1、小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定摘要： 过氧化氢酶(Catalase) 是一种广泛存在于生物体内的氧化还原酶，是过氧化物酶体的标志酶尤其在动物的肝脏、肾脏、红细胞中含量较多，其生物学功能是催化细胞内H2O2分解，防止过多H2O2 对细胞的危害。人工制备的过氧化氢酶可广泛应用于食品与乳制品业，造纸与印染业，农业与环保业，以及医疗卫生业等多领域。 过氧化氢酶分子量约为238KD，结构上由4个具有相同多肽链的亚基组成，是以铁卟啉为辅基的结合酶，在407nm波长下有特征性的吸收。溶于水,几乎不溶于乙醇、氯仿、乙醚等有机试剂，酸性环境下溶解度低易析出，最适温度为37，最适pH
2、值约为7.8。本实验以小鼠肝脏为原料，根据过氧化氢酶溶解性和大分子等特性，通过组织匀浆、盐析、透析、分子筛层析等步骤，提取纯化过氧化氢酶。建立了一套适合一般实验室分离纯化过氧化氢酶的方法，并对制备的过氧化氢酶进行蛋白浓度、分子量、米氏常数等测定。 现报告如下：一、实验器材1、实验动物： 成年雄性小鼠 （河北医科大学实验动物中心提供）2、主要器材： 托盘天平，组织捣碎机，离心管，H2050R高速冷冻离心机，CU600型电热恒温水箱，DYY-8L型电泳仪（北京市六一仪器厂），H2S-H水浴振荡器（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司），垂直板型电泳装置，制冰机，4冰箱二、 实验方法1、过氧化氢酶制备
3、匀浆是根据过氧化氢酶的性质，利用有机溶剂将组织细胞捣碎，使其释放出 来的方法。小鼠肝脏匀浆液制备：用颈椎脱臼法处死小鼠，取出肝脏，称重 6g；按1：8.5的比例加入匀浆缓冲液51ml（0.05mol/L醋酸-23.5%乙醇缓冲液，pH4.0）,匀浆机捣碎3-5min；缓慢滴加匀浆液体积0.5倍的氯仿（边加边快速搅拌）再次匀浆1min；匀浆液离心（4, 6500rpm, 30min）后保留上清液备用。 盐析是在过氧化氢酶中加入适当浓度的中性盐溶液，破坏其水化膜，使其成盐析状态而沉淀下来，离心后可除去部分杂蛋白。盐析法粗提过氧化氢酶：缓慢加入上清液体积0.06倍的0.5mol/L的硫酸钠溶液，冰浴
4、搅拌1h，离心（4, 6500rpm, 10min），保留离心沉淀；加入4倍肝重（0.1mol /L pH7.8）的磷酸缓冲液手动玻璃匀浆器使沉淀溶解,离心（4, 4000rpm, 10min）,保留上清备用。 透析是利用透析袋的半透过性，在一定透析条件下，使过氧化氢酶以不变性的沉淀形式析出，复溶后，可除去部分杂蛋白。透析法纯化过氧化氢酶：将上清液置于透析袋，透析两周（透析液：20%乙醇，0.1mol/L pH4.7醋酸缓冲液，0.1mol/L氯化钠）中途更换一次透析液；透析后取出浊溶液，离心（4, 6500rpm, 10min），取沉淀，溶于0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液中,离心（4
5、,4500rpm, 10min）收获上清，得到小鼠肝脏过氧化氢酶溶液。将收获的上清液（3组合并为一组）放入处理过的透析袋中，置于50%的甘油中包埋浓缩24小时后放冰箱保存，制备过程中各阶段产物用比色测定法测定酶活，分析制备效率。分离纯化产物酶活性回收率用各步产物的酶活占匀浆上清液酶活的百分比来表示。 层析是根据混合物中各种物质分子大小不同，在凝胶层柱的扩散移动速度不同使混合物分离的方法。分别在280nm和407nm波长下测光吸收值，合并收集峰值重合管，得到纯化过的过氧化氢酶。取出装柱好的层析柱，打开出口使缓冲液缓缓流出，当液面与凝胶床面平齐时，沿柱口旋转加样，同时开始收集层析柱的流出液，每管收
6、集约25滴，一次在407nm和280nm波长下，测定各管吸光度值。并绘制曲线。2、过氧化氢酶的性质测定 电泳电泳是根据带电颗粒在电场作用下向着预期与其电荷相反的电极移动的现象，蛋白质电泳迁移率主要取决于它的相对分子量。所以用电泳法可测定过氧化氢酶的分子量。用定量移液器把样品和MAKER加在配好的SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板的样品槽内，接上电源开始电泳（55min），取出凝胶，用考马斯亮蓝R-250染色15min；脱色后放置一周后观察蛋白质条带情况，并计算相对迁移率 lowry 法测定纯化的过氧化氢酶浓度是根据蛋白质中的酪氨酸与酚试剂之磷钼酸、磷钨酸作用产生蓝色化合物，其颜色深浅与蛋白含量成正比
7、的方法。作出标准曲线的到过氧化氢酶的浓度制作标准蛋白的选择：选择与待测样品相同组成的蛋白质作为标准蛋白溶液。标准蛋白溶液的配制：将标准蛋白经凯式定氮法准确测定其蛋白含量，再用无离子水配成0.1mgmL储存液。按照表（如下）配成不同浓度的标准蛋白组，编上号码，以第一管为空白管，在分光度计上测定650mn处的光密度值。以各标准浓度为横坐标，各管密度值为纵坐标作图，绘制标准曲线。 米式常数值测定滴定法：以H2O2 为底物，用过氧化氢酶催化其分解10min，加入硫酸终止催化反应，并用已知浓度高锰酸钾滴定剩余的H2O2，换算出减少的H2O2的量，进而计算出酶的活力。在Km值测定中采用此法测定酶活力。过氧
8、化氢酶活力单位定义为：以每分钟催化1molH2O2减少所需的过氧化氢酶的量作为一个酶活性单位（U）。样品的比活以每毫克样品蛋白所含的酶活性单位数表示。三、 实验结果层析后蛋白吸光度变化曲线图407nm280nm160.0930.158170.1080.189180.1350.234190.4750.264200.1520.222210.1710.210220.1700.194图如下：SDS-PAGE测定过氧化氢酶分子量标准蛋白分子量LgMr样品迁移距离(cm)BPB的迁移距离(cm)RfA974004.990.44.730.084B662004.820.70.148C427004.631.40
9、.296D310004.492.00.422E144004.163.60.761层析样品60255.94.780.90.190相对迁移率Rf=样品迁移距离/BPB的迁移距离LgMr（层析蛋白）=4.78 Mr（层析蛋白）=60255.9Mr（过氧化氢酶）=4* Mr（层析蛋白）=241.024KD图如下：lowry 法测定纯化的过氧化氢酶浓度不同浓度的标准蛋白质组配置：123456匀浆层析标准蛋白溶液00.20.40.60.81.01.01.0生理盐水1.00.80.60.40.2000试剂AB11111111试剂C33333333A65000.0010.1310.1920.2550.3120
10、.1340.090蛋白质浓度00.020.040.060.080.100.0430.028图如下：Km值的测定：项目123加入H2O2的ml数2.502.001.0KmnO4的用量16.913.36.31/v=164.5274.07117.651/s=130.0037.4575.19酶活= 消耗底物量 /时间 酶体积图如下：小鼠肝脏过氧化氢酶分离纯化溶液体积(ml)蛋白浓度（mg/ml）酶活Kmmmol/L 分子量IU /ml总酶活(105)比活（IU/mg）回收率%匀浆产物49.71.4323.21031.590444.910058.8241.024 KD盐析产物23.8 层析产物1.250
11、.028558697.515910417.4比活（IU/mg） = 酶活力/蛋白浓度总酶活力105 = 酶活力溶液体积酶活力(U/ml) = (H2O2 的浓度 加入H2O2 的ml数2.5KmnO4 ml数KmnO4浓度 / 加入样品的ml数) 105回 收 率% = 用各步产物的酶活力占匀浆离心上清液酶活力的百分比来表示四.实验讨论 1.为什么选择雄性小鼠的肝脏做实验？答：因为雄性小鼠的身体健康指标比雌性小鼠要好。实验要减少偶然，就必须保证在实验过程中引起某个症状的原因是客观的，而不是由于小鼠本身的原因造成的，所以用雄性小鼠会好一点。过氧化氢酶存在于所有已知的动物的各个组织中，特别在肝脏中
12、以高浓度存在。所以用雄性的小鼠的肝脏做实验。2.组织匀浆法的目的是什么？答：在保证过氧化氢酶天然活性的状态下，把肝脏细胞打碎，释放出过氧化氢酶3为什么匀浆缓冲液中加23.5乙醇？答：因为乙醇可以溶解酯质的物质，而过氧化氢酶在乙醇中溶解度很小。4.匀浆法中，为什么加氯仿，而且要边加边搅拌？答：加氯彷是让除过氧化氢酶以外的蛋白质变性。因为氯仿能使蛋白质变性，但过氧化氢酶遇氯仿不变性。边加边搅拌是防止因局部氯仿浓度过高，将过氧化氢酶也氧化。5.盐析时，为什么选择硫酸钠？答：盐能破坏蛋白质的水化膜，使蛋白质沉淀。硫酸钠是中性盐， 对溶液的pH影响小。氯化钠也行。6.盐析时，为什么要在冰浴搅拌的状态下，
13、且要缓慢滴加？答：常温下，酶的活性有损伤。搅拌和缓慢滴加，是防止局部盐浓度过高，使杂蛋白析出。7.为什么匀浆、透析中用醋酸缓冲液，而盐析、凝胶层析中用的都是磷酸缓冲液？答：醋酸缓冲液的缓冲范围的pH值在4.7左右，过氧化氢酶在pH为4.7左右的溶液中溶解度极小，而磷酸缓冲液的缓冲范围的pH值在7.8左右，过氧化氢酶在7.8左右的溶解度很大，醋酸缓冲液是使过氧化氢酶沉淀，而磷酸缓冲液是使过氧化氢酶溶解，这两种缓冲液的作用目的不一样。8.为什么透析袋要煮沸后才能使用？答：为防干裂，透析袋出厂时都用10的甘油处理过，并含有极微量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质，它们对蛋白质和其它生物活性物质
14、有害，用前必须除去。可先用50乙醇煮沸1小时，再依次用50乙醇、0.01 mol/L碳酸氢钠和0.001 mol/L EDTA溶液洗涤，最后用蒸馏水冲洗即可使用。实验证明，50乙醇处理对除去具有紫外吸收的杂质特别有效。使用后的透析袋洗净后可存于4蒸馏水中，若长时间不用，可加少量NaN3，以防长菌。洗净凉干的透析袋弯折时易裂口，用时必须仔细检查，不漏时方可重复使用。9.为什么透析时透析液的pH要维持在4.7左右？答：过氧化氢酶在pH为4.7的时候溶解度小，容易沉淀。而杂蛋白不易沉淀，溶解在其中，易于分离。10.透析后，为什么要将装有样品的透析袋置于50%的甘油中包埋浓缩？而不能用干燥剂？答：50
15、%的甘油起到一种类似吸水的作用。干燥剂对酶有损伤。11.为什么用小分子物质甘油中包埋浓缩透析液？答：虽然甘油是小分子物质，可以自由透过透析袋，但甘油与水分子不是一比一的进出，往往甘油进入的少，相比其他试剂，甘油是较经济、实用的。12为什么在凝胶层析法中要转着加样？答：因为沿着层析柱边缘转着加样，可保持胶面平整，有不平整可用玻璃棒在胶表面轻轻搅拌，使胶粒浮起，沉淀，让胶层重新平整。13.层析时为什么用OD280与OD407双重比色？答：OD280是普遍蛋白质的紫外吸光峰值，OD407是过氧化氢酶的特异紫外光吸收峰值。两次比色双重保证了能准确选择含有过氧化氢酶的收集管。14在SDS-PAGE中，为
16、什么用甲醇和冰醋酸做缓冲液？答：染色液中的甲醇和冰醋酸，在染色过程中，还起固定蛋白质的作用，此法的检测灵敏度为0.2 1g，虽然不如银染色法的灵敏度高，但是操作简便，背景干净清楚，显色带的颜色深浅一般与蛋白质的量成正比，可用于蛋白质的定量测定。15.通过该实验，酶作为生物催化剂的特点有什么进一步的认识？答：酶的特性高效性：酶的催化效率比无机催化剂更高，使得反应速率更快；专一性：一种酶只能催化一种或一类底物，如蛋白酶只能催化蛋白质水解成多肽；多样性：酶的种类很多，大约有4000多种；温和性：是指酶所催化的化学反应一般是在较温和的条件下进行的。活性可调节性：包括抑制剂和激活剂调节、反馈抑制调节、共
17、价修饰调节和变构调节等。.有些酶的催化性与辅因子有关。易变性，由于大多数酶是蛋白质，因而会被高温、强酸、强碱等破坏。 16.过氧化物酶与过氧化氢酶作用机制有什么不同？答：过氧化氢酶存在于过氧化物酶体中,可对细胞起保护作用，使细胞免受过氧化氢的危害。过氧化氢酶，是催化过氧化氢分解成氧和水的酶，存在于细胞的过氧化物体内。过氧化氢酶是过氧化物酶体的标志酶, 约占过氧化物酶体酶总量的40%。过氧化氢酶存在于所有已知动物的各个组织中，特别在肝脏中以高浓度存在。过氧化氢酶在食品工业中被用于除去用于制造奶酪的牛奶中的过氧化氢。过氧化氢酶也被用于食品包装，防止食物被氧化。五注意事项1) 取雄鼠肝脏时，尽量把肝
18、脏取尽，避免取肝脏以外的组织。2) 使用离心机要注意平衡，平稳，对称，牢固，缓慢，以防止损伤离心机。3) 手动玻璃匀浆器助溶时，要注意缓慢旋转推移，时间稍微长一些，使溶解的更充分。4) 每次离心试验后，不要晃动，避免有少量沉淀溶解，对实验结果造成影响。5) 使用分光光度计前，要记得调零。6) 装柱时，避免出现断层，干胶。7) 层析时，加样品和缓冲液时要旋转加入，并及时补充缓冲液，要避免干胶。8) 加样时，要加在加样口里，不要加到样品槽外。9) 拔样品槽模板（梳子）时要小心，注意不要破坏胶。六结果误差分析本次实验结果与理论数值基本符合，但稍有误差。可能因为：a) 使用的仪器内有杂质，仪器老化b)
19、 滴加的试剂与酶没有充分接触c) 酶因为操作时温度稍高部分会失活d) 拿出离心管时稍微晃动使沉淀与上清液混合e) 层析时收集的液滴大小不均造成吸光度测量误差f) 滴定时计时不准确，滴定终点人为判断不一致g) 滴定前过氧化氢分解或稍被硫酸污染 h) 周围环境中的杂蛋白影响，i) 可能因为实验时间过长造成酶活性降低六结语 据文献资料，目前商品化过氧化氢酶多以家畜家禽的血液，肝脏为原料，利用离子交换、凝胶层，纤维固定化等技术制备，但是操作多杂，成本极高8000元/kg,且酶活性回收率极低（约30%左右）故不适合实验室的一般使用。 本次实验以小鼠肝脏为原料，采用实验室常用的盐析，透析，离心等简单技术，即可获得少量纯度较高，回收率高的过氧化氢酶，成本相对低廉，是实验室的理想选择。【参考文献】现代医学实验技术（下）-人民卫生出版社 段惠军 主编生物化学实验原理和方法-北京大学出版社.余瑞元等主编生物化学实验技术-化学工业出版社.何晓钟 主编实用化学提纯技术指南-科学技术出版社 郑阳科 主编感谢XX百科 XX文库 GOOGLE 豆丁在线文库 新浪分享的大力支持
