1、食品微生物检测食品微生物检测实验部分教材大纲实验部分教材大纲-第一部分第一部分 消毒消毒-1.进入无菌室前的准备进入无菌室前的准备1.1实验前放好需用的实验器材及各种培养基，打开紫外灯消毒3060min。1.2手部的消毒：进入无菌室前，先用肥皂清洗双手，在消毒水中浸泡双手3min后用水冲洗。1.3进入缓冲室：换鞋子或穿鞋套，戴口罩、帽子、手套，穿衣服（有风淋室的，需在风淋室转动站立5min）。2.称样品称样品2.1手部的消毒2.2镊子、剪刀、勺子的消毒。2.3样品包装口的消毒（一个样品换一把镊子、剪刀或勺子）。-3.实验结束后的消毒实验结束后的消毒3.1用过的实验器材经高温消毒后再清洗。3.2
2、实验台面用消毒水擦洗干净。3.3换下的鞋套、口罩、帽子、衣服放入专用垃圾袋进行消毒处理。3.4清洗双手：先用肥皂清洗双手，在消毒水中浸泡双手3min后用水冲洗，再用肥皂清洗双手。3.5打开紫外灯消毒3060min。-第二部分第二部分 菌落总数测定菌落总数测定-检验依据检验依据GB/T 4789.220031菌落总数的定义菌落总数的定义 食品检样经过处理，在一定条件下培养后（如培养基成分、培养温度和时间、PH、需氧性质等），所得1mL(g)检样中所含菌落的总数。2设备和材料设备和材料1.冰箱2.电子天平3.均质器4.恒温水浴锅5.恒温培养箱6.干燥箱7.架盘药物天平8.灭菌吸管：1mL、10mL
3、9.灭菌培养皿：直径90mm10.灭菌剪刀、镊子、勺子等11.酒精灯-3培养基和试剂培养基和试剂1.营养琼脂2.0.85灭菌生理盐水3.75酒精棉球-4检验程序检验程序1.检样稀释及培养检样稀释及培养1.1以无菌操作将检样25g（mL）剪碎放于含有225mL灭菌生理盐水的塑料瓶内，经充分振摇做成1：10的均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置均质器中处理。1.2用1mL灭菌吸管吸取1：10的稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液），振摇试管，混合均匀，做成1：100的稀释液。1.3另取1mL灭菌吸管，按1.2操作方法，做10倍递增稀释，如
4、此每递增稀释一次，即换用1支1mL灭菌吸管。-1.4根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择23个适宜稀释度，分别在做10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1mL稀释液于灭菌培养皿内，每个稀释度做两个培养皿。1.5稀释液移入培养皿后，应及时将凉至46左右营养琼脂（可放置461水浴锅保温）注入培养皿约15mL，并转动培养皿使混合均匀。同时将营养琼脂注入加有1mL稀释液灭菌培养皿内作空白对照。1.6待琼脂凝固后，翻转平板，置361恒温培养箱内培养48h2h。1.7作空白对照的作用 琼脂表面长菌说明空气中带菌，平皿边上长菌说明平皿受到污染，琼脂中间长菌说明稀释液或琼脂带菌。-菌落总数
5、操作步骤25g(mL)样品225mL0.85%灭菌生理盐水1mL 1mL 1:10约15mL营养琼脂吸取1mL9mL0.85%灭菌生理盐水 1mL 1mL 1:100约15mL营养琼脂36 1,培养48h 2h-2.菌落计数方法菌落计数方法 做平板菌落计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。记下各平板的菌落数，求出同稀释度的各平板平均菌落总数。3.菌落计数的报告菌落计数的报告3.1选取菌落数在30300之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数。若两个平板中有一个平板有较大片状菌落生长时，应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落生长
6、不到平板的一半，而其余一半菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数，再采用两个平板平均数作为该稀释度的菌落数。平板内如有链状菌落生长时（菌落之间无明显界线），一条链可视为一个菌落计数。-3.2稀释度的选择稀释度的选择3.2.1选择平均菌落数在30300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之（见表1中例1）。3.2.2若两个稀释度的平均菌落数均在30300之间，则视两者之比决定。若比值2，报告其平均数；若2，报告其中较小的数字（见表1中例2及例3）。3.2.3若所有稀释度的平均菌落数均大于300，按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数（见表1中例4）。3.2.4若所有稀释度的平均菌落数均
7、小于30，按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数（见表1中例5）。3.2.5若所有稀释度均无菌落生长，以小于1乘以最低稀释倍数见表1中例6）。3.2.6若所有稀释度的平均菌落数均不在30300之间，其中一部分大于300，一部分小于30时，按最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数（见表1中例7）。-3.3菌落数的报告菌落数的报告 菌落数在100以内时，按其实有数报告；大于100时采用两位有效数字：小于5舍去，大于5进一位-表表1 稀释度的选择及菌落数报告方式稀释度的选择及菌落数报告方式例次 稀释液及菌落数 两稀释液之比 菌落总数cfu/g（mL）报告方式cfu/g（mL）10-1 10-2 1
8、0-31多不可计 16420 16400 16000或1.6104 2多不可计 295461.637750 38000或3.8104 3多不可计 271602.227100 27000或2.7104 4多不可计 多不可计 313313000 310000或3.1105 527115270 270或2.7102 6000110 10 7多不可计 3051230500 31000或3.1104-4.注意事项注意事项4.1每做一个稀释度换用1支吸管。4.2每支吸管使用前在酒精灯上消毒，从吸管筒拿出来的吸管即使没有用过，也不能放回吸管筒里。4.3在做稀释度时，注意吸管尖端不要触及管内稀释度，盖上试管盖
9、时在酒精灯上消毒，然后振摇试管，混合均匀。吸球不能对着吸管吹，沿管壁徐徐注入，以免带入细菌，影响检测结果。4.4将稀释液注入平皿时，平皿盖不宜离平皿底太远。从平皿筒拿出来的平皿即使没有用过，也不能放回平皿筒里。4.5眼睛平视吸管凹液面的刻度为稀释液的读数。4.6手握吸管时吸管的尖端部向下。-5.常见问题常见问题5.1吸管中稀释液流出部分后堵塞5.2营养琼脂注入后不能凝固（配制中出现的问题）-第三部分第三部分 霉菌和酵母菌计数霉菌和酵母菌计数-检验依据检验依据GB/T 4789.1520031设备和材料设备和材料1.冰箱2.电子天平3.均质器4.恒温水浴锅5.恒温培养箱6.干燥箱7.架盘药物天平
10、8.灭菌吸管：1mL、10mL9.灭菌培养皿：直径90mm10.灭菌剪刀、镊子、勺子等11.酒精灯2培养基和试剂培养基和试剂1.孟加拉红2.0.85灭菌蒸馏水3.75酒精棉球-3检验程序检验程序1.检样稀释及培养检样稀释及培养1.1以无菌操作将检样25g（mL）剪碎放于含有225mL灭菌蒸馏水的塑料瓶内，振摇30min，做成1：10的均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置均质器中处理。1.2用10mL灭菌吸管吸取1：10的稀释液10mL，注入灭菌试管内，另用1mL灭菌吸管反复吹吸50次，使霉菌孢子充分散开。1.3用1mL灭菌吸管吸取1：10的稀释液1mL，注入含有9mL灭菌蒸馏水的试管内，
11、另用1mL灭菌吸管反复吹吸5次，做成1：100的稀释液。-1.4另取1mL灭菌吸管，按1.3操作方法，做10倍递增稀释，如此每递增稀释一次，即换用1支1mL灭菌吸管。1.5根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择23个适宜稀释度，分别在做10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1mL稀释液于灭菌培养皿内，每个稀释度做两个培养皿。1.6稀释液移入培养皿后，应及时将凉至45左右的孟加拉红（可放置451水浴锅保温）注入培养皿约15mL，并转动培养皿使混合均匀。同时将孟加拉红注入加有1mL稀释液灭菌培养皿内作空白对照。1.7待琼脂凝固后，翻转平板，置2528恒温培养箱内培养，3d后开始观
12、察，共培养观察5d。1.8作空白对照的作用 琼脂表面长菌说明空气中带菌，平皿边上长菌说明平皿受到污染，琼脂中间长菌说明稀释液或琼脂带菌。-霉菌和酵母菌计数操作步骤225mL灭菌蒸馏水25g(mL)样品吸取10mL振摇30min9mL灭菌蒸馏水灭菌空试管吸取1mL1:10反复吹吸50次1:10反复吹吸5次1:1001mL1mL1mL1mL约15mL孟加拉红约15mL孟加拉红2528,培养5d-2.霉菌和酵母菌计数方法霉菌和酵母菌计数方法 选择菌落数在10150之间的平皿计数，同稀释度的两个平皿的平均菌落数乘以稀释倍数，即为每克（或毫升）检样中所含霉菌和酵母菌。稀释度选择及菌落报告方式可参考菌落总
13、数测定。3.报告：报告：每克（或毫升）检样中所含霉菌和酵母菌以cfu/g（mL）表示。4.注意事项注意事项4.1每做一个稀释度换用1支吸管。4.2每支吸管使用前在酒精灯上消毒，从吸管筒拿出来的吸管即使没有用过，也不能放回吸管筒里。4.3将稀释液注入平皿时，平皿盖不宜离平皿底太远。从平皿筒拿出来的平皿即使没有用过，也不能放回平皿筒里。4.4眼睛平视吸管凹液面的刻度为稀释液的读数。4.5手握吸管时吸管的尖端部向下。5.常见问题常见问题5.1吸管中稀释液流出部分后堵塞5.2孟加拉红注入后不能凝固（配制中出现的问题）-4菌落总数测定、霉菌和酵母菌计数的区别菌落总数测定、霉菌和酵母菌计数的区别两者的操作
14、步骤基本相似，区别在于以下几点：1.稀释度：稀释度：在作递增稀释倍数时，菌落总数测定不能用吸2.球吸吹吸管，避免将空气中的细菌带入检样中，霉菌和酵母3.菌计数正好相反，用吸球反复吸吹吸管，使霉菌孢子充分散4.开。2.培养基不同：培养基不同：菌落总数测定用营养琼脂，霉菌和酵母菌3.计数用孟加拉红。3.稀释度的选择不同：稀释度的选择不同：菌落总数测定选择平均菌落数在304.300之间的稀释度，霉菌和酵母菌计数选择平均菌落数在5.10150之间的稀释度。4.培养条件不同：培养条件不同：菌落总数测定培养条件为361培养5.48h2h，霉菌和酵母菌计数为2528培养5d。-第四部分第四部分 大肠菌群测定
15、大肠菌群测定-检验依据检验依据GB/T 4789.320031大肠菌群的定义大肠菌群的定义 一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来源于人畜粪便。食品中大肠菌群数系以100mL（g）检样内大肠菌群最可能数（MPN）表示。2设备和材料设备和材料1.冰箱2.电子天平3.均质器4.恒温培养箱5.干燥箱6.架盘药物天平7.灭菌吸管：1mL、10mL8.灭菌培养皿：直径90mm9.灭菌剪刀、镊子、勺子等10.酒精灯11.显微镜12.载玻片-3培养基和试剂培养基和试剂1.乳糖胆盐发酵管2.伊红美蓝琼脂平板3.乳糖发酵管4.0.85灭菌生理盐水5.75酒精棉球6.革兰氏染色
16、液-4检验程序检验程序1.检样稀释：同菌落总数1.1、1.2、1.3操作步骤。2.根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择3.三个稀释度，每个稀释度接种三管。3.乳糖发酵试验乳糖发酵试验3.1将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，接种量在1mL及1mL以下者，用单料乳糖胆盐发酵管，置361培养24h2h。3.2观察现象：观察乳糖胆盐发酵管内的玻璃小导管里是否有气泡，有气泡代表产气。若所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则报告为大肠菌群阴性，若有产气的，则继续接种伊红美蓝琼脂平板。-大肠菌群操作步骤125g(mL)样品225mL0.85%灭菌生理盐水吸取1
17、mL9mL0.85%灭菌生理盐水 各吸取10mL1:10各吸取1mL10mL双料10mL双料10mL双料5mL单料5mL单料5mL单料各吸取1mL1:1005mL单料5mL单料5mL单料361,培养24h 2h-4.分离培养分离培养4.1将产气的乳糖胆盐发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置361培养24h2h。4.2观察菌落形态，大肠菌群在伊红美蓝琼脂平板上：紫黑色有金属光泽、圆形、中等大小、湿润。若平板上出现上述菌落形态，则为可疑菌落。4.3挑取可疑菌落12个进行革兰氏染色镜检。4.3.1革兰氏染色原理 G+的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水
18、而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内不易脱色，呈现紫色。G-的细胞壁中肽聚糖含量低，脂类物质含量高，用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出脱色，然后又被染上复染液的颜色，呈现红色。4.3.2革兰氏染色液有4种：结晶紫染色液(着色)、革兰氏碘液(媒染)、95 乙醇(脱色)、沙黄复染液(着色)。-4.3.3染色步骤：4.3.3.1从伊红美蓝琼脂平板上挑取12个可疑菌落，涂在载玻片中央，在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。4.3.3.2滴加革兰氏碘液，染1min，水洗。4.3.3.3滴加95乙醇脱色，约30s，
19、水洗。4.3.3.4滴加复染液，染1min，水洗，待干，镜检。4.3.3.5镜检：低倍镜高倍镜油镜（滴加香柏油），结束后用二甲苯擦净。4.3.4结果：革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。-大肠菌群操作步骤2观察九管结果不产气大肠菌群阴性报告接种伊红美蓝琼脂平板361 培养24h 2h革兰氏染色镜检乳糖发酵管革兰氏阳性革兰氏阴性无芽胞杆菌大肠菌群阴性报告产气不产气大肠菌群阳性报告大肠菌群阴性报告产气361 培养24h 2h紫色红色-5.证实试验证实试验 同时从伊红美蓝琼脂平板上挑取12可疑菌落接种乳糖发酵管，置361培养24h2h。观察产气情况。若革兰氏染色镜检为阴性的无芽胞杆菌，同时乳糖发
20、酵管产气，即可报告为大肠菌群阳性。6.报告报告 根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL（g）大肠菌群的MPN值（见GB/T 4789.32003表1）。-7.注意事项注意事项7.1检查乳糖胆盐发酵管和乳糖发酵管是否放玻璃小导管。7.2每做一个稀释度换用1支吸管。7.3每支吸管使用前在酒精灯上消毒，从吸管筒拿出来的吸管即使没有用过，也不能放回吸管筒里。7.4眼睛平视吸管凹液面的刻度为稀释液的读数。7.5手握吸管时吸管的尖端部向下。7.6吸球不能对着吸管吹。7.7每接种一根乳糖胆盐发酵管，通过酒精灯消毒盖口，振摇均匀。8.常见问题：常见问题：吸管中稀释液流出部分后堵塞。-第
21、五部分第五部分 培养基的配制培养基的配制-所有培养基用蒸馏水配制，经高压灭菌后使用。1培养基的配制培养基的配制1.营养琼脂2.单料、双料乳糖胆盐发酵管 3.伊红美兰琼脂平板 4.乳糖发酵管 5.孟加拉红 6.0.85灭菌生理盐水 可以直接倒入蒸馏水中，搅拌溶解，分装。先将蒸馏水煮到一定温度，再将称好的培养基倒入，摇匀,继续煮沸溶解。培养基称量后暴露在空气中容易发生潮解，倒入热水中的量少于实际称重的量，所以在实际称重时根据损失的量适当多称少许。-2培养基的保存条件培养基的保存条件3 经高压灭菌后的培养基置经高压灭菌后的培养基置4 左右贮存左右贮存，贮，贮存时间存时间4 4 夏季不超过夏季不超过7 7天，冬季不超过天，冬季不超过1414天。天。3注意事项注意事项4 1.在煮沸溶解培养基时，未溶解的培养基不能粘在玻5 璃器皿的底部，容易发生爆裂。6 2.配制乳糖胆盐发酵管和乳糖发酵管时放玻璃小导管。-第六部分第六部分 报告报告-
