1、HLA配型HLA分型及抗体检测的临床应用第一节 HLA简介一、主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex， MHC）1956年Snell等将控制同种组织或肿瘤移植中急性排斥反应的基因称为主要组织相容性基因，其编码基因的产物包括MHC-I类和MHC-II类抗原。在生命的进化过程中，机体内各个细胞必须共存与合作,同时又要防止被同一物种的其它个体吞并。MHC的限制作用可看作为同一个体细胞之间自我识别的暗号。没有自我识别，每个细胞和每种组织会被隔离而无法维系生命。 在诱发免疫应答过程中，无论是T细胞和B细胞、T细胞和巨噬细胞、还是T细胞之间的相互作用，或是T
2、细胞对靶细胞的攻击,都涉及细胞间的识别。即T细胞对细胞表面抗原的反应时，不仅是对抗原识别，而且也必须识别细胞上的MHC分子.否则，反应就不会产生，这便是MHC的限制作用。其本质是：T细胞识别抗原要有两种识别，一种是TcR与MHC沟槽中的特异性多肽结合,而此多肽的基序只能与某一型号MHC分子结合，不是与所有MHC分子结合；另一种是TcR识别抗原槽两侧的同种异型部位的螺旋结构。由此限制了TcR只能识别自身MHC分子递呈的抗原。 同种异体组织移植时，若供受体移植抗原不同,尤其是主要组织相容性抗原不匹配,将会诱发受体产生明显的移植排斥反应。虽然MHC类和类分子均是主要移植抗原，但这两类抗原在移植中所起
3、的作用是不相同的。体外实验表明，供受体类分子不同时,供体类抗原能直接刺激受体CD4+T细胞增殖和淋巴因子分泌，即MLR。这一反应是免疫应答的中心,因为B细胞抗体的生成及CD8+T细胞发育和分化，都有赖于CD4+T细胞的活化以及淋巴因子的分泌。而类分子不同以及次要组织相容性抗原不同，就会诱发CD8+T细胞增殖和分化成熟，导致移植物的破坏。总之,MHC 类抗原错配启动了免疫应答，而类抗原错配是导致免疫效应阶段被攻击的靶子。因此，临床上器官和骨髓移植时,要首先选择与受体HLA类匹配的供体，其次选择类抗原相配的供体，类抗原的匹配比类抗原的匹配更为重要. 表1 MHC的一些性质 性质 类抗原 类抗原 同
4、种移植物排斥作用的大小 诱发产生体液抗体 MLR的刺激作用 GVHD CML的靶细胞 Ir基因功能 靶细胞溶解的限制作用 抗原递呈的限制作用 组织中的分布 所有体细胞 B细胞、巨噬细胞等 小鼠H2基因 K,D,L Ir 人类HLA基因 A，B，C DR，DP，DQ 化学结构 重链45kDL(MHC）编码 链35kDL(MHC）编码 轻链12kDL（非MHC）编码 链28kDL(MHC)编码 物种间的交叉反应 常见 少见注：MLR为混合淋巴细胞反应;GVHD为移植物抗宿主反应；CML为细胞介导的淋巴细胞溶解;Ir为免疫反应。二、人类白细胞抗原( human leukocyte antigen，H
5、LA）HLA是由 Dausset在1958年首先发现。HLA抗原是人类主要组织相容性复合物抗原。它们与同种异体移植中的排斥反应有密切关系.HLA是由 HLA基因复合体所编码的产物，HLA复合体是人类中最复杂的基因复合体，其遗传主要特点是共显性复等位基因遗传，是调节人体免疫反应和异体移植排斥作用的一组基因,位于第六号染色体的短臂上。每个座位上的 HLA基因均可编码一种特异性抗原,主要表达在细胞膜上，或以游离状态存在于血液和体液中.HLA抗原可根据不同基因位点的产物和它们的功能加以分类。目前研究较充分的有HLAA,B，C,D,DR，DQ和DP七个位点。每个位点上均有很多等位基因,为共显性复等位基因
6、。目前已确定 HLA复合体共有1028种等位基因。其中，HLAA、B、C座位上的基因编码的抗原成分称为 I类抗原. I类抗原是一种膜糖蛋白,存在于所有有核细胞的膜上，以淋巴细胞上的密度最大。 II类抗原是由 HLA-D、DR、DQ、DP座位基因所编码的抗原。它是由两条糖基化的跨膜多肽链构成，分别称为链和链,其抗原特异性主要与链有关；主要表达在 B细胞、巨噬细胞和其他抗原递呈细胞上。第一类抗原： HLAA，HLA-B，HLAC 第二类抗原: HLA-D，HLADR，HLA-DQ，HLADP第三类抗原: C4A，C4B，C2,Bf等补体成分通过遗传，人每套染色体有两条，一条来自父亲,一条来自母亲。
7、每个位点含有两个等位基因，一个来自父亲，一个来自母亲。两个等位基因是相互独立的，既一个基因不能抑制另一个基因的表达。某一个体，如果一个位点的两个基因是不同的，称为杂合子基因;如同一位点具有同样的等位基因，称为纯合子基因.HLA位点具有众多的等位基因，造成HLA的极端多态性。第二节HLA分型的临床应用 HLA分型技术常应用于器官移植和骨髓移植时供者和受者组织相容性的配型，以及HLA与某些疾病关联性、成分输血时HLA抗体所致的输血副作用等的研究; HLA分型技术也成为亲子鉴定和犯罪法医学鉴定,以及遗传学方面研究人类进化的重要手段。一、HLA与疾病相关 1、研究HLA与疾病相关的意义(1） 疾病的诊
8、断或辅助诊断(2) 研究疾病的遗传因素(3) 疾病分型(4) 有助于对疾病的预测、预防及预后的判断2、HLA特异性与许多临床疾病相关.据不完全统计，迄今已研究了500余种疾病与HLA相关联，已经肯定有50多种疾病与HLA有密切相关。如：具有HLAA1，B8单倍型者，感染HIV病毒后可迅速发展为爱滋病。此外,HLA-DR2与嗜眠症，HLA-B8，DR3与重症肌无力，HLADR2，DR7与多发性硬化症，HLA-B8与疱疹皮肤病,HLADR3，DR9与胰岛素依赖性糖尿病等，均得到证实。(1)HLA与自身免疫病：I型糖尿病(IDDM）、多发性硬化症(MS）、系统性红斑狼疮(SLE）、类风湿性关节炎(R
9、A）、重症肌无力(MG）等。 自身抗原及其优势表位、表位特异性T细胞的分离及其功能特征、多肽表位对等位基因的结合亲和力、等位基因对多肽的相对递呈水平、TCR对肽HLA复合物的亲和力大小. HLA与疾病易感性的机制学说：分子模拟学说；受体学说；自身抗原提呈学说；连锁不平衡学说；免疫耐受学说。 2、HLA与病毒感染：一些由病毒编码的免疫调节因子可通过直接或间接干扰HLA分子给T细胞递呈抗原肽而使病毒逃避机体的免疫反应。3、HLA的保护作用：对疾病特异性T细胞的克隆去除或无能化；依赖于抗体分子对疾病特异性抗原表位的俘获；HLA II类分子介导的对有保护作用的一些T细胞的正选择。 HLAB27与强直性
10、脊柱炎（AS) HLA-B27抗原为一类抗原,存在于所有的有核细胞和血小板 ,能刺激产生同种抗体并控制细胞毒T效应细胞的特异性。 1973年Terasaki等率先报道了HLA-B27抗原与强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS）的关联。在AS患者中，8096%的患者具有HLA-B27抗原，而正常对照组人群中具有B27抗原者仅为4%8%。随后,许多国家的研究者证实了HLA-B27与AS的强关联关系。从此，引发了世界范围内对HLA抗原与相关疾病的广泛研究。 9095的强直性脊柱炎（AS）患者具有B27抗原. 6080的反应性关节炎(ReA)患者具有B27抗原. HLAB2
11、7基因频率与种族有关，中国人为3。4。 流行病学调查示,中国人群AS的发病率为0.26%。 具有B27 抗原者其患AS的概率为7.6，而非B27抗原者患AS的概率为万分之1。3。 传统上AS诊断主要靠晚期X光片，大部分患者脊柱已发生变形。 过去的20年中，大量不典型AS和ReA通过B27检测而证实。 利用B27与AS和ReA的强关联,可早期诊断,降低致残率。 HLAB27检测对儿童不同性质关节炎的鉴别诊断十分重要。 HLA-B27检测可使临床医生和患者警惕AS和ReA的并发症。 AS和ReA发病机理的研究，为临床提供了早期治疗的机会。 二、HLA与人类学的研究 人类历史上的迁移造成HLA抗原分
12、布在不同种族或同一种族不同人群中明显不同，而不同人群中HLA抗原频率的分布又为人类学的研究提供了条件，既HLA抗原频率的分布可反映人群的迁移史。如南美印第安人无HLA-B27抗原，而北美印第安人和北美爱斯基摩人却有很高的HLAB27抗原频率.由此推断,北美印第安人是由亚洲不同地区人群经过多代移居北美所组成。又如：欧洲白种人也不是同源人群。北欧人HLA-DR5的频率为5,而南欧人HLADR5却为15。不同人群HLA抗原频率有明显差异，如东方人HLAA位点，A24占50%以上,而黑人A24的抗原频率不到10%。东方人B46、B54频率很高,而白种人与黑人几乎没有,故又称东方抗原。三、HLA与亲子鉴
13、定 HLA系统具有高度多态性，在无关个体间HLA表现型全相同的概率极低,故HLA复合体被看作是伴随个体终生的特异性遗传标记。如果只考虑HLA-A位点上23个抗原，HLAB位点上53个抗原和HLA-DR位点上18个抗原，按相关公式计算（24+（24-1）（24-2）/254+(54-1)（542）/219+(19-1）（19-2）/2)，将有三千万种表现型。因此，在亲子鉴定和法医学中的作用远远大于血型基因鉴定。四、HLA抗体与输血溶血性输血反应主要由红细胞抗原不合引起，在一些溶血性反应,如发热、寻麻疹中，部分由红细胞抗体引起。慢性血小板减少症患者，输入随机供体的血小板往往会发生“无反应现象.如果
14、使此种病人接受HLA相容性的血小板，就会延缓和阻止“无反应”的发生.五、HLA与器官移植 许多器官功能衰竭的患者，器官移植是唯一的解救途径。HLA抗原与同种异体器官移植的排斥反应密切相关，故又被称为移植抗原.HLA组织配型在60年代开始临床应用后，器官移植的存活率和器官移植的数目均明显增高.但仍不能满足临床的需要.许多患者因得不到器官而死亡。 HLA与器官移植的关系，可以说是一个互相认识、互相促进和互相发展的过本世纪初，由于血管吻合技术的进步，开启了外科医生对器官移植的兴趣。从1905年法国医生Carrel突破血管吻合技术瓶颈，展开了各种器官移植的实验研究；从50年代初期的人体器官移植失败经验
15、，正式提出了移植失败的原因是免疫反应所致。1954年美国哈佛大学Merril为首的移植小组首次成功地完成同卵双生子之间的肾脏移植，证实了组织相容性的重要性.同时,也极大地促进和推动了HLA的基础研究和组织配型技术的发展。从60年代到80年代初期的20多年里,HLA与器官移植的关系受到广泛重视。随着对HLA研究的不断深入，发现它是目前所知的最高度多态性遗传系统，在无关个体中寻找完全相同的HLA供者的比例很低。80年代初期强力免疫抑制剂环孢素A（CsA)的问世与临床应用,极大地改善了器官移植的短期存活。如肾移植的1年存活率提高了20%以上。这些均使HLA配型的临床价值受到质疑。在90年代初期逐渐形
16、成了在无关供体实质性器官移植中进行HLA配型支持和反对截然相反的两种观点。 近1-2年来，随着大量器官移植临床随访资料的逐渐积累分析，HLA配型在活体亲属移植中的重要意义为大家所公认.但在非亲属移植、尸体移植中HLA配型的临床价值存在不少争议。于是有关HLA配型在器官移植中的临床意义的争论已逐渐统一认识：1HLA配型在器官移植中是必要的 HLA的相容性程度仍然是CsA时代影响移植物长期存活的主要因素之一。同时，其他因素的影响也是不容忽视的。2肾移植 类抗原主要影响长期存活，尤以HLAB抗原重要。类抗原对长期存活和短期存活均有影响，但以13年存活率的影响最明显。总体上分析，尸肾移植中HLA-DR
17、抗原最为重要。3骨髓移植 HLA分型的精细程度要求更高。除HLAA、B、DR抗原外,HLA-C抗原、HLA-DP抗原的影响也是不容忽视的。4其他实质性器官移植 包括心脏移植、肝脏移植、胰腺移植等，现已逐渐考虑和重视HLA相配的临床价值.但首先考虑的是ABO血型的相容性.六、HLA相容对肾脏移植的影响 由于影响肾移植的因素很多,小样本数据分析容易出现混杂便异（Bias）。为此，美国器官联网组织（UNOS）委托洛杉矶加州大学（UCLA)组织配型中心，每年将美国数百个移植中心的数据，进行大样本数据的分层处理，分析影响肾移植的因素。 综合目前的临床研究结果,HLA相容性程度无论对首次移植还是再次移植、
18、活体移植还是尸体移植、成人移植还是儿童移植，均具有不同程度的影响。这些影响是多方面的，主要包括对早期肾功能的影响、对排斥反应和激素冲击治疗的影响、对移植物存活率的影响、对致敏受者和高危组受者的影响等。（一) HLA相容对早期肾功能的影响研究结果证实,移植肾缺血灌注损伤可以引起HLA抗原表达的增强，从而增加移植器官的免疫反应。同时,HLA的错配也可诱发受者体内抗移植物的免疫反应,导致移植物早期功能的损害。HLA错配对肾脏移植早期功能的影响主要包括移植物功能延迟恢复（DGF)，术后第1天无尿和术后需要继续透析治疗等三方面。 (二) HLA相容对排斥反应和激素冲击治疗的影响 移植物排斥反应的本质是一
19、种免疫反应，其根本原因是移植物中含有受者体内所缺如的移植抗原。从移植免疫学角度选择理想供体和合理应用强有力的免疫抑制剂是目前控制排斥反应的主要措施。良好的HLA相容对于减少移植物排斥反应和激素冲击次数,从而减少慢性排斥反应，提高移植物存活率.（三） HLA相容对移植物存活率的影响 移植物有功能的长期存活是器官移植科学研究与临床工作的最终目标，也是衡量器官移植整体水平的最佳标准.目前，提高移植物长期存活的研究主要集中在三个方面： 第一，免疫耐受的研究.尚缺乏在成熟的高等级动物上诱导成功免疫耐受的可靠实验模型.要过渡到人类器官移植临床的应用还有一段漫长的距离。 第二,免疫抑制剂的研制、开发和合理应
20、用.如何合理的联合应用这些新的免疫抑制剂，根据个体特性调整以达到最佳个体化用药，是影响移植物存活的重要因素之一。 第三，移植供受者HLA相容性选择。近10万例尸肾移植的临床回顾性分析显示，CsA时代的尸肾移植，HLA相容性仍然是影响移植物长期存活的最主要因素之一.HLA-A、B、DR六抗原无错配受者,半寿期高达15。5年，而错配者仅有68年；两者比较,1年肾存活提高12、3年肾存活提高19%、10年肾存活提高33.因此，就目前器官移植的现状而言，提高移植物长期存活真正具有实际临床价值的措施主要是免疫抑制剂的合理应用和选择HLA相容的供体.(四) 再次移植和高危组病人HLA相容对移植物存活的影响
21、更为重要由于种族间遗传学的差异， 黑人受者选择合适的HLA供体较为困难，错配率显著高于白人受者,因此， 临床上将黑人受者和接受高危供肾的病人统称高危病人， 和再次移植的病人一样, 是临床上并发症较多， 存活率较低的患者。如何提高这部分移植病人的GS， 除采取综合性措施外， 寻找理想的HLA相容的供体无疑是至关重要的.第三节 HLA的分型技术 HLA研究的发展和广泛应用，得益于国际间的协作,通过国际间的协作建立了HLA分型的标准化,使方法学得到统一。HLA分型方法包括血清学分型、细胞学分型和基因分型.血清学和细胞学分型技术主要侧重于分析HLA抗原的特异性，基因分型方法则侧重于分析基因本身的多态性
22、。细胞学分型技术由于分型标准细胞来源困难，且方法繁琐，不适于常规检测使用，正渐被淘汰。 六十年代初期，HLA的血清学研究拉开序幕.在Snell和Dansset等创建免疫遗传学组织相容性抗原系统,解决了识别HLA抗原的抗血清来源的基础上，1963年Rood 和Lecuwen采用计算机方法分析抗血清中复杂的抗体成份，提出了等位基因的概念.1964年Terasaki发明了HLA微量淋巴细胞毒实验方法(Microlymphocytotoxicity test）及相应的组织配型板，并于1970年被美国国立卫生研究院（NIH）确定为国际通用标准技术.HLA的血清学研究得到了迅速发展。同时，通过交流标准细胞
23、株和交换标准抗血清，使之进入国际大协作阶段。血清学方法成为免疫遗传学和组织相容性研究的基本方法与手段。 进入八十年代后期，分子生物学技术的迅速发展与成熟,尤其是1985年美国Cetus公司发明了具有划时代意义的体外基因扩增技术聚合酶链反应技术（Polymerase Chain Reaction， PCR），为分子生物学技术应用于HLA研究领域提供了有效的方法和捷径。至80年代末、90年代初期,HLA的研究进入了DNA分型研究阶段。1990年世界卫生组织（WHO）统一了HLA基因分型的命名以及与血清学分型的对应关系，并公布HLA核苷酸序列，为规范HLA分子生物学研究提供了科学的依据.1991年第
24、11届国际组织相容性专题研讨会，对HLA血清学研究进行了总结.至此，经过近30年的国际合作研究，HLA血清学研究大体告一段落，全面转入DNA分型研究。一、 HLA血清学分型方法（一)淋巴细胞分离淋巴细胞分离的方法很多，主要有直接沉淀法、密度梯度分离法、细胞分离器法和免疫磁珠法等.现国内大多数实验室多采用密度梯度法，而有条件的实验室已采用免疫磁珠法分离淋巴细胞。免疫磁珠法分离T、B淋巴细胞原理 FluoroBeads是一种可荧光染色的免疫磁珠，由特异性的单克隆抗体和可磁化的金属颗粒结合而成。磁珠磁化后，受磁力的吸引可被分离。当磁力移开后，磁珠不会带有磁力但可被反复磁化。已和磁珠结合的特异性单克隆
25、抗体和相应的淋巴细胞结合，既可分离淋巴细胞。（二）微量淋巴细胞毒实验这是一种补体依赖性淋巴细胞毒实验。该方法目前仅用一微升抗体、一微升细胞、一微升补体，孵育一小时.即抗原+抗体+补体结合。故称快速微量淋巴细胞毒实验方法。 原理 淋巴细胞具有HLA抗原，在补体存在的情况下，HLA细胞毒抗体(IgG，IgM)能够结合到带有相应抗原的活淋巴细胞膜上，并在膜上打洞致淋巴细胞死亡。如淋巴细胞不带有相应的抗原，则无此作用.死细胞可用数种方法观察到,最简单的方法是染色法。染色液可通过死细胞膜进入细胞内，以便细胞着色。目前常用的染料为荧光液和曙红(CFDA和EB)。在荧光显微镜下，活细胞呈绿色（CFDA与细胞
26、膜结合)，死细胞呈红色（EB可通过被破坏的细胞膜进入细胞与DNA结合)；在相差显微镜下,活细胞因不被着色而明亮，死细胞由于曙红进入细胞而色暗无光。估计死细胞占全部细胞的百分比，可以反映出抗原与抗体反应的强度。目前，国际通用的判断方法为NIH计分法。 在T和B淋巴细胞上都存在HLAA,B，C抗原，因此检测这些抗原一般可直接用淋巴细胞。但是某些HLAA，B,C分型血清中同时存在DR抗体,所以，为了避免DR抗体可能造成的干扰，通常用T淋巴细胞做ABC分型。近几年，HLA单克隆抗体的出现，可避免DR抗体的影响,而可用总淋巴细胞检测HLA-A，B,C分型。HLA-DR，DQ抗原存在于B淋巴细胞上。所以，
27、测定HLA-DR，DQ抗原时，需从总淋巴细胞中分离出B淋巴细胞进行测定.（三）HLA抗原血清学分型现状 血清学分型技术创立30多年，在研究HLA的多态性及其功能意义，器官移植组织配型，尤其是筛选异基因骨髓移植无关供体,建立“骨髓库等方面发挥了主要作用。同时,血清学分型技术本身也得到了迅速发展： 1分型技术微量化 一微升抗体，一微升细胞，一微升补体，成为国际通用的标准技术.2交流标准细胞株和交换标准抗血清的国际大协作，基本上满足了不同地区、不同种族的人群HLA分型的要求。HLA领域的国际大协作是迄今为止各类技术合作中最有效、最成功的典范。 3分型技术与方法得到了进一步完善。如：1) 1994年美
28、国加州大学组织配型中心建立了单克隆抗体技术用于标准抗血清的筛选，大大提高了标准抗体的特异性，简化了抗血清筛选的程序.同时，采用单克隆抗体干板代替血清板，更利于运输和保存。2）同期建立的免疫磁珠淋巴细胞分离技术,使T淋巴细胞和B淋巴细胞的分离简捷、快速，特异性更强。 3）快速荧光染色技术的发展，使计算机读板成为可能。4自动化程序提高 目前从加样到读板均已实行自动化操作，大大提高了工作效率,使大批量样本的HLA分型成为可能。如UCLA配型中心周处理样本量可达到数千份到10000份。这是其他HLA分型技术难以做到的。综上所述,HLA血清学分型技术成熟，操作简捷、快速，标准化和自动化，对HLA-类A、
29、B抗原分型结果基本可靠，仍然是目前HLA分型，尤其是HLA-类抗原分型技术的主要方法之一。（四）血清学分型技术的局限性 尽管血清学技术对HLA-类抗原分型结果有较高的准确性,提供了组织配型的基本手段，并有力推动了HLA研究的发展.但血清学方法也存在诸多的限制。 1随着分子生物学技术的发展，对HLA分子结构与核苷酸序列分析研究的深入,每年都有许多新的等位基因特异性被发现和确定。血清学方法已经无法获得能够分辨出所有特异性的标准抗血清。 2HLA等位基因序列的高度同源性，使血清学出现较多、较强的交叉反应，影响了分型结果的准确性，并使亚型的进一步确定带来困难。如B40、B48同时存在时，确定B60、B
30、61、B48较为困难，常常只能根据不同人群种族与地域的抗原频率分布高低来判断。存在B62时，B71就难以分辨出来。A19分裂子的判断也常常出现误差. 3分型血清本身的问题： 类分型血清一般比较弱，容易出现假阴性反应； 相当多的类分型血清是用血小板吸收去除类抗体的方法得到的，可能造成抗体效价的下降，同时残留的类抗体也可以干扰分型结果。 4HLAC抗原血清学分型，至今缺乏理想的单特异性的抗血清。 5血清学方法检测的是淋巴细胞膜表面的HLA表现型。血清学的表型相同,DNA核苷酸序列不一定完全相同。HLA的个体遗传学差异的本质不是在血清学方法所检测的基因产物上,而是在编码基因产物的DNA水平上。 6淋
31、巴细胞膜抗原的表达受多种因素的影响与干扰。最近的研究显示：膜上的HLA抗原有可能被遮盖或表达能力下降。如HLAC抗原等位基因序列目前血清学尚不能分辨,淋巴细胞膜表面C抗原表达只有A抗原或B抗原的10%。 7HLA类抗原主要在B淋巴细胞表达，血清学分型较类A、B抗原误差率更高. 8目前用于血清学分型的抗血清或单克隆抗体,主要依据白种人群的HLA背景与频率分布特点而定，中国人的标准抗血清很少。因此，源于白种人群的血清学分型用于非白种人群的检测，本身就存在一定的误差. 9标准抗血清或单克隆抗体的筛选技术复杂，难度大，试剂来源受到限制。10血清学需要活的淋巴细胞，对于特定条件下的尸体移植，样本的来源受到一定的限制。 综合DNA分型与血清学分型结果，结合我国器官移植的实际情况，建议: 1)HLAI类A、B抗原
