1、炭疽病诊断治疗与处置方案附件1炭疽病诊断治疗与处置方案（2005年版） 炭疽（anthrax）是炭疽杆菌(Bacillus anthracis)引起的动物源性传染病。炭疽杆菌主要从皮肤侵入引起皮肤炭疽，使皮肤形成焦痂溃疡与周围脓肿和毒血症，也可引起吸入性炭疽或胃肠炭疽，均可并发败血症。炭疽杆菌有可能作为生物武器被恐怖分子所利用，因而近年来得到国际社会的普遍关注。病原学炭疽杆菌是形体最大的革兰氏阳性杆菌，大小11.5 35 m，两端平截，呈链状排列，镜下形态呈竹节状（图1），链的长短因菌株和细菌所在环境而异。在人体、动物体内或特定环境条件下（于碳酸盐琼脂培养基上于5%25% CO2下培养），该菌
2、可形成荚膜（图2），印度墨汁染色可见杆菌周围的透明环，碱性美蓝染色荚膜呈红色（图3）。在体外环境下可形成芽胞（图2），未游离的芽胞在菌体中央。此菌无鞭毛，不运动。该菌在普通培养基生长良好，最适培养温度为3537，普通孵箱培养和CO2 孵箱培养均可，在厌氧条件下也能生长。普通营养琼脂平板上形成的菌落为粗糙型，表面湿润，呈狮子头状，有的菌株在菌落一侧形成尾突（图4）。于血琼脂平板上培养1524 h，分离较好的菌落直径为 25 mm，扁平和微突起的菌落呈不规则圆形，边缘为波浪状，表面光滑。培养物为黏性，当用接种环挑取时会形成立起的尾状突起（图5）。炭疽杆菌不造成-溶血（图6），但在长时间融合，过度生
3、长区可能见到微弱溶血现象，不能与-溶血混淆。低倍显微镜下菌落边缘呈卷发样，称为狮头样菌落（图4）。该菌在纯培养菌接种肉汤培养的基培养特征为絮状沉淀生长，肉汤培养基不混浊。图1 在血琼脂平板上炭疽杆菌革兰氏染色（略）（放大1000倍）图2 炭疽杆菌（略）左图为带芽胞炭疽杆菌，革兰氏染色（1000）；右图为游离芽胞，为孔雀绿染色。图3 炭疽杆菌感染动物脏器压片（略）炭疽杆菌排列竹节状，美蓝染色，荚膜为粉红色，菌体为蓝色。图4 炭疽杆菌在普通营养琼脂平板上过夜培养后形成的菌落形态（略）左图，表面粗糙、有尾状突出部分；右图为典型的“狮子头”样菌落，呈卷发样（100）。 图5 炭疽杆菌在血琼脂平板上形成
4、的黏性菌落（略） 图6 炭疽杆菌（右侧）和腊肠样芽胞杆菌（左侧）（略）炭疽杆菌生化反应不活跃，卵黄反应、硝酸盐还原和明胶液化以及触酶均为阳性，不分解淀粉和甘露醇。抗原结构可分为两大组，即菌体抗原和外毒素。菌体抗原包括荚膜多肽和菌体多糖。荚膜具有抗吞噬作用，与毒力有关，细菌变异不形成荚膜时，致病性也随之消失。多糖抗原与毒力无关。外毒素复合物由水肿因子、致死因子和保护性抗原组成。特异性裂解炭疽杆菌g噬菌体可用于该菌的鉴定。但不同来源的菌株对该噬菌体的敏感性不同，极少数腊样芽胞杆菌对该噬菌体敏感（如ATCC4342株），也发现缺失两个毒力质粒的菌株对该噬菌体不敏感（如CDC680株）。在进行噬菌体裂
5、解鉴定细菌时，应采用分区划线接种法，在第一、二区滴加一定浓度的噬菌体。具有两个毒力质粒的强毒株比较敏感，在平板上第一、二区均可见到裂菌的透明环，但第二区更明显；缺乏pX01质粒的菌株在第一、二区均可见较大透明裂菌环；而缺乏pX02质粒的Sterne株在第一区形成更加透明的裂菌环。这种现象与质粒的有无并无直接关系，试验证实，具有pX01质粒的菌株在血琼脂平板上生长1820h，比缺失该质粒的菌株可形成更多数量的芽胞，因此，具有pX01质粒的菌株在普通培养平板上生长时，形成大量芽胞，产生大量细胞碎片，当噬菌体加入时，会与细胞碎片上的受体结合而失活；反之，当噬菌体加入缺失pX01质粒的菌株生长物时，大
6、部分噬菌体会感染细菌，使之裂解。炭疽杆菌繁殖力、抵抗力与一般细菌相同，但芽胞抵抗力较强。常规消毒剂如石炭酸、煤酚水、新洁尔灭等季铵盐类消毒效果较差；过氧乙酸、甲醛、环氧乙烷、0.1%碘液和含氯制剂杀芽胞效果较好。高压12130min，干热140 3h可杀死芽胞。炭疽杆菌对青霉素敏感，培养试验10U/ml即可抑制细菌生长，对链霉素、四环素、卡那霉素也都敏感。流行病学人类主要经接触牲畜的毛皮和肉类获得感染，食肉动物也可从食草动物获得感染，并辗转感染人类。与牲畜接触频繁的人如牧民、兽医和屠宰工人的感染机会较多。被炭疽杆菌污染的毛、皮进入加工企业，或感染的肉类进入市场，也可能造成暴发流行。人类感染炭疽
7、杆菌主要通过接触途径，以皮肤炭疽最为常见。通常散发，病死率不高，可以彻底治愈，部分甚至能够自愈。但是，由于严重污染造成的吸入感染，或感染牲畜的肉类引起的食入感染，可能造成吸入性炭疽及胃肠炭疽的暴发流行，病死率甚高。严重感染者有时发生炭疽性脑膜炎。炭疽在我国普遍存在，历年来发病数波动不大，全国的发病数在数百至千余例范围内。高发的省区较为固定，在过去的5年中排序为：贵州、新疆、甘肃、四川和广西。有几方面的原因造成这些省区的高发：畜牧业的发展，群众屠宰病畜的习惯，这些都造成土壤污染面积的增加。此外，诊断率还与医务人员对本病的警觉性有关。炭疽的诊断时往往需要流行病学证据的支持，但由于炭疽杆菌在自然界存
8、在时间非常长，这种流行病学证据有时难以获得。特别是在诊断皮肤炭疽时，不应要求必须具备流行病学证据。在受到炭疽杆菌作为生物武器的袭击情况下，炭疽的流行病学可能与和平条件下完全不同。病理学及发病机理一、炭疽发病机理炭疽杆菌的致病性与其产生的外毒素和多肽荚膜有关，二者分别由2个质粒（pX01及pX02）编码。荚膜有抗吞噬作用，pX02缺失的菌株不能形成荚膜则易被白细胞吞噬并杀死，因而没有致病作用。炭疽杆菌的外毒素由3个蛋白组成：保护性抗原（PA）, 致死因子（LF）和水肿因子（EF）。PA结合于细胞表面受体，作为另两因子的结合位点。二者一旦结合，PA受体复合物就会促进LF和EF进入细胞内。LF和PA
9、结合形成致死毒素（LT），EF和PA结合形成水肿毒素（ET）。LT在细胞内使主要的丝裂素蛋白活化激酶失活。干扰细胞内信息传导，释放氧自由基及前炎症细胞因子，引起细胞死亡，并破坏血管屏障。ET作为一个钙调蛋白依赖性腺苷环化酶可导致细胞内cAMP水平的急剧增加，导致平衡破坏，抑制中性粒细胞，使人体对炭疽杆菌更加敏感，致局部受染，并发生水肿。这2个毒素和毒血症状有关，严重时可导致多器官衰竭死亡。炭疽杆菌繁殖体或芽胞进入人体后，被吞噬细胞吞噬，芽胞即复苏繁殖，产生外毒素并形成抗吞噬的荚膜。外毒素直接引起局部组织水肿，出血、坏死，并可引起全身毒血症状。抗吞噬的荚膜则使细菌更易于扩散，引起导流的淋巴结出血
10、坏死，甚至侵入血流引起败血症。如侵犯脑膜，可致脑膜出血、水肿。二、炭疽的病理学变化根据感染途径不同，人类炭疽分为皮肤炭疽、吸入性炭疽和胃肠道炭疽3种主要原发病类型。（一）皮肤炭疽主要发生在皮肤暴露部位，如手臂、面颈。当炭疽杆菌或芽胞从损伤的皮肤进入体内后，首先在局部大量繁殖，产生外毒素，致局部皮肤水肿、出血、组织坏死。皮肤炭疽的潜伏期一般为23天（9h12天），首先在局部出现小而痒的丘疹，次日即见疹中心变成小水疱，周围组织肿胀，继之，中心部坏死，形成一无痛性脐形溃疡，直径13cm，溃疡周围环以水疱，疱内为浆液血性液体，含大量炭疽杆菌。溃疡的坏死组织与血性渗出物形成一特征性黑色痂皮，特称结痂（e
11、schar）。病变部神经纤维变性，故局部无痛感。溃疡周围组织水肿十分明显。显微镜下，局部显著充血，皮肤表层坏死，真皮水肿、坏死、出血，炎细胞反应轻微，或仅见轻度中性粒细胞浸润，或见血管炎，血管周围单个核细胞浸润。局部可发生淋巴结肿大、水肿出血、疼痛。头颈部的皮肤炭疽，水肿常很快沿着软组织扩散致颈、胸、肩部，甚者可致呼吸困难，这种广泛水肿称为恶性水肿。一般黑痂形成数日后开始缓慢愈合，2周后水肿可渐吸收，痂皮脱落，80%可自然愈复。对皮肤炭疽禁忌切除，重症病例可并发败血症或引起炭疽性脑膜炎。图7 皮肤炭疽（略）左图：面部炭疽，下眼睑溃疡焦痂形成，眼睑及面部水肿右图：下肢炭疽，下肢水肿、溃疡焦痂周围
12、绕以水泡溃疡的渗出物内有大量炭疽杆菌，取渗出物涂片作细菌染色有助于确诊。用Steiner染色，炭疽杆菌呈黑色，用革兰氏染色炭疽杆菌呈紫色。抗生素治疗55h，细菌仍较多，治疗超过72h，细菌将明显减少，革兰氏染色可能为阴性，此时可做免疫组化染色。如应用抗炭疽杆菌细胞壁抗体、抗炭疽杆菌荚膜抗体做免疫组化染色。免疫组织化学检查除能显示细菌，还能显示细胞内外的细菌碎片或颗粒状抗原，有助于对经过治疗患者的确诊。（二）吸入性炭疽 由吸入炭疽芽胞引起感染，潜伏期尚未完全确定，估计高剂量吸入潜伏期为16天，中位数为4天。吸入的炭疽芽胞在肺内立即被肺泡吞噬细胞吞噬，几小时之内，被转运至纵隔淋巴结，肺内不遗留特异
13、性炎症。早期胸部X线检查均有异常，主要为纵隔增宽、胸水或有肺部小的浸润灶（水肿）。尸检可见纵隔、肺门和支气管旁淋巴结呈急性充血、出血，有中性粒细胞浸润和细胞碎片，并含有大量炭疽杆菌，有的小血管内可见新鲜血栓，这些改变使淋巴结肿大，大者直径达46cm，淋巴结周围的脂肪结缔组织也可出现高度水肿、充血、大片出血，使整个纵隔呈胶冻样水肿团块。胸膜也可水肿增厚，胸腔内见有大量浆液血性积液。肺泡内可有不同程度的水肿，局灶性透明膜形成。吸入性炭疽早期查痰无意义。一般来说，胸膜表面及胸腔积液内含有大量炭疽杆菌，取胸水检测可助于确诊。用抗生素治疗3天以上，革兰氏染色常为阴性，此时可取胸水离心，将细胞制成蜡块，用
14、切片作免疫组化染色（用抗炭疽杆菌荚膜抗体或细胞壁抗体），可见杆菌片断和颗粒状抗原。说明免疫组化染色在确诊中较为重要。此外，聚合酶链反应（PCR）也可证实胸水中的炭疽杆菌。图8 吸入性炭疽的病理改变（略）A 纵隔出血水肿淋巴结出血肿大 B 纵隔软组织出血C 纵隔淋巴结组织坏死、核固缩 D 淋巴结可见免疫母细胞及固缩核吸入性炭疽可发生败血症，脾脏充血肿大，脾髓内含有大量的炭疽杆菌。在肝窦、枯否细胞、肠浆膜面及肠黏膜下血管内均见炭疽杆菌抗原。吸入性炭疽也可发生脑膜播散引起出血性脑膜炎，脑脊液（CSF）中培养出炭疽杆菌。（三）胃肠炭疽在自然感染中，胃肠道炭疽较多见，系由于食入炭疽杆菌污染严重的未熟肉类
15、感染。胃肠道炭疽分为2型：口咽型及胃肠型（腹型）。1、口咽炭疽大多为单侧，多数病变位于扁桃体，也见于悬雍垂及软腭。早期病变为局部水肿、充血，第一周末黏膜中心坏死，溃疡形成，第二周初溃疡上可见假膜。所有患者均有颈部肿胀，75%为单侧，淋巴结肿直径可达4 cm。软组织肿胀与淋巴结肿大同时存在可压迫患者的呼吸道。曾有报道，5例原诊为扁桃体脓肿而行手术探查，但没有化脓。另有报道，24例中3例死亡（死亡率13%），此3人的潜伏期均小于24h，提示感染更为严重，血培养可为阴性，咽拭子为阳性，说明咽拭子对口咽炭疽的确诊甚为重要，PCR及免疫组化染色也有助于诊断。2、胃肠型炭疽因进食被炭疽杆菌污染的食物而发病
16、，肠道病变通常位于回肠及盲肠，肠壁水肿出血、坏死，肠黏膜有溃疡，肠系膜淋巴结肿大，伴或不伴有血性腹水，沾有血的粪便中可培养出炭疽杆菌。 图9 盲肠升结肠水肿出血，肠系膜淋巴结肿大（略）临床表现潜伏期：一般为15日，也有短至12h，长至2周者。随炭疽杆菌侵入途径及部位的不同，临床上主要分为皮肤炭疽、吸入性（肺型）炭疽和食入性（胃肠型）炭疽。部分患者可发展为败血症、脑膜脑炎等重症，预后不好。一、皮肤炭疽约占95%98%，病变多见于手、脚、面、颈、肩等裸露部位皮肤。最初为皮肤破损部位（皮肤破损轻微时，可无明显伤口）出现斑疹或丘疹，第2日在皮疹顶部出现小水疱而成疱疹，内含淡黄色液体，周围组织变硬而肿胀
17、。第34日病变中心呈现出血性坏死、组织稍下陷，周围有成群小水泡，水肿区继续扩大。第57日坏死区溃破成浅溃疡，血样渗出物结成硬而黑似炭块状焦痂，痂下有肉芽组织生成。溃疡直径15cm不等，其周围皮肤浸润及水肿范围较大，直径可达520cm。由于局部末梢神经受损而无明显疼感和压痛，有轻微痒感，无脓肿形成，这是皮肤炭疽的特点。以后随水肿消退，黑痂在12周内脱落，肉芽组织增生愈合缓慢。大多数病例为单灶性发病，但个别病例可因抓挠病变部位而出现多处疱疹，致自身感染。病程约16周。皮肤炭疽发病同时，多出现发热（3839）、头痛、关节痛、全身不适以及局部淋巴结和脾肿大等中毒症状和体征。少数病例皮肤局部无水疱和黑痂
18、形成而表现为大块状水肿，患处肿胀透明、微红或苍白，扩展迅速，多见于眼睑、颈、大腿及手部等组织疏松处。全身中毒症状严重，表现为高热、头痛、恶心、呕吐，若贻误治疗，预后不良。图10 吸入性炭疽患者的纵隔增宽（略）二、吸入性炭疽因暴露于芽胞或吸入污染芽胞尘埃所致。急性起病。多在暴露后25天出现低热、疲劳和心前区压迫等，持续23天后，症状突然加重，轻者表现为胸闷、胸痛、发热、咳嗽、咯带血黏液痰。重者寒战、高热、由于纵膈淋巴结肿大、出血并压迫支气管造成呼吸窘迫、气急喘鸣、咳嗽、紫绀、血样痰等，并可伴有胸腔积液。肺部体征与病情常不相符。听诊肺部仅可闻及散在的细小湿罗音或有摩擦音、呼吸音降低等胸膜炎体征。X
19、线检查见纵隔增宽、胸水及肺部浸润性阴影。常并发败血症及脑膜炎，若不能及时诊断、积极抢救，患者多在急性症状出现12天内发生感染中毒性休克、呼吸衰竭或循环衰竭而死亡。三、胃肠型炭疽主要由于食入未煮熟的被炭疽杆菌污染的病蓄的肉类食品而引起，偶而可因饮入被炭疽病菌污染的水或牛奶而患病，与患者一起进食的人可相继发病。临床上可表现为口咽部炭疽和胃肠道炭疽。口咽部炭疽：表现为严重的咽喉部疼痛，颌下及颈部明显水肿、局部淋巴结肿大，水肿压迫食管引起吞咽困难，压迫气管时可引起呼吸困难。胃肠道炭疽：症状轻重不一，轻者恶心呕吐、腹痛、腹泻，但便中无血，里急后重不明显，可于数日内恢复。重者可表现为腹痛、腹胀、腹泻、血样
20、便等急腹症症状，易并发败血症和感染中毒性休克。如不及时治疗常可导致死亡。四、其他临床表现炭疽性败血症：吸入性炭疽、胃肠型炭疽和严重的皮肤炭疽可继发败血症，除局部症状加重外，表现为全身毒血症加重，高热、寒战、衰竭等。炭疽性脑膜炎：继发于皮肤炭疽的病例小于5%。极个别病例可继发于吸入性和胃肠型炭疽。临床表现为化脓性脑膜炎，起病急骤，有剧烈头痛、呕吐、昏迷、抽搐，明显脑膜刺激症状，脑脊液多呈血性，少数为黄色，压力增高，白细胞数及中性粒细胞增多。病情发展迅猛，常因误诊得不到及时治疗而在发病后24日内死亡。实验室检查 一、血常规检查主要为白细胞计数升高。一般为1020109/L，病情严重时高达60801
21、09/L。分类显示中性粒细胞增高，可达70%以上。二、病原学检查炭疽杆菌的病原学操作，应在生物安全二级实验室中进行。1、涂片及培养：采集皮肤溃疡的渗出物、排泄物、血、胸腹水及脑脊液等标本进行涂片和培养。所采标本经涂片、革兰氏及碱性美蓝染色后行显微镜检查，可观察到大量两端平齐、呈长串联状排列的革兰氏阳性杆菌，菌体较大，周围环绕荚膜。陈旧培养物经孔雀绿芽胞染色可见到大量的细菌芽胞。荚膜染色：在玻片上涂组织液，或荚膜菌培养物，自然干燥。置纯甲醇或乙醇中固定1min，取出晾干。滴加多色美蓝染料染色35min，在次氯酸盐中脱色。水洗，吸干，油镜观察。菌体呈现蓝色，荚膜呈现红色。所有标本都应立即涂片，染色
22、，进行显微镜检查。随后进行细菌培养。2、PCR检测：在正常的无菌标本（如血液、脑脊液）涂片镜检中，未发现大量均一的革兰氏阳性杆菌，而仅依靠细菌分离培养才能获得可疑的炭疽杆菌的细菌时，应尽可能进行PCR检测。可直接使用临床标本进行检测，也应对分离获得的培养物检测，标本可经沸水浴10min处理，或经蛋白酶K消化，并使用碘化钠-玻璃粉吸附以富集DNA。推荐检测质粒上的保护性抗原基因（pag），荚膜形成基因（cya）和染色体上的炭疽杆菌特异基因（ropB）。推荐的引物序列为：pag: F:5-ATTTGCGGTAACACTTCACT-3, R:5-AGACCGTGACAATGATGGAA-3；cya:
23、 F:5-CGGATTGTATATGGAGTGGG-3,R:5-GGGACAGGAATGTTTGGATC-3； ropb: F:5-GTACGCCAATCGATATCATG-3, R:5-GATCATCGTCATCTTCCG TA-3。 PCR反应体系为50l，包括下列成分：10反应缓冲液，5l；4dNTP混合物（每种2.5mM）， 4l；引物（上游），1l，引物（下游），1l；内部对照模板，1l；待测模板，1l；无菌去离子水，36.75l；Taq DNA 聚合酶，1l；反应条件：95预变性5min，1个循环，之后95 1 min，55 1 min，721 min。30个循环。最后72延伸5
24、min。结果分析：采用常规琼脂糖凝胶电泳，读胶仪检测。由于PCR技术有时会出现交叉污染和假阳性反应，应采取抗污染的PCR扩增方法，并对检测结果进行必要的PCR产物序列测定，以排除污染。【标本采集时注意事项】此操作规范应在生物安全二级实验室内进行。采集的标本不得用解剖的方式获取。所需的血液与组织标本，均应以穿刺方式取得。尽可能在抗生素治疗开始前采取标本。根据炭疽病例的不同型别酌情采集病灶标本。1、皮损部位标本的采集：皮肤炭疽水泡期时，注意无菌操作，以无菌棉签从未破溃水泡内沾取水泡液（水泡期内以革兰氏染色法较易发现炭疽杆菌）；在结痂期时，收集焦痂组织时需小心提起外层的焦痂组织，以无菌棉签取焦痂组织
25、转动棉签23 s，以保证有足够的标本。2、血培养：无菌条件下采集全血510ml。3、粪便：运送大便标本应注意放置在清洁、干燥，无菌和密闭的容器内，标本应大于5 g。对部分无法收集粪便标本的患者，可以肛试子插入肛门1英寸采取标本。4、痰培养：收集痰标本应大于1ml，应以无菌密封容器运送。无痰液者，应取培养基、打开平皿盖，将积液置于距离患者口鼻10cm处；令患者对平皿咳嗽，然后迅速盖上平皿。5、其他体液标本：胸腔积液或脑脊液等标本，按照规定的程序穿刺取得。6、尸体标本：患者死于炭疽时，可通过穿刺心脏获得血液或穿刺肝脏等实质脏器获得组织标本。【标本运输及储存】1、拭子：室温直接运输至实验室，如运输时
26、间超过1h，在28运输。2、粪便：1h内运输新鲜大便至实验室，如运输时间超过1h，在28运输。3、痰液：以无菌有盖的容器常温运送，如运输时间超过1h，在28运输。4、血培养标本：室温直接运输至实验室。【标本培养的操作】按标准操作程序进行。所有污染的和陈旧的标本，均应首先制成悬液。根据标本中含炭疽杆菌量的多少，可将悬液适当稀释，或经自然沉淀除去粗大沉淀物后，再以10000 g/min离心5min，取富集的沉淀物。将所得的悬液沸水浴加热15min后涂布平板。培养过程：适宜温度3537；环境气体：洁净空气或少量CO2。培养周期，至少培养3天，每日观察，在培养1824h内即可开始观察，少数炭疽杆菌在培
27、养8h后即生长。菌落特点：一般在SBA培养平板培养1524h，生长完好的菌落大约直径25mm。菌落呈平或不规则的突起，边缘略不规则，毛玻璃外观，菌落边缘有“逗号”形，显微镜下观察边缘呈明显 “狮头样”菌落。血平板上炭疽杆菌不溶血，过度生长的菌落有轻微溶血，但与溶血链球菌有明显区别。需对照观察在SBA和MAC培养基的生长，因炭疽杆菌在SBA培养基生长良好而在MAC培养基不生长。炭疽杆菌生长迅速，接种浓度高的局部，68h可以看到菌落生长，个别或可在1215h内看到菌落生长，利用这一特性，可以将炭疽杆菌与其它生长较慢的细菌进行区分。炭疽杆菌鉴定：含上述可疑菌落取出，划线接种于平板之上，在划线区内一处
28、滴1滴诊断用炭疽噬菌体，另一处贴一片青霉素纸片。37孵育824h后，在噬菌体处有透明噬菌斑，青霉素纸片周围有明显的抑菌环，便可判定接种物为炭疽杆菌。三、免疫学检查可依据血清学检验结果确定对患者的诊断。首份血清应在首次检视患者时采取，通常应一次采取血液标本供涂片镜检、细菌分离培养、血清学抗体检查及常规的血液检查使用。血清分离后置4保存，应在5天内完成检测。如超过5天，应放置于-20冰箱保存。恢复期血清应在发病后15天左右采取。恢复期血清应在发病后15日左右采取。（一）酶联免疫吸附试验（ELISA）采用酶联免疫吸附试验，检测患者血液内炭疽杆菌保护性抗原的抗体，试验方法如下。1、滴定板包被：所用各孔
29、加入炭疽杆菌保护性抗原（PA）液（0.3g/ml）100 l，酶标板贴上封口膜，置4过夜。次日，弃孔内溶液，每孔加洗涤缓冲液100 l，洗涤3次，每次3 min。洗涤缓冲液配方为： Tris 2.42 g 1 M HCl 13 ml Tween-20（0.05） 0.5 ml 加蒸馏水至 1000 ml 2、待检血清：样本的初筛：每孔加入100 l待测血清，按倍比稀释（稀释液为生理盐水）至18，置37 60 min。弃孔内溶液，每孔加洗涤缓冲液100 l，洗涤3次，每次3 min (同时做空白、正常血清对照) 。复判：每份阳性血清做双复孔检测其滴度，增加测定结果的可分析性。3、耦联酶标记：于各
30、反应孔中加入新鲜稀释的工作浓度的辣根过氧化物酶标记SPA 或抗人IgG100 l，酶标板贴上封口膜，置37 60 min。弃孔内溶液，每孔加洗涤缓冲液100 l，洗涤3次，每次3 min。4、显色：于各反应孔中加入等体积混合的显色底物A、B溶液100 l，酶标板贴上封口膜，置暗处20 min。于各反应孔中加入显色终止液（0.5 M H2SO4）100 l终止反应。底物A液（磷酸盐柠檬酸缓冲液，pH5.0）配方为：0.2 M Na2HPO4(28.4克L) 25.7 ml 0.1 M柠檬酸(19.2克L) 24.3 ml H2O2 0.1% 蒸馏水 50 ml 底物B液（TMB四甲基联苯胺使用液
31、）配方为： TMB 3.90 g 柠檬酸 10.52 g EDTA 1.86 g 甘油 2000 ml DMSO 300 ml 加热溶解后加蒸馏水至 10000 ml 5、结果判断：实验结果可用酶标仪判读，被检孔吸光度（A）值达阴性血清对照孔OD值的2.1倍时，可判断为阳性。注：技术说明 在从患者标本中未获得炭疽芽胞杆菌阳性和分离结果的情况下，可依据血清学检测结果，确定对患者的诊断。 目前多采用酶联免疫吸附试验（ELISA）进行炭疽特异性抗体检测，一般用捕捉法进行，即酶标板孔用适量炭疽毒素抗原包被，加入100L待检血清后，经洗涤加入工作浓度的辣根过氧化物酶标记的SPA或抗人IgG，再经洗涤后用酶标仪判读，被检孔A值高于阴性对照孔2.1倍时，可判断为阳性。 双份血清标本：患者首份血清应在首次检视患者时采取，通常应一次采取血液标本供涂片镜检，细菌分离培养，血清学抗体检查及常规的血液检查使用，血清分离后置4保存，待获得恢复期血清后，一同进行抗体检查。恢复期血清应在患者发病后15日左右采取。 试剂盒：应有国家有关机构颁发的应用许可证。诊 断一、流行病学资料在炭疽的诊断中占有重要地位，了解患者职业、工作和生活情况，如与食草动物密切接触的农、牧民及皮毛、皮革加工工人；在疫区生活或可能施放生物武器的环境中停留和接触的可疑物者。需要注意的是，流行病学调查可能无法发现接触史，
