1、流式细胞仪实验方式流式细胞仪实验方式一、实验预备1标本制备：2.最小化非特异性结合：二、凋亡1凋亡的检测方式：网站和其它2PI染色法3Annexin V 法4TUNNEL法三、细胞因子1激活的细胞因子2CBA四、血小板1活化2活化检测3网织血小板五、红细胞1网织红细胞2PNH3胎儿红细胞六、肿瘤学1DNA 细胞周期2蛋白3多药耐药4微小残留白血病第一部份 标本处置一、流式细胞术常规检测时的样品制备 (一)直接免疫荧光标记法 取必然量细胞(约1X106细胞ml)，在每一管中别离加入50l的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反映(如做双标或多标
2、染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。孵育20-60分钟后，用PBS(pH7274)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。本方式操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。尽管直标抗体试剂本钱较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。 (二)间接免疫荧光标记法 取必然量的细胞悬液(约1X106细胞ml)，先加入特异的第一抗体，待反映完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原抗体抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。本方式费用较低，二抗应用普遍，多用于科研标本的检测。但由于二抗一样为多克隆抗体
3、，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易阻碍实验结果。因此标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。二、最小化非特异性结合的方式1荧光标记的抗体的浓度应该适合，若是浓度太高，背景会因为非特异性的彼此作用的增加而增加。2在利用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一路培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。那个步骤通过阻断第一抗体和细胞表面或胞内结构的非特异性的交互作用来降低背景。3在利用第一抗体以后，将样品与5%至10%的来自于同一寄主的正常血清和作为标记的第二抗体一路培育。那个步骤会减少
4、没必要要的第二抗体与第一抗体、细胞表面或胞内结构之间的交互作用。通过用来自于一样的样品的血清稀释标记过的抗体能够略过此步骤。此步骤适用于很多方面，但有时候它也会致使已标记的第二抗体和正常血清中的免疫球蛋白的免疫复合体的形成。这种复合体会优先与一些细胞结构进行结合，或它们最终会致使期望取得的抗体活性的丢失。4利用F(ab)2片段会使背景决定于第一或第二抗体与FC受体的全分子结合。大多数的第二抗体的F(ab)2片段容易利用。而第一抗体的F(ab)2片段一样是不能利用或很难制作。因此，在NaN3存在的条件下，将新鲜组织或细胞与正常血清一路培育应选择优先加入第一抗体。在此情形下，即便在随后的步骤顶用完
5、所有的抗体分子，FC受体决定的背景阻碍已再也不重要。5其它：已标记的抗体和其他一些内在的免疫球蛋白或加入实验系统中的其它物质的交叉反映也可能会有背景阻碍。为了降低背景，在多重标记进程中，所有的已标记的抗体应被吸附，幸免其他种类蛋白的交叉反映。第二部份 细胞因子细胞内细胞因子的流式细胞仪检测一、简介随着研究的进展，仅仅对细胞进行定量和活性的检测已不能知足需要。在单细胞水平研究细胞因子的表达能力对研究细胞因子在疾病中的作用愈来愈显的重要非常。目前检测单个细胞特定细胞因子的表达手腕包括：ELIspot、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析（limiting dilution analysis，LD
6、A）和单细胞PCR，应用原位杂交技术和免疫组化方式观看细胞因子蛋白表达及mRNA表达能够识别Th1和Th2细胞，此方式可取得较强的细胞内信号，但此方式工作量大、主观性强，难以进行大样本检测，且人肉眼识别能力有专门大的局限性，而ELISPOT及单细胞PCR技术，技术性强、劳动强度大，难以进行普遍推行。随着多标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的显现，使对细胞内细胞因子的研究推向了一个新的时期。下面要紧对胞内细胞因子流式细胞技术作以介绍。初期细胞因子表达与细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活。尽管研究应用T淋巴细胞克隆证明了不同细胞因子的合成，如TH1(IL2，IFN )与TH2(IL4，IL
7、5，IL10)，但这些研究很难外推，因为T细胞克隆与体内T细胞功能相关性还未被揭露。近来，Jung与Picker采纳了monensin、PMA等药物预孵，用Brefeldin(BFA)、Monensin阻断了胞内高尔基体介导的转运的方式使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。因为自然状态下，T淋巴细胞产生少量的细胞因子，通常要对T淋巴细胞体外活化进行研究。在体外刺激进程中，T淋巴细胞产生的细胞因子已释放出来，胞内细胞因子信号较弱，难以进行检测。这一方式可检测单个细胞内多个细胞因子，并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群。在细胞水平该方式证明了人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化
8、，且这些分化在特定细胞因子增强时可被逆转。且这些研究清楚地证明，只有激活的细胞亚群能够表达细胞因子，静止的正常淋巴细胞(T、B、NK)不能分泌细胞因子。胞内流式分析法是用抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志组合，即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌，同时采纳特殊的化学与抗体选择，确保静止与无细胞因子分泌细胞的最小荧光背景。具有其它方式难以比拟的优势：快速：流式定量检测细胞内细胞因子可在一天内完成，实验流程需6-8小时，实际操作时刻为1-2小时，快速简便；简便：无需组织培育，能够全血分析，无需分离PBMCs；灵敏度高：高度灵敏的荧光标记与检测系统；高效：能够在同一个细胞内同时检测两种或更多种
9、细胞因子，也可依照细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞的亚型，进行多参数相关分析；平安：减少样本处置与生物源性污染接近生物体的分析条件：全血检测保留细胞及生化微环境更准确反映了体内状况。二、所需仪器1.流式上样管及细胞培育皿或板2.25%CO2，37孵箱3.混匀振荡器4.离心机5.加样器、Tips6.流式细胞仪三、经常使用的标本类型和处置方式全血：利用肝素钠抗凝的真空采血管采血，不易采纳肝素锂、EDTA和ACD抗凝剂，血样在8小时内分析，超过8小时会致使活性的损失，一样细胞因子阳性细胞会减少5%。如不能在8小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。 自身血浆中外周血单个核细胞(PBMCs)：利用
10、肝素钠抗凝的采血后，分离PBMCs，24小时内分析。 组织培育基中的外周血单个核细胞(PBMCs)：用Ficoll分离PBMCs，将细胞重悬于含10%热灭活胎牛血清(FBS)的RPMI1640培育基中，调剂细胞浓度为2106细胞/ml。 细胞系与T细胞克隆：调剂细胞浓度2106细胞/mL于新鲜培育基中。 冰冻全血与PBMCs：利用1红细胞裂解液处置活化的外周血或PBMCs，用PBS漂洗，并用含1%的BSA及10%的DMSO的PBS重悬，70冻存。溶化后细胞置于染色管中，加上23mL的洗液，离心5分钟后，用破膜剂对细胞进行破膜和染色。 四、所需试剂一、细胞表面染色的荧光标记的单抗试剂依据实验需要
11、选择特殊表面标志CD45圈定所有淋巴细胞CD3 圈定T淋巴细胞CD4 圈定T辅助淋巴细胞亚群CD8 圈定T抑制淋巴细胞亚群CD19/或CD20圈定B淋巴细胞CD56圈定NK淋巴细胞CD14圈定单核细胞二、荧光标记的细胞因子抗体：R&D提供FITC、PE和APC标记的细胞因子抗体3、溶血素：用外全面血检测时需利用溶血素（R&D目录号WL1000用于人或WL2000用于小鼠；eBioscience目录号00-4333）溶解红细胞4、激活剂1Phorbol 12-Myristate 13 Acetate(PMA)（Alexis，目录号ALX-445-004-M001）A.B.分装(20 L)，20贮
12、存。勿反复冻融C.每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1：100稀释贮存液D.PMA终浓度25ng/mL细胞悬液 2Ionomycin （Alexis,目录号ALX-450-006-M001）A.B.20贮存C.每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1：10稀释贮存液D.Ionomycin终浓度1 g/mL细胞悬液3Staphylococcal enterotoxin B(SEB) (Sigma,Catalog No.S-4881)A.B.4贮存C.SEB终浓度10 g/mL细胞悬液4CD3：包被在培育板中，在蛋白转运抑制剂存在下活化未稀释的血液细胞5CD28：加速不同刺激剂（包括SEB、CD3等）的活化效
13、应，浓度一样为10ug/ml五、阻断剂阻断高尔基体介导的转运作用，使得刺激细胞表达的细胞因子聚集在胞浆内 Brefeldin-A(BFA) （eBioscience，目录号00-4506）A. 于DMSO中调剂浓度5mg/mLB. 分装(20 L)，-20贮存。勿反复冻融。C. 每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1：10稀释贮存液D. 激活最后45小时BFA终浓度10 g/mL细胞悬液。注意：BFA过度孵育会致使细胞活力下降 Monensin （eBioscience，目录号00-4505）六、 不含谷氨酰胺的RPMI-16407、 固定剂：细胞在体外刺激后需要对细胞进行固定。固定的目的在于通过蛋
14、白的交联和变性一方面使细胞因子固定在细胞内，另一方面幸免细胞表面抗原丢失。含4%的多聚甲醛PBS溶液（eBioscience，目录号00-8222）八、 破膜剂：含1皂甙、0.05叠氮化钠的Hanks溶液（HBBS）（eBioscience，目录号00-8333）将细胞膜穿孔，已利于荧光标记的细胞因子抗体进入细胞内，于相应的细胞因子结合九、其它试剂：无菌无叠氮钠PBS，乙醇，含1%多聚甲醛的PBS，4贮存。五、细胞培育和刺激的大体方式细胞活化的最终结果是产生细胞因子，依照检测指标和标本的不同，研究人员需要选择不同的刺激剂和刺激时刻，以取得最正确的实验结果。下表提供了检测一些经常使用细胞因子的推
15、荐的活化方式。表一、细胞内细胞因子流式检测推荐的阳性对照活化方式检测细胞因子阳性对照刺激方法人IFN-方法2 (4-24 小时)人TIMP-1方法5人TNF- 方法7 (6 小时)人IL-1方法3 (6 小时)人IL-1 方法3 (24 小时)人IL-2方法2 (4-24 小时)人IL-4方法4人IL-5方法1人IL-6单核细胞：方法3 (6-12 小时) T细胞：方法6人IL-10方法1人IL-12方法8人IL-15方法3人Fractalkine/CX3CL1方法1人IL-8/CXCL8方法3 (24 小时)人MCP-1/CCL2方法3 (24 小时)人MIP-1/CCL3方法3 (24 小
16、时)人MIP-1/CCL4方法3 (24 小时)人RANTES/CCL5方法1小鼠IL-2方法9小鼠IL-4方法10小鼠IL-5方法10小鼠IL-6方法11小鼠IFN 方法9 or 方法12小鼠TNF- 方法9为避免细胞内细胞因子分泌到胞外，在培育的最后4-6个小时，需要利用蛋白转运抑制剂 (如3uM monensin，10mg/ml的BFA)方式1: 只利用转染细胞检测方式2: 人的PBMCs利用PMA (10 ng/ml) 和Ionomycin (1 uM) 刺激4-24 小时.方式3: 人的PBMC 利用LPS (0.5 - 1 ug/ml) 刺激24 小时.方式4: 人的PBMCs或纯
17、化的CD4细胞在包被人CD3抗体的培育板中，利用含有重组人的IL-2（10 ng/ml，目录号202-IL-010）和IL-4（10 ng/ml，目录号204-IL-005）的培育基培育两天；细胞洗涤后在含有重组人IL-2和IL-4的培育基中继续培育2天；最后收成细胞，利用PMA (10 ng/ml) 和Ionomycin (1 uM)刺激6小时方式5: CD4+ T 细胞利用PHA (10 ng/ml) 刺激4 days方式6: T 细胞利用抗CD3 的单抗、抗CD28的单抗和重组人的IL-1 (Lorre, et al., 1994, Clin Immuno Immunopath 70:1
18、)方式7: 利用PMA (50 ng/ml) 和Ionomycin (500 ng/ml)刺激方式8: PBMCs细胞利用重组人IFN (10 ng/ml，目录号285-IF-100) 刺激2 小时，然后利用IFN (10 ng/ml) + LPS (1 ug/ml) 刺激22小时或利用相同的方式刺激THP-1 细胞.方式9: EL4 在包被抗小鼠CD3抗体(25 ug/ml) 的培育板中，利用抗CD28 抗体(2 ug/ml) + PMA (5 ng/ml) + Ionomycin (500 ng/ml) 刺激6小时方式10: CD4T细胞在包被小鼠CD3(25 ug/ ml)抗体的培育板中
19、，利用含有抗小鼠的CD28(2 ug/ml)的抗体，重组小鼠的IL-2（10 ng/ml，目录号402-ML-020）和IL-4（50 ng/ml，目录号404-ML-005）的培育基培育两天；然后在含有重组小鼠IL-2和IL-4的培育基中继续培育3天；最后收成细胞，利用PMA(5 ng/ml)、Ionomycin(500 ng/ml)和monensin刺激6小时。方式11: 小鼠ip巨噬细胞利用Mouse ip 1 ug/ml LPS 刺激24小时方式12: 小鼠脾细胞利用PMA (5 ng/ml)和Ionomycin (500 ng/ml)刺激6小时六、流式检测细胞染色大体进程（以全血为例
20、）1、收成细胞：肝素钠抗凝的静脉血，按1：1与培育基混匀，加刺激剂，同时加蛋白转运抑制剂（参照说明书）， 混匀后，37，5%二氧化碳培育4-6小时2、阻断Fc受体：用于排除非特异性的结合染色1在小鼠，可利用纯化的FcII/III受体的抗体（CD16/32），依照1ug/106细胞的用量，在染色缓冲液中4孵育15分钟，PBS清洗后，直接进行下一步染色。2关于人和大鼠，可直接利用过量的与荧光抗体相同来源和亚型不相关的纯化Ig或血清进行阻断3、细胞表面染色1加适当的细胞表面染色试剂20 L于Falcon管中，加入100 L激活后的全血 (细胞浓度维持在2106/mL) 混匀，室温暗处孵育15分钟；2
21、加入溶血素，室温暗处孵育10分钟。（注意：PMA激活的全血可能会溶血不完全。）3离心500g 5分钟，弃上清4、固定和破膜1加固定剂，室温暗处孵育15分钟，离心500g 5分钟，弃上清；2加破膜剂温暗处孵育10分钟。（剂量参照说明书）3加2 3mLPBS洗液，离心500g 5分钟，弃上清。五、细胞内染色1加入荧光标记的细胞因子抗体，混匀，室温暗处孵育30分钟。2加2 3mL洗液，离心500g 5分钟，弃上清，加入500 LPBS上机或加入500 L 1% PFA固定后再上机七、注意事项1.标本处置：幸免利用络合钙的抗凝剂，如ACD与EDTA，因为它们会限制钙依托性激活进程，推荐用肝素钠。另外L
22、PS，一种常见的生物试剂污染物，是强细胞激活剂，可能会混淆实验结果。血样在8小时内分析，超过8小时会致使活性的损失，一样细胞因子阳性细胞会减少5%。如不能在8小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。2.刺激激活：检测不同的细胞因子依照情形选择不同的刺激剂组合和刺激时刻，以保证最正确的检测成效。比如，要检测IFN-那么可选择PMA和Ionomycin同时刺激；若是用CD4做表面标记，由于多数病人的CD4抗原会因PMA的激活而有不同程度的下调，因此培育时刻不能太长，4-6小时为宜，不然CD4下调阻碍分析3.选择适合的对照：为保证结合的真是和靠得住性，至少荧光设置以下对照：1未刺激对照：激活时由于
23、BFA的存在抑制了胞内蛋白的转运，因此在激活进程中产生 的抗原与细胞因子会滞留胞内，未刺激对照也应包括BFA。2激活对照：激活对照利用细胞表面表达CD69来评判激活与否，若是未达到CD69期望的水平，那么激活步骤出了问题，某一试剂可能失活，过时，制备不妥或溶剂污染，需制备新鲜刺激剂从头实验。3同型对照：利用与荧光标记抗体相同来源、相同标记、相同剂量和亚型的免疫球蛋白，用于排除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。4.Fc受体阻断：利用试剂阻断Fc受体能够有效减少非特异荧光染色，在小鼠能够用纯化的抗小鼠的CD16/32（eBioscience, 目录号14-0161-81），在大鼠能够
24、用纯化的抗大鼠的CD32，在人能够用过量的同种无关纯化Ig或血清。5.荧光素的选择：检测相对低表达细胞因子如IL-4时，应选用PE或APC标记；单检测某一细胞因子时最好也选用PE或APC标记；同时检测多种细胞因子时，弱表达的应选用PE或APC，FITC标记最好用于高表达细胞因子如IFN-八、问题与解答问题 原因 解决 注释 无CD69胞内染色 细胞未激活 激活剂制备不当，见激活剂制备储存一节。 PMA+Ionomycin激活4小时后CD3+T淋巴细胞CD69阳性率应90% 使用了错误的抗凝剂 应使用肝素钠，不要使用肝素锂，避免使用ACD与EDTA等络合钙的抗凝剂。 淋巴细胞激活需要Ca，络合C
25、a的抗凝剂会影响激活。 细胞未通透 在使用通透液前先使用溶血素 溶血素辅助细胞通透 BFA失活或制备不当 详见BFA制备BFA于-20储存 详见BFA制备 胞内染色阳性但很弱 抗细胞因子抗体浓度不对 按R&D推荐量使用荧光抗体 正常的激活T淋巴细胞IL-4表达通常2%，应使用PE或APC标记 通透后细胞在胞内染色前未洗 按操作程序通透后洗细胞再胞内染色 背景染色太高 荧光单抗不纯或荧光与抗体结合不牢导致解析出的荧光染料非特异结合 使用R&D 试剂使用试剂阻断Fc受体可以有效减少非特异荧光染色，详见Fc段受体阻断节抗体与固定后的胞内抗原亲和力低，需提高抗体浓度。 使用R&D试剂并按推荐剂量 错误
26、的同型对照，对照Ig浓度过高 按R&D推荐量使用R&D匹配的同型对照试剂 严重的细胞损失 洗涤离心步骤丢失细胞 固定通透的细胞离心500g 固定后细胞密度低于活细胞，需用高转速离心。 加样步骤丢失细胞 弃上清带走细胞 小心吸样溶血不完全 PMA+Ionomycin激活 按操作步骤用FL3做阈值去除碎片和未溶细胞 PMA可稳定红细胞膜，PMA+I激活全血较难溶 溶血未在室温进行 在室温进行溶血 Th1/Th2细胞研究方式尽管目前提出了较多的 Th1/Th2细胞表面标志，但依照淋巴细胞因子谱的异同识别Th1和Th2细胞仍然是目前最有效的手腕，专门是细胞内因子标记的流式细胞技术。近来由于细胞因子EL
27、ISA试剂盒的不断涌现，为研究Th1/Th2细胞因子谱的转变提供了准确、靠得住、快速的测定方式。但研究CD4+淋巴细胞细胞因子谱转变时需要将T淋巴细胞特异克隆。最近发觉，在外周血白细胞中，除CD4淋巴细胞外，CD8细胞也存在Th1和Th2样细胞因子谱的转变，乃至酸性粒细胞也具有产生多种细胞因子的能力，如酸性粒细胞可分泌IL-4、IL-五、IL-1、IL-六、IL-八、TNF、TGF等。因此单纯通过细胞因子谱的转变难以有效识别Th1和Th2细胞。依照T辅助淋巴细胞(CD4)分泌的细胞因子谱(cytokine profiles)的不同,将CD4细胞分为Th1和Th2亚群。Th1细胞要紧分泌-干扰素
28、(IFN-)、白细胞介素-2(IL-2)和肿瘤坏死因子-(TNF-),介导细胞免疫应答；而Th2细胞要紧分泌IL-4、IL-五、IL-10及IL-13等因子，增进抗体的产生，介导体液免疫反映。在多数免疫反映中，T辅助淋巴细胞并非产生典型的Th1或Th2细胞和相应的细胞因子，而主若是由Th0细胞分泌的混合型的细胞因子。但在疾病的状态下，Th0细胞受特异抗原的刺激时，一方面向Th1方向进展，另一方面可能向Th2方向进展。如在结核感染转状态下可产生Th1和Th2双向免疫反映，在I型超敏反映疾病时要紧产生以Th2为主的免疫反映。近几年来研究发觉，Th1/Th2平稳失调参与多种疾病进程，如肿瘤免疫、移植
29、免疫及变态反映等，而用流式细胞仪进行Th1/Th2的检测克服了传统方式所得结果为整个群体分泌数值不能区分单个细胞或亚群的反映的不足，通过表面染色多参数分析能够区分表达特定细胞因子的细胞亚群。一样用CD3+/CD4+ 或CD3+/CD8-作表面标记，选择相应的荧光标的抗体，Th1和Th2细胞分泌细胞因子的情形如下：全血标本通过刺激培育、表面标记、固定、破膜、胞内染色（IQ，Cytodetectkit(basic)，CAT方式，IQP-367）后结果如下：正常全血标本用流式细胞仪检测细胞因子的参考值一批健康志愿者的全血用PMA+Ionomycin刺激5小时后，依照操作程序测得参考值如下：细胞因子阳
30、性细胞（均数%）阳性细胞（范围 %）IL-2IL-4IFN-TNF-第四部份流式细胞术分析血小板流式细胞术分析血小板血栓性疾病、出血性疾病、心血管疾病和自身免疫性血小板减少症等疾病的病理生理进程与血小板相关。血小板功能检测包括黏附、聚集和活化功能实验。利用流式细胞仪检测全血中血小板表面相关标志物是一种新技术，它拓宽了血小板相关疾病的诊断与功能研究方式，丰硕了血小板功能评估指标。一、流式细胞仪血小板分析应用范围 1.通过度析信号传递、细胞骨架结构、颗粒释放、糖蛋白构形、膜磷脂、与抗凝因子的结合和微粒形成，分析血小板活化，血小板对刺激物的反映性。2.通过度析受激后表面结合蛋白触发凝血链式反映和表面
31、糖蛋白缺点检测，分析血小板止血功能的取得性和遗传性缺点。3.结合血小板大小，检测血小板RNA含量，分析血小板成熟度，计数网织血小板。4.发觉血小板抗体，做定性和定量分析。二、血小板分析的临床意义 1.血栓性疾病：活化血小板的检测能预测冠状血管成形术后发生急性缺血事件的危险性，非风湿性心房纤颤患者栓塞和栓塞前期均有血小板活化，胰岛素依托性糖尿病，子痫前期，外周血管疾病等都可测出血小板活力增加和(或)循环中存在活化血小板，而早产儿的血小板对凝血酶、二磷酸腺苷(ADP)、TXA2的体外激活能力降低。2.血小板缺点性疾病：全血法流式细胞术提供了一个简单、迅速的方式来诊断血小板膜糖蛋白缺点性疾病，如庞大血小板综合征，血小板无力症等。前者是由于GPIb-IX复合物先天缺点所致
