1、体外核酸快速扩增技术的发展和不断创新体外核酸快速扩增技术的发展和不断创新China Biotechnology,2011,31( 3) : 91-中国生物工程杂志 96 体外核酸快速扩增技术的发展和不断创新 12 4 3 151 1吕蓓 程海荣严庆丰黄震巨李轶女 罗达 沈桂芳张志芳 1*2 1 程奇邓子新林 敏 ( 1 100083 2 中国农业科学院生物技术研究所 北京 上海交通大学生命科学技术学院 微生物代谢教育部重点实验室 上海 200240) ( 3 3151004 3100585 510275) 浙江泰晶生物科技有限公司 宁波 浙江大学生命科学院 杭州 中山大学生命科学院 广州 19
2、83 ( PCR) 摘要 利用聚合酶链式反应进行的核酸体外扩增是 年开始发展起来的一项革命性技 ,术目前已被广泛运用于现代化的农业和医学以及食品工业等领域特别是在人类认知基因和基因 ,。,组的过程中体外核酸扩增技术做出了卓越的贡献最初体外核酸扩增技术主要是利用耐高温的 DNA ( Taq ) ,。聚合酶酶这样就使核酸的体外扩增反应可以在热循环中进行但因需要使用昂贵的设 ,。,备和消耗大量的电力其成本和应用范围都受到一定的限制之后恒温体外核酸扩增悄然兴起这 ,。( RAA) 改变了传统扩增技术的局限性使核酸的体外扩增更加简单和方便重组酶介导扩增法是一 ,DNA 种最新型的恒温体外核酸扩增技术该系
3、统的显著优点在于它在常温下就能实现 解链并快速 ( 15 : 30min ) ,、,。扩增完成反应快速专一性好灵敏度高还可用于定时定量的结果分析 关键词 重组酶介导 核酸体外扩增 恒温Q784中图分类号 ,。人类几千年的文明史发展至今其 实 也 是 一 个 科 打开如今人类已经对地球上几乎所有生命的基因组 ,20 。,学技术发展的过程这在 世纪尤为突出其中生物 都开始着手分析至今有近万个全基因组序列覆盖了 30 ,、( 1) 。技术近 年的 发 展经 历了史无前例的飞跃现 代 生 微生物植物动物以及人类自身表 这就为将生 。物技术已经渗透到了人们衣食住行的每一环节对核 物技术彻底运用于现代化的
4、农业和医学以及食品工业 ,10 。,酸和蛋白质大 分 子 的 研 究从 发 现 到 认 识 和 利 用 的 过 年里全基因 等相关行业铺平了道路相信在未来 ,21 ,。程也是飞 速 惊 人甚至有时会远远超出人类的想象 组的资源将以 指 数 级 速 度 增 长预 计 到 世 纪 末一 1953 Watson Crick 。些全功能基因组分析也将完成 年美国人 和英国人 率先向世人展示 DNA ,了 双螺旋结构模型地球上生命之谜的大门从此 1 表 几大类基因组资源 Table 1 Genome Resources 基因组 资 源 Eukaryotic/ /www, ncbi, nlm, nih,
5、gov / genomes / leuks, cgi http: 真核生物类 Fungihttp: / /www, ncbi, nlm, nih, gov / genomes / leuks, cgi? p3 = 11: Fungi,taxgroup = 11: Fungi | 12: 真菌类 Insectshttp: / /www, ncbi, nlm, nih, gov / genomes / leuks, cgi? p3 = 12: Insects,taxgroup = 11: | 12: Insects 昆虫类 Mammalshttp: / /www, ncbi, nlm, nih,
6、gov / genomes / leuks, cgi? p3 = 12: Mammals,taxgroup = 11: | 12: Mammals 哺乳类 http: / /www, ncbi, nlm, nih, gov / genomes / MCROBES / microbial_taxtree, html IMicrobial微生物类 Viral Resources病毒资源 nfuenza rusIlVihttp: / /www, ncbi, nlm, nih, gov / genomes / FLU / FLU, html 流感病毒 Retroviruseshttp: / /www,
7、 ncbi, nlm, nih, gov / retroviruses / 逆转录酶病毒 Viral Genomeshttp: / /www, ncbi, nlm, nih, gov / genomes / GenomesHome, cgi? taxid = 10239 病毒基因组 ,Watson Crick 。蛋白质是生命活动的表达物质基 因 则 是 编 码 蛋 白质的特异的核苷酸序列继 和 第一次 DNA ,揭示了 的双螺旋结构之后许多科学家又发现了 2010-11-112011-01-04: : 收稿日期 修回日期 。1983 能专一识别核酸序列的各类酶而 在 年 人 类 第 * ,:
8、chengqi caa,s net, cn通讯作者电子信箱 DNA ,Korana 。PCR 一次能够在体外扩增 之后对核酸的操作和利用 地实现了 提出的核酸体外扩增的设想技 ,进入了一个革命性的阶段直到现在体外核酸扩增技 术无疑给分子生物学带来了革命它 使 扩 增 和 克 隆 基 。,DNA 、术仍在不断地改进和完善 因成为常规操作程序也为 指纹鉴定亲子和亲缘 关系的鉴定和那些遗传和病原菌引起的疾病的诊断成为 1核酸扩增技术的迅速发展 。20 PCR ,可能多年来技术在高效高保真方面都得到了 1, 1PCR T-PCR ( ) 、,R技术的出现 半 定 量 全面的发展 和 完 善后 来 还
9、出 现 了 20 60 70 Real-time PCR( 、-PCR qPCR ) 。世纪 年代末 年代初人们开始致力于研究定量跟踪免疫和 等 orana 1971 PCR ,K,DNA 于 年最早提出核酸 通过 技术特定序列的 分子可以实现指 基因的体外分离技术: ,“DNA ,体外扩增 的 设 想经 过 变 性与合适的引物数级别的扩增从原来的少量分子扩增 到 可 以 用 仪 器 ,DNA ,杂 交在 聚合酶的作用下将引物延伸并 不 断 重 检测的水平利用这一特点可以对一些 特 异 的 病 原 或 tRNA ”。,复 该过程便可克隆 基因这个设想在理论上疾病标志物进 行 诊 断现在已被广泛
10、应 用 于 疾 病 检 测 ,DNA ,。PCR 是完 全可以实现的首先高温可以使 双 链 打 开和诊断等各个领域常规的 技术由于热循环的需 ,PCR ,要使这一技术完全依赖于电源和昂贵的 仪器从 再 在 降温退 火的过程中使两端 的同源引物配对然 。DNA 。DNA 而限制了这一技术在实验室之外的应用由于上述缺 后 由 聚合酶延伸合成新生的链但 变 性 需 ,PCR 要 高 温而通常 情 况 下任何酶在高温下都会完全失点科学界一直在试图发展不需要使用 仪器的核 ,Korana ,去活 性因此 的创造性想法一直未能得以实酸扩增方法常温或恒温核酸扩增技术 的 发 展 成 为 一 。1983 Ka
11、ry Mullis ( PE-。,现直 到 年一 个 叫 的 美 国 人 个不可逆转的趋势 1, 2Cetus ) ,PCR 公 司人类遗传研究室在从著名的黄石公园度恒温 技术的兴起 ,PCR 假回来的 路上他的灵感忽然让他想到了一个能使双由于传统 始终受仪器设备和电力以及空间等DNA 。PCR 链 从 一个变成多个乃至大量拷贝的方法这个诸多因素的限制近年来恒温 技术已经开始悄然 ( 2) 。( polymerase chain reaction,10 ,方法就是聚 合酶链 式 反 应 兴起表 在过去 年中若干恒温核酸扩增技术,1,PCR) 。PCR Mullis ,SDA 、TMA 、HDA
12、 、反应的关键就在于 找到了可以在得到快速发展如 技术技术技术 ,2-9,DNA ( Taq DNA ) ,LAMP / RAA 。RPA 高温下不会变 性的 聚合酶聚合酶并技术和 技术等 2 表 几种恒温核酸扩增技术缩写列表 用这个酶完美 Table 2 The abbreviation of isothermal nucleic acid amplification methods 缩 写 名 称 中文名称 TMATranscrpton-medated ampfcatoniiiliii转录介导扩增法 NASBA Nucleic acid sequence-baseadm plificati
13、on核酸序列扩增法 SDA Strand idsplacement amplification链置换扩增法 HDA Helicase-dependent isothermal DNA amplification解旋酶恒温基因扩增法 LAMP Loop-mediated isothermal amplification环介导等温扩增法 RCA Rolling circle amplification滚环扩增法 Recombinase polymerase amplificationRPA 重组酶聚合酶扩增法 RAA Recombnase-ad ampfcaton iiliii重组酶介导扩增法 P
14、A / RAA ( 3) 。,LAMP R在这几种技术中技术和 技术是 相对比较成熟的技术表 3 表 几种恒温核酸扩增技术的性能比较 he function of dffeen sohema ncec acd ampfcaon mehods Tirtitrluliiliitit Table 3 TMASDAHDALAMPRCARPA / RAA +N / K-N / AN / K+超稳定性 N / K-N / AN / K+无需温控操作 ( min)2030-4030-60, 60, 25, 15速度 RNA+DNARNADNA / R NA模板 / +-+-+多重扩增反应 探针 +-+灵敏度
15、 / / - N / -+热 冷 可操作性 A -+模板复杂性 -+-+定量跟踪操作 : + : ; -: ; N / A: ; N / K: 注好不好无未。知 932011,31( 3) : 吕 蓓 等体外核酸快速扩增技术的发展和不断创新 LAMP 4 : 6 ,6 。技术需要使用 个引物在使用 个引 荧光蛋白的帮助该系统的显著优点在于它在常温下 ,20 : 30min 。LAMP :3 0min ) 。DNA ( 15 物的时候反应可以在 完成反应需 内完成 就能实现 解链并快速扩增 65? 。要在 下 进 行通过类似于滚环复制的链 替 换 反 RPA DNA PCR 所以 扩增 技术就免
16、去了使用贵重的 仪 ,。,。应可以生成一系列分子质量大小不同的扩增产物 器而且也不受样品槽孔多 少和空间的限制国 际 上 ,22-24,Bst DNA ,。 其优点在于只需要使用一个 聚合酶该酶可 已经有三个公司分别各有一个类似技术的专利RPA T4 ,SSB65? DNA ,技术主要利用一个 重组酶的活性在 以在 恒温的条件下使 在体外扩增且其反应 DNA ,和 重组酶 的 辅 助 下不进行核酸解链和退火即 组分可以在室温稳定地保存若干星期这 为 其 用 于 野 ,10,37? 。,。LAMP 可在 进行核酸的扩增由于重组酶的特性所 使 外诊断提供了便利反应的灵敏度高于传统 ,11-15,3
17、0bp。,PCR,PCR , 用的两个引物长度需大于 其 优 点 在 于反 应 可 的高温 与巢式 反应的灵敏度相似并,16-18,PCR ,且反应的结 果 特 异 可 靠还可以用于未纯化的样 以生成和 一致的单一条带可以直接测序或用于 ,19,。,LAMP 品通过使用 荧 光 染 料反应的结果可以直 ; ,PCR 连接到载体上引物设计简单除长度外和 引物设 。,LAMP 接用肉眼观测或使用荧光计进行定量当然技 ; ,37? ; 计一致反应温度低可以在 进 行 反 应反 应 速 度 , ,20 : 30min ; ,术也存在一些不可忽视的 缺 点首 先引 物 设 计 复 杂快在 即可完成利用荧
18、光标记的探针还可 。,; 需要使用特殊的软件其次引物个数多并且由于其 以实现实时定量的结果分析同 时 也 可 以 使 用 生 物 素 PCR ,LAMP 反应原理和 完 全 不同 反应得到的产物是 。,标记的引物配合胶体金试 纸条进行结果检测另 外 ,一系列大小不同的扩增片段无 法 直 接 进 行 测 序 和 克 ,在冻干粉保存 的 情 况 下其反应组分可 以 在 室 温 下 长 ,。,隆只能用于判断是否存在目的模板最后使用嵌入 。时间稳定保存其缺点在于虽然扩增结果和引物二聚 式的荧光染料进行定量扩增的时候不可避免有假阳性 ,体可以在凝胶电泳照片上得到清晰分辨然 而 可 能 的 。 的问题;
19、引物二聚体会造成较高的荧光或胶体 金 假 阳 性同 时 LAMP ,尽管 技术存在一些不足但在国际上该技 ,由于反应体系中蛋白质含量高扩 增 结 果 需 要 先 纯 化 术已被成 功 应 用 在 分子诊断和微生物病毒检测等领 。或进行酚抽提之后才能进行琼脂糖凝胶电泳 。,IS6110 域例 如根据结核菌的保守序列 设 计 的 RAA recA 技术采用的是来自于大肠杆菌 的 重 组 LAMP ,DNA 引物可在样品中检测到痕量的结核菌 片 ,recA DNA ,酶重组酶可 以 与 紧 密 结 合并 与 引 物 形 成 ,100%, 段结核菌检测的正确率 能 达 到 且 在 检 测 结 核 DN
20、A,聚合体扫描双链 在与引物同源的序列处使双链 ,LAMP PCR 菌的灵敏度方 面技 术 与 巢 式 的 灵 敏 度相 ,20,DNA 。SSB DNA ,解旋在 和 聚合酶的共同作用下新的 ,PCR 20 。同但比传统 技术的灵敏度高约 倍 DNA 。 片段可以在体外快速地扩增出 来这 个 体 外 LAMP , 目前国内 对 技术也已经有所应用如 上 海DNA ,37? :15 扩增的 过 程 不 需 要 高 温一 般 在 反 应 LAMP / HBV HIV 血液中心发展了用 技术进行血液筛查 ,25,30min PCR 。 即可得到与传统高温 相同的目的片段。等方法并申请了国家专利广州
21、华峰生物公司也申请 ,RAA ( 在国内技术已经申报了专利浙江泰晶生物 LAMP ,了一系列的 相 关 技 术 的 专 利用于食物中毒的 ) ,科技有限公司结合其他各种优秀技术可 以 使 底 物 ,、一系列相关病原的检测如李斯特菌沙门氏菌以及大 ,21,、,检测扩展到核酸蛋白质和糖类化合物并以此为基础 O: 157 。肠杆菌 等 ,开发出独一无二的系列快速诊断试剂 产 品扩 大 体 外 2RPA / RAA常温核酸扩增的创新技术 。RAA 核酸扩增的 应 用 范 围相 信 以 技术为基础的各 ,类核酸快速高 效 扩 增 产 品将 为 人 类 健 康 和 农 业 植 物 ,T4 最近使用的常温核
22、酸扩增技术以利用 噬菌体 ,病虫害的防治提供及时的诊断和防治以 其 优 势 取 代 DNA ,DNA 复制机理系统最为成功在 扩增技术方面这 PCR ,部分或补充 技术所拥有的市场并作为一种不断 ( recombnasei项 新的发明叫重 组酶聚合酶扩增法 完善的分 子 生 物 学 工具在研究和应用上发挥更大的 polymerase amplification,RPA) 。RPA ,在 系 统 中除 需 。作用 DNA ,T4 要一种常温下能工作的 聚合酶外还包含一个 3结 语 DNA ( snge-stranded DNA il重组酶 和 一 个 单 链 结 合 酶 binding,SSB)
23、 ,DNA 。以 及 另 一 个 辅 助 重 组 酶 的 蛋 白 PCR ,RAA 和传统的 技术相比核酸扩增技术无疑 。Real-time PCR , 是一个升级换代版本它的意义不仅是缩短了核酸扩如果效仿 利用简易的荧光仪还需一个,( PCR 。RAA 增的反应时间重要的是它摆脱了仪器装置的束缚图 仪 器 的 便 捷性 的市场机会技 术 不 依 赖 于 1) 。PCR 94? ,DNA 技术的原理是利用 高温使双链 解 能是革命性的技术突破能充分扩大核酸扩增技术的 ,DNA ( Taq ) 。,RAA ,旋并 在 耐 高 温 的 聚 合 酶 的 作 用 下 扩 增 应用领域此外技术还能完成多
24、重引物扩增配 DNA 。PCR ,RAA ,片段反应通常设定三个不同的温度使特异 合荧光仪可 形 成 一 套 多重荧光实时检测系统 DNA 。RAA ,性 片段得到 指 数 递 增技术则不需要通过 即利用不同颜色的荧光标记在 同 一 个 反 应 里 检 测 到 DNA , ,高温使双链 解 旋而是利用重组酶结合引物后不同的目的基 因这是其他恒温核酸扩 增 技 术 或 巢 式DNA,DNA PCR 。在引物识别位点侵入模板双链 在单链 结合 技术无法相比的特点,DNA , RAA 、,RAA 蛋白的帮助下以 及 在 适 当 的 聚合酶的作用下随着 技术的进一步深化完善在 技术 DNA ( 15
25、: 30min) 的基础上可以很快地研发出适合家庭使用的分子诊断 也使目的 片段在短时间内得到指数 。RAA ,级积 累在 反 应 体 系 中由于重组酶的作用不 试剂使全国乃至全球对病毒性和遗传 性 疾 病 的 定 期 DNA ,。需要高温即可在引物识别位点使模板 解旋从而 和快速普查在技术上成为可能这将是一个非常巨大 PCR ,。,省去了传统 反应中三个温度的循环节约了时间 的潜在市场其经济意义不 可 估 量结合其他优秀技 。,-RAA,并减少了能源的消耗 术如发展免疫可使检测对象从核酸扩大到蛋白 、。,RAA 质糖类或其他大分子化合物同时技术也可作 ,为一种基础的 研 究 手 段进一步促进
26、分 子 生 物 学 的 研 。RAA 究技术极有可能帮助功能基因组学和植物分子 ,生物学获得突 破 性 进 展进而形成更加 巨 大 的 生 物 科。技产业核酸扩增新技术的出现将带动与之相关的仪器设 、,备配套试剂等新产业的发展甚至会影响到人们的日 。,常生活在物联网飞速发展 的 今 天基于先进技术的 核酸体外分子检测可以帮助人们足不出户即可完成某 ,些疾病的检测和诊断特别是行动不便的患者或需要 1 PCR RAA 图 和 技术的原理对比图 。隔离的传染性疾病疑似患者将从中获益在我国发展 Fig, 1 The comparative flowchart of PCR and RAA techni
27、ques : ,恒温核酸体外扩增新技术的意义在于第一可以继续 ; ,处于世界领先的位置第二满足我们国家节能减排的 由于恒温核酸扩增技术只需要一个小型的恒温装 ; ,。发展战略的需要第三服务于更多的人民群众随着 ,置就可以进行核酸的指数扩增这 使 得 发 展 一 种 利 用 21 ,世纪科学技术的进步和国家的逐步重视特 别 在 国 LED 锂电池和紫外 的便携式的小型核酸扩增仪以及相 “”,家十二五期间对相关领域的高度重视核酸 体 。,关的检测装 置 成 为 可 能利 用 这 一 技 术可 以 在 非 外 扩 增技术及其相关产业将会迎来一个快速发展的时参考文献 。实 验室的环境 下进行快速核酸扩
28、增检测发 展 这 一 。期 技 ,1 , Gill P, Ghaemi A, Nucleic acid isothermal amplification technologies: a review, Nucleosides, nucleotides , n ucleic ,( 术对于我国目前形势严峻的传染性疾病检测如甲型acids,2008,27: 224-243, HNSARS ,) 流感甚 至 是 等 传 染 性 疾 病 具 有 重 大 1 1 ,2 , Guatelli J C,Whitfield K M,Kwoh D Y,et al, sothermal,n Ii。的 意义 vtro
29、 ampfcaton of nucec acds by a mutenzyme reacton iliiiliiliiRAA 技术的优势使其有望在很大程度上代替传统modeled after retroviral replication, Proceedings of the N ational PCR 。PCR 的 技术由 于 传 统的 技 术 受 仪 器 和 空 间的 限Academy oSfc iences of theU nited States oAfm erica,1990,87: ,制使得现有核酸扩增技术的应用价 值 没 有 被 充 分 挖1874-1878, 。PCR ,掘出来
30、例如目前仅肝炎检测一个项目试剂 的,3 , ComptonJ ,Nucleic acid sequence-baseadm plification, Nature, 1, 5 ,国内市场容 量 就 达 亿 元因 为受到检测费用的 限1991,350: 91?C92, ,4 , Walker G T,Little M C,Nadeau J ,Get al, Isothermal in vitro ,PCR 30% 。制检测还只占整个肝炎检测 市 场的 如 果 RAA ,技术能充分克服费用昂贵的限制将会有更大 952011,31( 3) : 吕 蓓 等体外核酸快速扩增技术的发展和不断创新 ampl
31、ification of DN A by a restriction enzyme / DNA polymeraseSensitive and rapid detection of i nfection by loop-mediatedsystem, Proceedings of theN ational Academy oSfc iences of the isothermal amplification ( LAMP ) method, Experimental United States oAfm erica,1992a,89: 392-396, parasitology,2009,12
32、2( 1) : 47-50, ,5 , Walker G T,Fraiser M S,Schram J, Let al, Strand idsplacement ,16, ono T,Savan R , Saka M, et a, Detecton of whte spot Kiliiamplification-an isothermal, in vitro DNA amplification syndrome virus in shrimp by loop-mediated isothermal technique, Nucleic acids research,1992b,20,1691-1696, amplification, Journal of virological methods,2004,115: 59-65, ,6 , Vincent M,Xu Y,Kon
