剂：十二烷基硫酸钠、Triton X-Triton X-100100和吐温和吐温(TweenTween)等等nEDTAEDTA螯合剂螯合剂：与细胞壁或膜结构中：与细胞壁或膜结构中CaCa2+2+或或MgMg2+2+螯合螯合化学渗透法的试剂及其原理化学渗透法的试剂及其原理n有机溶剂有机溶剂：能分解细胞壁及膜中的磷脂：能分解细胞壁及膜中的磷脂 常用的有机溶剂：甲苯、二甲苯、氯仿和高级常用的有机溶剂
13、：甲苯、二甲苯、氯仿和高级醇等醇等n变性剂变性剂：与水中氢键作用，减弱水的极性，使：与水中氢键作用，减弱水的极性，使疏水性化合物溶于水。疏水性化合物溶于水。常用的变性剂有：盐酸胍和脲常用的变性剂有：盐酸胍和脲化学渗透法的特点化学渗透法的特点n优点优点：选择性释放产物；细胞外形保持完整，碎选择性释放产物；细胞外形保持完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。步提取。n缺点缺点：通用性差；时间长、效率低；有些化学试通用性差；时间长、效率低；有些化学试剂有毒。剂有毒。六、其他方法六、其他方法nX-pressX-press法法 n渗透压法渗透压法 n反复冻
14、结反复冻结-融化法融化法n干燥法干燥法 1 1、X-pressX-press法法nX-pressX-press法法是将浓缩悬浮液冷却至是将浓缩悬浮液冷却至-25-25形成冰晶形成冰晶体，再利用体，再利用500MPa500MPa以上的高压冲击，使冷冻细胞以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。从高压阀小孔中挤出。n主要用于实验室主要用于实验室，具有适应范围广、破碎率高、，具有适应范围广、破碎率高、细胞碎片粉碎程度地及活性保留率高等优点，但细胞碎片粉碎程度地及活性保留率高等优点，但它不适用于对冷冻敏感的生化物质。它不适用于对冷冻敏感的生化物质。2 2、渗透压法、渗透压法n将细胞置于高渗透压的
15、介质中，达到平衡后，将细胞置于高渗透压的介质中，达到平衡后，把介质突然稀释或将细胞转置于低渗透压的水把介质突然稀释或将细胞转置于低渗透压的水或缓冲溶液中，在渗透压的作用下，水通过细或缓冲溶液中，在渗透压的作用下，水通过细胞壁和膜渗透进细胞内，由于原生质的膨胀而胞壁和膜渗透进细胞内，由于原生质的膨胀而使细胞破裂。使细胞破裂。n适用于适用于易破碎的细胞易破碎的细胞n高渗透压介质：高渗透压介质：一定浓度的甘油或蔗糖溶液。一定浓度的甘油或蔗糖溶液。3 3、反复冻结、反复冻结-融化法融化法n将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多次而达到破壁作用。化，反
16、复多次而达到破壁作用。n原理原理：一方面冷冻能使细胞膜的疏水键结构破：一方面冷冻能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性裂，从而增加细胞的亲水性;另一方面胞内水另一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，剩余胞质盐浓度上升，外结晶，形成冰晶粒，剩余胞质盐浓度上升，外水进入，引起细胞膨胀而破裂。水进入，引起细胞膨胀而破裂。n只适用于只适用于细胞壁较脆弱的菌体细胞壁较脆弱的菌体4 4、干燥法、干燥法使用干燥法使细胞结合的水分丧失，从而改变细使用干燥法使细胞结合的水分丧失，从而改变细胞的渗透性。然后用丙酮、丁醇或缓冲液等对干胞的渗透性。然后用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理，把胞内物质抽提出来。燥
17、细胞进行处理，把胞内物质抽提出来。气流干燥气流干燥真空干燥真空干燥喷雾干燥喷雾干燥冷冻干燥冷冻干燥干燥法干燥法适用于：适用于：酵母酵母 细菌细菌 不稳定的生化物质不稳定的生化物质 第三节第三节 破碎率的测定与破破碎率的测定与破碎技术的研究方向碎技术的研究方向n1 1、直接测定法、直接测定法n2 2、目的产物测定法、目的产物测定法n3 3、导电率测定法、导电率测定法一、破碎率的测定一、破碎率的测定二、破碎技术的研究方向二、破碎技术的研究方向 1 1、多种破碎方法相结合、多种破碎方法相结合2 2、与上游及中游过程相结合、与上游及中游过程相结合n（1 1）控制培养过程）控制培养过程n（2 2）选择较易破壁的菌种作为寄主细胞）选择较易破壁的菌种作为寄主细胞n（3 3）用基因工程的方法对菌种进行改造，如在）用基因工程的方法对菌种进行改造，如在细胞内引进噬菌体基因，培养结束后，控制一定细胞内引进噬菌体基因，培养结束后，控制一定条件，激活噬菌体基因，使细胞自内向外溶解，条件，激活噬菌体基因，使细胞自内向外溶解，释放出细胞内含物。释放出细胞内含物。3 3、与下游过程相结合、与下游过程相结合例：萃取破碎法提取酵母醇脱氢酶例：萃取破碎法提取酵母醇脱氢酶
