1、学位论文4单位代码：10313 学 号：090212 中图分类号：R473.73硕 士 学 位 论 文Toll样受体4在长春瑞滨致静脉内皮损伤中作用的初步研究届 别： 二一二届 专 业： 护理学 学 位 类 型： 科学学位 研 究 方 向： 血液病护理学 研究生姓名： 钱韦韦 导 师 姓 名： 李振宇 副教授 高立艳 副教授 起 止 日 期： 2010年11月至2012年3月 2012年3月目 录缩略词表 1中文摘要 3英文摘要 5前 言 7第一部分Toll样受体4在长春瑞滨致小鼠静脉炎组织的表达及意义11材料和方法 111 材料 112 方法 123 结果 16第二部分Toll样受体4在长春
2、瑞滨致人脐静脉内皮细胞损伤中的作用研究17 1 材料 172 方法 223 结果 27讨 论29结 论33论文图片34参考文献41综 述47攻读硕士学位期间发表学术论文题目54临床培训小结55致 谢57论文声明59论文审阅认定书60缩 略 词 表Abbreviation缩略词英文全称中文全称cDNAcompentary DNA互补脱氧核糖核酸DEPCDiethylpyrocarbonate焦碳酸二乙酯EDTAEthylenediamine tetra-acetic acid乙二胺四乙酸FBSFatal bovine serun胎牛血清FNFibronectin纤维连接蛋白GFPGreen fl
3、uorescent protein绿色荧光蛋白HE stainHematoxylin and eosin stain 苏木素伊红染色HUVECHuman umbilical venous endothelial cells人脐静脉内皮细胞ILInterleukin 白细胞介素LPSLipopolysaccharide脂多糖NF-BNuclear factor-kappaB核因子-BPBSPhosphate buffer saline磷酸盐缓冲液PCRPolymerase chain reaction聚合酶链反应PPLPoly-lysine多聚赖氨酸PDTCAmmoniumpyrrolidine
4、dithiocarbamateNF-B抑制剂/抗氧化剂rpm Revolutions per minute转分RNARibonucleic acid 核糖核酸TLRToll-1ike receptorToll样受体TLRsToll-1ike receptorsToll样受体家族TLR4Toll-like receptor 4 Toll样受体4TrisHydroxymethylaminomethane 三羟甲基氨基甲烷TNF- Tumor necrosis factor-肿瘤坏死因子TIRToll-interleukin 1 receptor regionToll-白细胞介素1受体域VINVin
5、orelbine长春瑞滨 Toll样受体4在长春瑞滨致静脉内皮损伤中作用的初步研究中 文 摘 要目的 初步探讨Toll样受体4在长春瑞滨致静脉内皮损伤中的作用。方法 1Toll样受体4在长春瑞滨致小鼠静脉炎组织的表达及意义：取20只BALB/c小鼠，按随机数字表随机分为2组，每组10只。实验组按38 mg/kg尾静脉注射3.2 g/L长春瑞滨；对照组尾静脉注射相同体积的生理盐水。于给药后48 h颈椎脱臼处死小鼠，并取近心端距穿刺点1 cm处鼠尾组织，4%多聚甲醛中固定后以0.5 mol/L EDTA进行脱钙1周，常规石蜡包埋，切片，苏木精-伊红染色后显微镜下分析。免疫组织化学染色观察Toll样
6、受体4在小鼠尾静脉血管内皮细胞的表达。2Toll样受体4在长春瑞滨致人脐静脉内皮细胞损伤中的作用研究：取长势良好的HUVEC，接种于FN处理的24孔板或无菌培养瓶中，待细胞生长至融合度为90%-95%时，加入长春瑞滨浓度为0.05ug/ml 的EGM-2培养基，共同培养1h后，PBS洗涤，换入新鲜培养基继续培养0、6、12小时。RT-PCR以及荧光定量PCR检测TLR4的转录情况；Western Blot检测TLR4蛋白表达情况；免疫荧光检测NF-B p65的核转位情况。结果 1注射后48 h，实验组小鼠尾静脉血管出现内皮细胞脱落、血栓形成和炎细胞浸润，损伤部位内皮细胞高表达Toll样受体4，
7、对照组小鼠尾静脉血管无明显损伤表现，血管内皮细胞Toll样受体4阴性或弱表达，两组差异有统计学意义（P0.05）。20.05 ug/ml长春瑞滨干预1h后人脐静脉内皮细胞拉伸，延展，形态不规则，边界不清，排列紊乱，部分细胞悬浮脱落。洗去长春瑞滨换入新鲜培养基继续培养6h、12h后，细胞形态逐渐恢复正常；荧光定量PCR法检测各组细胞TLR4基因表达水平，结果显示：与空白对照组相比，各实验组TLR4表达量均升高，差异有统计学意义（P0.05），其中干预1h后升高幅度最大；Western Blot检测各组细胞TLR4蛋白表达水平，结果显示：与空白对照组相比，各实验组TLR4蛋白表达量均升高，差异有统
8、计学意义（P0.05），随着时间的增长TLR4蛋白表达量递增；免疫荧光检测NF-B的核转位情况，结果显示：与空白对照组相比，长春瑞滨干预1h后以及洗去长春瑞滨继续培养6h、12h，NF-B的核转位率明显升高（P0.05）。结论 1小鼠尾部血管推注长春瑞滨可能造成静脉炎，出现程度不同的血管内皮细胞脱落、炎性细胞浸润、血栓形成等病理学改变。 2小鼠以及HUVEC细胞试验表明在使用长春瑞滨导致药物性静脉炎过程中，内皮细胞TLR4表达增强；3HUVEC细胞试验表明，VIN刺激上调HUVEC TLR4蛋白及其mRNA的表达。4HUVEC细胞试验表明，VIN刺激促进HUVEC NF-B的活化及核转位。5上
9、述研究表明，TLR4可能在长春瑞滨导致静脉炎发生中发挥着重要作用。关键词 Toll样受体；长春瑞滨；静脉炎；人脐静脉内皮细胞；机制Effect Mechanism of TLR4 in vascular endothelial injury that induced by Vinorelbine AbstractObjective To investigate the effect mechanism of TLR4 in vascular endothelial injury that induced by Vinorelbine. Methods 1. 20 BALB/c mice wer
10、e divided into to two groups, vinorelbine was injected in the experimental group. The samedoseof saline was injected in the vehicle control group. Mice were euthanized 48 hours after vinorelbine injection, and injected mouse trail tissue near the puncturation site was fixed and further evaluated by
11、pathology. Severity of phlebitis was scored and the expression of TLR4 in phlebitis tissues was measured by immunohistochemistry. 2. The cells, at a density of 5104 cells/mL , were seeded in 25-cm2 flasks or 24-well plates. Upon reaching cell confluence of 90%-95%，the cells were washed twice with ph
12、osphate-buffered saline (PBS), and re-fed with VIN solution at the final concentration of 0.05 mg/L in the flasks or wells, Untreated control cells were re-fed with only medium. After 60 min incubation with VIN, the cells were washed twice with PBS and re-fed with medium without VIN and grown for 0,
13、 6 or 12h. After 0, 6 or 12h, cells were washed twice with PBS, and harvested for PCR, Western blot and immunofluorescence analysis. Experiments were repeated at least three times.Results 1. After vinorelbine injection, the vein endothenia cells were disrupted, thrombus and inflamatory cells were fo
14、unded, and TLR4 was positive in endothenia cells. In control group mice, the vein endothenia cells were intact and TLR4 expression in endothenia cells was negative or very low. 2. VINtreatedcellsstretch, extend,irregular, ill-defineddisorder, part of thecell suspensionnoff.Wash away theVINto continu
15、e to foster6h, 12h. Thecell morphologygraduallyreturned to normal; To verify TLR4 mRNA expression changes in the HUVEC, RT-PCR and quantitative real time PCR were performed. The TLR4 mRNA expression levels were significantly increased in the VIN-treated HUVEC (P0.05), compared with vehicle-treated g
16、roup. The effect of VIN reached a maximum at the time after exposure 1h; We performed western blot for the relative protein expression of TLR4 in HUVECs to assess the effect after treatment with VIN. The expression of TLR4 protein in all VIN-treated groups was increased significantly compared with v
17、ehicle-treated group(P0.05); NF-B activation as determined by NF-B phosphorylation was detected at different time and was no longer detectable at later time points. As expected, nuclear translocation of p65 occurred in HUVEC treated with VIN, and NF-B activation occurred within a very narrow window
18、in HUVEC during the course of vascular endothelialinjury.Conclusions 1. Pathohistological changes of the model group were observed, such as loss of venous endothelial cells, inflammatory cell infiltration and thrombus. 2. mouse and cell experiments indicates that TLR4 expression is up-regulated in v
19、ascular endothelial injury that induced by Vinorelbine. 3. cell experiment indicates that TLR4 mRNA and protein are up-regulated by Vinorelbine in HUVEC. 4. cell experiment indicates that nuclear translocation of p65 occurred in HUVEC treated with VIN. 5. Tegether, our results suggest that TLR4 may
20、play an important role in the development of vascular endothelial injury that induced by Vinorelbine.Key words Toll-like receptor; Vinorelbine; Phlebitis; HUVEC; Mechanism前 言随着工业化的进展、环境污染的加剧，人们的生活节奏越来越快，不良生活习惯及不良饮食的影响，肿瘤的发病率也逐年增高，无论在发达国家还是发展中国家，恶性肿瘤的危害都不容忽视。静脉输注抗肿瘤药物是治疗恶性肿瘤的主要方法之一，但往往引起严重的毒副反应，除对造血系
21、统及全身重要脏器具有毒性以外，对血管周围组织还可引起严重的炎性刺激反应。局部组织表现红、肿、热、痛等炎症反应，有时沿静脉走向出现条索状改变，严重者局部组织糜烂、坏死。肿瘤患者长期放、化疗，机体免疫力低下时，常导致全身感染而危及生命。 长春瑞滨是临床常见的抗肿瘤药物，属于长春花生物碱类药物，它的抗肿瘤活性主要通过干扰微管蛋白而抑制中期有丝分裂，目前主要用于非小细胞肺癌以及其他实体瘤等。然而在长春瑞滨给病人带来抗肿瘤疗效的同时，它作为中度发疱剂的一种，也常常引起局部毒副反应，局部组织发红，疼痛、肿胀甚至糜烂坏死。据报道1，其致静脉炎的发生率可达24-33%，国内学者报道其发生率甚至可达87%2。虽
22、然这种药物性静脉炎在临床常见，但是其确切机制仍不明确，目前普遍的观点认为药物性静脉炎是由于药物对血管内皮细胞的化学性刺激而引起的无菌性炎症。药物性静脉炎的形成因素包括药物种类、药液的温度、药液的PH值、药液的渗透压、药物本身的毒性作用、药物引起的变态反应以及药液的输液微粒等。另外药物性的静脉炎发生还与输入药液的剂量、浓度、输入速度、时间以及输注方法等有关2-28。抗生素和抗肿瘤药物导致的静脉炎的发生率最高29-30，抗肿瘤药物中以长春瑞滨最为严重。尽管临床工作者采取了许多防范措施，例如给药部位热敷、冷敷的方法，以及局部给予糖皮质激素、非甾体抗炎药、抗组胺药、血管扩张剂、局部麻醉药、抗凝药、溶栓
23、药甚至活血化瘀类中药等，但遗憾的是由于缺乏相应的基础研究支持，使得这些措施针对性不强，临床效果不明显，这种由药物自身因素引起的静脉炎并未得到改善。近年来有关静脉炎的基础研究主要是针对抗生素类药物的。目前国内外资料尚缺乏对化疗药物，特别是长春碱类化疗药物所致静脉炎的基础研究，化疗药物所致静脉炎的基础研究也仅局限于动物病理学水平，深入的机制研究鲜见报道，由此可见，深入研究药物静脉炎发病机制的需求非常迫切，在此基础上寻找临床上更为特异和有效的预防或治疗药物，对提高合理用药水平，减少药源性疾病损害，改善患者的生活质量具有重要的理论和实际意义。国外学者研究31-32表明血管内皮细胞在一定浓度的高细胞毒性
24、的抗生素的刺激下，细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、E-选择素(E-selectin)等黏附分子的表达增高，而这些细胞间相互作用相关的细胞表面标记物的表达，可能是药物性静脉炎重要的发生机制。那么临床常见的长春瑞滨所致的静脉炎中是否也存在这些细胞因子的表达变化？亦或存在其他炎症相关细胞因子的表达呢？Toll样受体(Toll-like receptor, TLR)是一类介导天然免疫的跨膜信号传递受体家族，在细胞活化信号的转导中起重要作用，是联系天然免疫与获得性免疫的桥梁33。被认为是目前哺乳动物唯一将细胞外抗原识别信息向细胞内传递
25、并引发炎症反应的关键跨膜蛋白34。哺乳动物中已发现至少13种TLR和一系列TLR配体，其中人TLR为TLR110，它们分别在不同的免疫应答机制中扮演各自的重要角色。免疫细胞通过其表面的Toll样受体家族(Toll-like receptors, TLRs)识别病原微生物启动天然免疫反应。各种不同的病原体，包括革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌、病毒和衣原体均可以被TLRs识别。在天然免疫过程中，TLRs捕获病原体上相应配体，启动细胞内信号途径，导致一系列酶的激活、核因子-B（nuclear factor-B，NF-B）途径活化及炎症因子的释放。TLR4在该受体家族中最早被发现，定位于人染色体9q32
26、-q33上，组织分布较广泛，见于血管内皮细胞、单核细胞、中性粒细胞、树突细胞、小肠上皮细胞、呼吸道上皮细胞、人齿龈成纤维细胞、人子宫颈平滑肌细胞、大鼠脾和心肌细胞等，主要功能是作为脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)的信号转导受体，在宿主的防御反应中发挥重要作用35-36。TLR4主要识别革兰阴性菌成份LPS，LPS通过激活宿主细胞膜上的CD14和TLR4受体，进一步活化NF-B，使单核和巨噬细胞产生IL-21、6、8和肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor-，TNF-)，趋化炎性细胞浸润，诱发炎症，刺激树突状细胞成熟，启动先天和后天免疫。研究表明，TLR
27、4不仅通过识别革兰氏阴性菌的LPS 启动细胞内信号转导，同时也识别结核分枝杆菌、烟曲菌、新型隐球菌和白色念珠菌等其他微生物的病原相关分子模式37。大量研究已证实TLR4在败血症、脓毒症、肠炎、阑尾炎、胰腺炎等感染性炎症反应中都发挥了重要作用。越来越多的证据显示，即使没有感染存在，内源性配体也可以刺激TLR4并引发免疫反应38。为区别微生物来源的外源性分子(如LPS等)，将其命名为TLRs的内源性配体。目前发现TLR4可以识别多种内源性配体，如透明质酸、硫酸肝素、纤维蛋白素原、高迁移率族蛋白1和热休克蛋白等。研究发现除了外源性配体以外, 内源性分子，比如热休克蛋白60(HSP60)、纤维结合素、
28、纤维蛋白原和透明质烷低聚糖也能够通过TLR4诱导促炎细胞因子的产生39。另一项研究也表明，某些创伤和手术等引起的全身炎症反应综合症和远离组织器官损伤时，循环中并未检测到细菌和内毒素，而应用TLR4阻断剂可明显减轻炎症反应和组织损伤，因此可能不是内毒素，而是内源性配体激活了TLR440。机体受到刺激时，体内某些内源性分子能从激活的免疫细胞、肠上皮细胞主动分泌或者从坏死或损伤的细胞中被动释放出来。这些内源性分子可被TLR4识别并结合，进一步诱导单核-巨噬细胞系统及树突状细胞的活化和成熟，促进炎症因子的释放41。以上研究均表明TLR4在非感染性免疫炎症反应中也发挥了重要作用。虽然迄今尚无TLR4参与
29、药物性静脉炎形成的相关报道，目前也尚不知道TLR4是否参加了VIN引发组织损伤的信号转导。但是基于药物性静脉炎的本质是由于药物对血管内皮细胞的刺激而引起的一种化学性炎症反应，而TLR4不仅可启动机体抗感染性免疫炎症反应，它还在非感染性免疫炎症反应的介导和信号转导中发挥重要作用42-46。我们提出如下设想：TLR4在长春瑞滨致静脉炎过程中发挥着重要作用。长春瑞滨致静脉炎的可能机制是：长春瑞滨刺激血管内皮细胞膜上的TLR4受体后，导致NF-B信号转导途经被激活，内皮细胞被活化；活化的内皮细胞与其配体结合，从而与白细胞黏附，导致内皮损伤和白细胞渗出，激发炎症过程，并继而通过一系列反应激活血小板聚集与血栓形成过程。为验证上述假设，本研究拟选择临床反应强烈、具有一定代表性的长春碱类药物长春瑞滨为研究对象，通过体内体外实验观察VIN对小鼠尾静脉血管内皮细胞以及人脐静脉内皮细胞(Human umbilical venous endothelial cells，HUVEC) TLR4表达及下游NF-B活化的影响，初步探讨TLR4在VIN损伤血管中的作用。本课题采用动物组织病理学及细胞形态学明确长春瑞滨对血管内皮细胞的损伤作用；分别采用动物和细胞的免疫组织化学、荧光定量PCR 、Western-blot
