1、菌种保存传代使用销毁标准操作规程样本菌种管理制度1、目 建立菌种保存、传代、使用、销毁原则操作规程，规范微生物学检定用菌种管理，最大限度减少变异率，保证菌种溯源性与稳定性，从而保证微生物学检查成果精确可靠。2、合用范畴 本规程合用于检定用菌种管理，涉及菌种购买、保存、传代、使用及销毁等。3、定义 原则菌株是指由中华人民共和国药物生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供冷冻干燥菌。传代用菌种是指用原则菌株制备采用特定保存办法长期固定保存菌种，用于传代及制备工作用菌种。工作用菌种是指用原则菌株或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为寻常工作使用菌种。菌种代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基
2、内，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得冷冻干燥菌种为第0代。4、职责4.1部门主管负责菌种申购、接受、保存分发。4.2微生物检查员负责菌种确认、传代、使用及销毁。5、规程5.1菌种申购部门主管依照菌种使用状况，提出年度购买筹划（涉及暂时检查需要），填写申购流程，经审批后，向中检所菌种保藏中心或省（市）药检所购买冻干菌种（原则菌株）或传代用菌种，购买时，需拟定菌种代数，以便控制传代代数。5.2菌种接受菌种到达实验室后，由部门主管接受菌种，检查其名称和数量，以及每一支完整性，同步将菌种所有信息，填写在原则菌株库存记录上，内容涉及：名称、数量、编号（无编号者按检定菌种编号原则编号）、代数、来源
3、、接受日期、接受人等，并将其暂贮存于48冰箱中，在一周内必要完毕转种。5.3菌种保存5.3.1工作用菌种保存工作用菌种采用斜面低温保存法。将菌种接种在适当琼脂斜面培养基上，待菌生长充分后来，转移至48冰箱中保存。此法仅用于工作用菌种短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等状况，发现异常状况，经应灭活解决后销毁。保存时间依照菌种种类而不同，细菌：每月转种一次；酵母菌及芽胞：36个月转种一次；丝状真菌每年转种一次。5.3.2传代用菌种保存采用甘油冷冻管保藏法或液体石蜡保存法。5.3.2.1甘油冷冻管保存法用无菌接种环轻轻刮取经冷冻复溶增菌后并接种至平板或琼脂斜面菌苔，并通过接种环与试管壁之间轻轻摩
4、擦而使细菌充分扩散到预先装入试管中无菌纯化水中，调节菌液浓度，使其等同于10号比浊管，向已制备好菌悬液中加入等体积无菌甘油（浓度20%），即为10%甘油菌悬液，轻轻振摇，使内容物充分混合，分装于无菌小试管，在-30冷冻条件下保存。此甘油冷冻管为第2代（G2）。可以每隔2年转种一代。使用时，取出一支放至室温，转种增菌培养或接种至琼脂斜面复苏，挑取纯菌落传代或工作用。此种办法重要合用于需氧细菌和酵母菌保藏（如大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌）。5.3.2.2液体石蜡保存法5.3.2.2.1无菌液体石蜡制备：选用优质化学纯液体石蜡，将液体石蜡分装加塞，用牛皮纸包好，在121灭菌30分钟,
5、置40恒温箱中蒸发水分，经无菌检查后备用。5.3.2.2.2液体石蜡管制备：将菌种穿刺接种于半固体高层培养基中，在适当条件下培养结束后，在层流台下用无菌吸管吸取上述无菌液体石蜡至培养好菌种管内，并使石蜡高出菌种表面约1cm使菌体与空气隔绝，并将试管直立，置于-20冷冻或28冰箱中保存。此法重要合用于霉菌、厌氧菌、放线菌、芽孢杆菌保存（如枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌等）。5.3.3各菌种保存办法、条件及期限，见下表1表1 传代用菌种保存办法、保存温度、保存期限菌种名称保存办法保存温度保存期限大肠埃希菌CMCC(B)44102甘油冷冻管-302年金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003铜绿假单
6、胞菌（CMCC（B）10104）枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501乙型副伤寒沙门菌CMCC(B)50094白色念珠菌CMCC(F)98001液体石蜡管2-81年黑曲霉菌CMCC(F)980035.4菌种解决和保藏5.4.1原则菌株复苏、确认、传代5.4.1.1原则菌株复苏5.4.1.1.1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球。5.4.1.1.2培养基改良马丁琼脂培养基：用于黑曲霉复苏、复壮；液体硫乙醇酸盐培养基：用于生孢梭菌复苏、复壮；营养肉汤培养基：用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮；改良马丁培养基
7、：用于白色念珠菌复苏、复壮5.4.1.1.3原则菌株复苏操作环节：如下操作均在生物安全柜内进行。a)在安瓿外表面用75%酒精擦拭并让其自然风干。b)用一小砂轮在安瓿上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开（启动安瓿时必要小心，由于安瓿遇热时也许会破裂）。c)以无菌办法用一无菌吸管从已准备好上述液体培养基中移取0.50.8 ml到安瓿中。d)轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解。e)用无菌吸管将安瓿内菌液所有转接到相应液体培养基。f)依照安瓿上所标明不同菌种类型而将其培养于相应温度（细菌培养温度3035，培养1824小时；真菌培养温度2328，培养35天。观测与否浑浊，浑浊阐明菌种复
8、苏生长；若不浑浊，细菌应延长培养时间至7天，真菌应延长培养时间至14天，若仍未浑浊，灭菌解决。g)若黑曲霉为菌悬液，则先放置室温待菌悬液融化后用无菌吸管吸取管内液体12滴滴在改良马丁琼脂斜面上，用吸管涂布均匀，置2328培养57天，斜面正面为黑褐色厚绒状，色泽均一，不应有杂色，斜面侧面无色，接近菌层培养基略带黄色。确认后用具有0.05%（ml/ml）吐温-800.9%无菌氯化钠溶液洗脱到无菌试管中。h)取经复苏后上述细菌菌液8-10ml至液体培养基中按f）项操作对菌种进行复壮。以无菌技术向复壮后菌种中加入100ml20%无菌甘油混匀，12ml/管，分装于冻存管。每个菌种制备10支，按顺序进行编
9、号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应确认，别的作为储备管在-30冷冻条件下保存。黑曲霉按g）项下办法进行复壮，制成复壮后孢子悬液20ml。以无菌技术向复壮后菌种菌悬液中12ml/管加石蜡高出菌种表面约1cm使菌体与空气隔绝，并将试管直立，封存于冻存管，置于-20冷冻或28冰箱中保存。制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应确认。别的作为储备管。将上述制备好冻存管逐支粘贴标签。内容涉及：菌种名称、菌种代号、编号、代次、制备日期、制备人、贮存条件、有效期至等。i)储备菌种管制备成功，储存于30，有效期为两年。5.4.1.2原则菌株确认a)用无菌接种环取上述培
10、养物接种到胰酪大豆胨琼脂（TSA）培养基（细菌）或沙氏葡萄糖琼脂培养基（真菌和酵母菌）平板上，或相应宜于该菌生长鉴别培养基平板上。b)然后在3035下培养3天（细菌）；2025下培养5天（真菌和酵母菌）。c)培养后，一方面观测其与否具备典型菌落形态，然后挑取生长旺盛单一纯菌落，划线于平皿培养基，每种菌划4个平皿，以便收集较多生长旺盛典型单菌落，进行保存和鉴定。d)鉴定期作革兰氏染色、镜检，观测其染色特性及形态特性。必要时再做生化实验以进一步鉴定该菌种。e)若在该平板上发既有其他菌落生长，则阐明操作有污染或菌种不纯，应将此被污染了培养物灭活解决，并寻找因素。应依照其因素采用办法重新分离挑选纯菌落
11、。f)菌种确认成果，记录在菌种鉴定记录上。g)各菌种复活、划线用培养基、培养条件，见菌种复活、划线用培养基、培养条件（附件2）。5.4.1.3菌种传代5.4.1.3.1原则菌株传代a)按菌种阐明书规定复溶菌粉，转种于适当增菌培养基内，称第1代（G1），复壮后转接至平板上，并在恰当温度下培养恰当时间，分离单个纯种菌落，此为第2代（G2）。b)菌种确认后，挑取平板上纯菌落制成浓菌悬液用于制备甘油冷冻管或液体石蜡管，作为保存菌种（G2），也称传代用菌种，同步挑取纯菌落转接斜面菌种数支，作为工作用菌种，此为第3代（W3）。c)将第2代（G2）菌种管冷冻保存，将工作用菌（W3）于恰当温度下培养恰当时间后
12、用于寻常检查。d)取一支冷冻保存第2代（G2）菌种转种于平板和斜面培养基上。平板上菌种制成冷冻保存管第3代（G3）；斜面培养基菌种经恰当温度下培养恰当时间后用作工作用菌种，此仍为第3代（W3）。e)将第3代菌种（G3）冷冻或低温保存，将生长、转种后第2代（G2）菌种经高温灭活解决后丢弃。f)按上述规程操作，直至G4转为W5为止，需重新启动冷冻干燥菌种，重复上述规程操作，保存和使用菌种。g)当工作用菌种代数不大于5时，在规定保存期限内，可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种。5.4.1.3.2传代用菌传代将购回无异常传代用菌种（普通为第3代），依照寻常检查工作需要量，挑取纯菌落转接斜面菌种
13、数支，作为工作用菌种(为第4代)，同步，结合菌种代数和最长保存期限，挑取纯菌落制成浓菌悬液按“5.3.2”办法制备甘油冷冻管或液体石蜡管数支，作为传代用菌种（仍为第3代）。5.4.1.3.2.1传代用菌传代操作环节从冰箱冷藏室（28）中取出菌种斜面后，应温室放置约30min。将装有新鲜配制培养基和传代菌种一并移入生物安全柜内，打开紫外灯照射1小时。关闭紫外灯。酒精灯，左手握住菌种斜面，将管口接近火焰上方，右手拿接种环，将接种环烧红约30s，5.4.1.3.2工作用菌种传代当工作用菌种代数不大于5时，可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种。取在冰箱48保存工作用菌种用普通琼脂斜面传代，并将
14、新传代培养物代替原有菌种，作为工作用菌种。也可取用“甘油冷冻管保藏法或液体石蜡覆盖保藏法”保存菌种，进行复苏，直接作为工作用菌种。细菌每1个月传代一次；酵母菌每2个月传代一次；霉菌及芽胞每3个月传代一次。当超过5代，须用传代用菌种传代。5.4.4注意事项：传代时注意无菌操作，使菌株不死亡，不污染、不丢失。同步实验人员也要采用有效防止办法进行自我保护，如工作时必要穿工作服，佩带无菌手套，实验完毕后来消毒实验进行区域、实验仪器和器具。如发生意外，如菌种泄漏或人员受伤，微生物学检查人员应及时向部门主管报告以便及时进行解决。5.4.5传代后，按检定菌种编号原则编号，并在每一支菌种管上贴上标签，标签内容
15、涉及：名称、编号、代数、传代日期、操作人、有效期。交部门主管统一保管。同步及时填写菌种传代记录（附表2）。5.5检定菌种编号采用字母加数字表达：英文缩写字母代次传代日期顺序号菌种英文缩写字母：大肠埃希菌（E.c）、金黄色葡萄球菌（S.a）、枯草芽孢杆菌（B.s）、白色念珠菌（C.a）、黑曲霉菌（A.n）、乙型副伤寒沙门菌（S.p）代数用一位带有下标数字字母表达：传代用菌种用G表达；工作用菌种用W表达；如G3表达传代用菌种第3代；W3表达工作用菌种第3代。传代日期用6位数字表达：年份取最后两位数，月、日分别用两位数。如：1月12日传代第一支大肠埃希菌作为传代用菌种编号为E.c-G3-12-01。5.6检定菌种保管5.6.1检定菌种设专人加双锁保管，并对所保存菌种建立检定菌种保存、领用登记台账（附表3）。5.6.2检定菌种定期检查与鉴定 在菌种保存期间，工作日应每天检查保存菌种冰箱温度、必要时检查菌种管塞子与否松动，与否染杂菌等，并及时填写检定菌种观测记录（附表4），如有异常应及时解决。菌种在保存期内均应依照菌种特性（工作用菌种每转种两代一次、传代用菌种每三个月一次）检查其菌落性状、革兰染色、显微镜
