1、P123PPIDNA纳米粒性质表征和体外转染效率研究P123-PPI/DNA纳米粒性质表征和体外转染效率研究郝俊国，沙先谊，蒋晔，方晓玲*（复旦大学药学院药剂教研室，上海200032）摘要 目的 研究开发一种高效、安全的非病毒基因给药载体系统；方法 合成P123修饰的聚丙烯亚胺（polypropyleneimine，PPI）树状高分子，对P123-PPI/P123压缩DNA形成的纳米粒的粒径和电位进行表征，以琼脂糖凝胶电泳实验考察纳米粒抵抗血清和肝素钠降解的作用和纳米粒保护质粒DNA不受DNaseI降解的作用，以绿色荧光蛋白基因质粒作为报告基因，考察P123-PPI/P123载体材料的体外转染
2、效率；结果 P123-PPI/P123压缩DNA形成的纳米粒的粒径在100nm左右，电位约15mV，纳米粒能够抵抗血清和一定浓度肝素钠的解离作用，P123-PPI/P123具有较高的体外转染效率，显著高于PPI本身；结论 P123修饰PPI具有较高的体外转染效率，有可能开发成一种具有较高体内转染效率的载体系统。关键词：基因治疗；Pluronic P123；聚丙烯亚胺树状告分子中图分类号： 文献标识码： 文章编号：Characterization of Nanoparticles Formed with P123-PPI and Plasmid DNA and Study on Its in v
3、itro Transfection EfficiencyHAO Jun-guo, SHA Xian-yi, JIANG Ye, FANG Xiao-ling*（Division of Pharmaceutics, Schoolof Pharmacy, Fudan University, Shanghai 200032, China）Abstract: OBJECRIVE to research and develop a non-virus gene delivery system with high efficiency and safety; METHODS the third gener
4、ation of polypropyleneimine(PPI) dendrimer modified with Pluronic P123 was synthesized by covalent linking, the size and potential of nanoparticles formed by plasmid condensing with P123-PPI/P123 were characterized, the ability of anti-dissociation to serum and sodium heparin was investigated with a
5、garose gel electrophoresis, DNaseI protection assay was carried out to check whether the nanoparticles can protect plasmid DNA from nuclease digestion or not. the in vitro transfection efficiency was inspected with the reporter plasmid the enhanced green fluorescense plasmid (pEGFP-N2); RESULTS the
6、nanoparticles formed by plasmid condensing with P123-PPI/P123 sized about 100 nanometers and its potential was around 15 millivolts ; CONCLUSION As a non-virus delivery vector, the third generation of PPI dendrimer modified with Pluronic P123 possessed a high in vitro transfection efficiency and may
7、 be developed into a effective in vivo transfection vector. Key Words: gene therapy; Pluronic P123; polypropyleneimine dendrimer基金项目：国家重大基础研究项目973项目（2007CB935800）作者简介：郝俊国，男，复旦大学药物制剂专业在读博士研究生通讯作者：方晓玲，女，教授，博士生导师， Tel：（021）-54237432 E-mail：xlfang1215基因治疗中病毒载体具有转染效率高的优点，但安全性限制了其应用；非病毒载体具有较高的安全性、装载能力强、易于
8、制备等优点，其缺点是表达效率较低，表达时间短。非病毒载体包括阳离子脂质载体导入系统(Lipoplexes)和阳离子聚合物载体导入系统(Polyplexes)两大类。阳离子脂质载体不能用于全身性体内的转染，因为其所携带的正电荷会和携负电荷的血浆蛋白，如脂蛋白和免疫球蛋白相互作用，导致脂质体-DNA复合物的解体或者大的聚集体的形成，并最终导致转染效率的降低12。阳离子聚合物载体系统的载体材料包括聚乙烯亚胺（Polyethylenimine，PEI）、聚赖氨酸（Poly(L-lysine)，PLL）、聚-氨基酯（poly(-amino ester)）、壳聚糖、阳离子树状高分子聚酰胺-胺（PAMAM）
9、和聚丙烯亚胺（PPI）等。其中，树状高分子(Dendrimers)高度分支，具有单分散性和完全均一性，结构规则，高度对称；在代数较高时为球状结构，分子内部具有大量的空腔，分子表面有大量的官能团。分子内部的空腔可容纳小分子药物，表面的官能基团则便于进一步修饰3。树状高分子作为非病毒基因递送载体有其独特的优点：纳米尺寸的粒径可以模拟细胞器大小而利于其携带治疗基因进入细胞核内；强烈的质子海绵效应利于从溶酶体中逃离而免受降解。PAMAM阳离子树状高分子得到了广泛了研究。Bernd H. Zinselmeyer对1-5代PPI在A431细胞系上的转染试验显示低代数的PPI（G2和G3）具有较高的转染效率
10、，效率和阳离子脂质载体DOTAP的转染效率相当，高代数的PPI（G4和G5）因具有较大的细胞毒作用而不能单独用于转染4。PPI分子表面的氨基通过碘甲烷季铵盐化以后，不仅降低了细胞毒性，而且提高了体内外的转染效率；体内试验显示，PPI作为基因载体，治疗基因表达的主要器官是肝脏，而不是阳离子脂质载体作为载体时所表达的肺脏5。本课题拟选用G3代的PPI作为非病毒基因给药载体的一部分，因为G3代PPI表面有16个氨基，相对于第一和第二代的PPI，具有较强的压缩DNA的能力，另一方面毒性较小。PEI、PAMAM等载体材料在细胞水平上显示了较高的转染效率，但是该类聚合物载体系统的粒径和分散稳定性对缓冲盐体
11、系和血清都非常敏感，导致应用于体内时毒性大、转染效率低、药代动力学和生物分布不佳。原因是溶解性差，在体内聚集，如沉积于肺毛细血管床，则导致严重的肺栓塞6。鉴于此，人们以PEG修饰阳离子聚合物，在和DNA相互作用时，形成实际上不带电的亲水粒子，其包含由阳离子聚合物与DNA链中和形成的内核及非离子亲水链组成的外壳，这种系统对短DNA寡核苷酸链的体内外递送均显示了很大的潜力，但是，当用于递送质粒时，递送效率显著降低。质粒与阳离子共聚物形成的复合物粒径显著大于寡核苷酸与阳离子共聚物形成的复合物粒径，这些复合物与细胞膜的相互作用因复合物的非离子表面而降低6。该缺陷严重限制了阳离子聚合物载体系统应用于体内
12、。Pluronic在非病毒载体应用方面包括两个方面，一方面是和裸DNA一起应用，注射到骨骼肌、心肌和肿瘤等组织中，能够增强转基因在这些组织中的表达强度和持续时间7。另一方面是作为聚阳离子载体系统的一部分，增强该系统的转染效率。质粒DNA与PEVP形成复合物后，与1（wt）的P85溶液一起于无血清条件下转染细胞，细胞对载体的摄取和转染效率均明显提高。原因可能是P85促进了细胞对复合物的摄取或者帮助进入内酶体中的复合物进入细胞质中而免被降解9。Kuo考察了Pluronic对血清存在条件下质粒-PEI复合物转染效率的影响，结果显示Pluronic能够阻止复合物受血清影响而导致的降解，显著提高其转染效
13、率，而且对转染效率提高的能力随Pluronic HLB值的增加而降低，即：F68F127P105P94L122L61，作者认为原因是嵌段共聚物胶束结合到质粒-PEI复合物颗粒上，其亲水性的PEO嵌段对复合物颗粒起到了稳定化作用，阻止因血清而导致的颗粒聚集10。本文拟以Pluronic修饰PPI，发挥二者各自在非病毒基因递送载体系统中的优点，即PPI能够压缩、包裹质粒DNA，Pluronic则能够发挥几方面的优点：(I) 降低PPI的细胞毒性；（II）能够增大细胞膜的通透性，有利于载体系统进入到细胞内；（III）稳定载体系统，使载体系统免受血清中酶的降解或阻止载体系统与血清中成分的相互作用而不被
14、很快清除。1. 材料和仪器普朗尼克P123 （BASF）； 第三代PPI树状高分子（SyMO-Chem ，Eindhoven公司, 荷兰)；N,N-羰基二咪唑（CDI，上海延长生化公司）；DMEM高糖培养液和LipofectamineTM 2000 （Invitrogen）；胎牛血清（Hyclone）；SPC-A1和CHO 细胞（中科院细胞库）；DNase I（Worthington公司）；肝素钠（常州千红生化制药有限公司）。稳流稳压电泳仪EPS100型（上海天能科技有限公司）；NICOMPTMZLS380激光粒径和zeta电位测定仪（美国PSS公司）；流式细胞仪（BD公司）。2. 方 法2.
15、1 P123-PPI合成 首先利用羟基活化剂CDI对活化P123的单端羟基11。将0.5mmol 的P123于50真空烘箱干燥过夜后溶解于50ml无水乙腈中；同时将0.5mmol CDI溶解于25ml无水乙腈中，搅拌条件下将CDI溶液滴加到充满N2的P123溶液中，40条件下搅拌反应4hr。反应结束后加入75ml纯水，以截留分子量为3500Da的透析袋，透析介质20%乙醇进行透析，除去未反应的CDI小分子。 合成的第二阶段是活化P123和PPI的接枝。将210mg PPI（0.125mmol）溶解于20ml 纯水中，搅拌条件下逐滴加入单端活化的P123溶液，室温下反应48hr。反应结束后，以截
16、留3500Da 的透析袋透析数次除去未反应的PPI分子，然后过弱阳离子交换树脂柱CM-650M 树脂柱(TosoH) 除去未接枝的P123。合并含有P123-PPI的部分，以纯水透析数次后通过超滤管进行浓缩，最后冻干。 3.2 P123-PPI表征 P123-PPI接枝物 中P123和PPI的相对比例通过1H-NMR中P123 和PPI 中各自氢对应的积分面积进行推算。同时，接枝物中的总氮含量通过微量元素分析进行确定。2.3 体外转染P123-PPI/DNA复合物的制备 以N/P比20和游离P123的质量是P123-PPI质量的3倍为例来说明复合物的制备方法。于0.5ml 离心管中加入100g
17、/ml的质粒20l和35.7l纯水及50mg/ml P123溶液3.6l，混匀；于另一0.5ml 离心管中加入2.5mg/ml P123-PPI溶液24l和50l纯水，混匀。将复合物溶液一次性加入质粒溶液中，快速涡旋20s，于室温条件下孵育20min。2.4 复合物粒径和电位测定 复合物的有效流体动力学直径和电位通过NICOMPTMZLS380激光粒径和zeta电位测定仪（美国PSS公司）进行测定。复合物的制备同转染用复合物的制备。2.5 细胞培养和转染 SPC-A1和CHO细胞均以含10FBS（V/V）的DMEM高糖培养液（不含双抗）进行培养。转染前一天，消化细胞，计数，以2105个/ml/
18、孔均匀接种到24孔板中，第二天当细胞融合度达80-90时，开始转染操作，吸弃旧的培养液，每孔加入0.45ml新鲜的培养液，然后加入50l复合物溶液（含质粒0.75g），每种处方做两个或者三个复孔。轻轻摇动24孔板使复合物均匀分布于孔中。培养4hr后，吸弃含复合物的培养液，换上完全细胞培养液，继续培养48hr；以阳离子脂质体LipofectamineTM2000作为阳性对照。2.6 酶保护分析实验12制备好复合物以后，取10l（含质粒DNA 250ng），加入1U DNase I（1U/2l），于37水浴孵育15min，孵育结束后，加入2l 250mM EDTA溶液，室温下孵育10min以灭活D
19、Nase I。加入3.33l 15mg/ml肝素钠溶液，在室温下孵育2hr以让复合物完全解离。加入1.9l 10上样缓冲液，混匀后进行0.7琼脂糖凝胶电泳。2.7 血清和肝素钠抵抗实验制备好复合物以后，取10l（含质粒DNA 250ng），加入一定体积的胎牛血清（FBS），于37水浴孵育60min，加入上样缓冲液，混匀后进行0.7琼脂糖凝胶电泳。制备好复合物以后，取10l（含质粒DNA 250ng），加入1.5l肝素钠溶液，于37水浴孵育15min，孵育结束后，马上加入2l 10上样缓冲液，混匀后进行0.7琼脂糖凝胶电泳。2.8 流式细胞仪分析 转染48小时后，以胰酶消化细胞，合并复孔中的细胞
20、，重悬于PBS中，上机测试。计数10,000个细胞，得到表达GFP的阳性细胞的百分率，以裸DNA转染作为阴性对照，LipofectamineTM 2000转染作为阳性对照。3. 结果3.1 P123-PPI表征根据P123和PPI中对应的H的积分面积，计算出每个PPI分子上接了2.5个P123分子（图1）；微量元素分析显示P123-PPI中N元素的含量为2.64%，由N元素含量计算得到每个PPI分子上接了2.5个P123分子，两种方法计算得到的结果一致，说明分离、纯化是成功的。3.2 复合物粒径和电位N/P为5时，两种载体材料与DNA形成的复合物的粒径相差较大，N/P10和20时两种载体材料与
21、DNA形成的复合物的粒径则接近，均在100nm左右（图2）。N/P比20时，添加游离P123，游离P123的质量与P123-PPI的质量比分别为1、3、9和18，所得复合物的粒径分布皆为尼康分布，电位则随着P123的量的增加而减小，当质量在1-9倍时，电位变化较小，当质量在18倍时，电位则显著降低（表1）。3.3 酶保护分析当N/P比大于等于5时，P123-g-PPI能够保护质粒DNA不被DNase I降解为单核苷酸，但是超螺旋的质粒被切刻为线性质粒；当N/P比小于5时，复合物中的质粒DNA明显被降解为单核苷酸（图3）。3.4 血清和肝素钠抵抗实验复合物的电泳行为不受血清的影响，即使血清浓度达
22、到50%时仍不能够将质粒从复合物中解离出来，即载体材料能够保护质粒DNA不受血清的解离作用（图4）。 肝素钠对复合物的解离作用对于浓度很敏感，当肝素钠的浓度大于108g/ml时，即可将N/P 10的复合物完全解离；小于75g/ml时，则基本无解离作用。添加游离P123以后，对复合物的抗解离作用并无显著增强作用，结果见图5。3.5 体外转染效率 PPI本身几乎对SPC-A1细胞无任何转染，添加P123后PPI的绝对转染效率仍不高，但相对转染效率提高了10倍左右；P123-PPI有较高的转染效率，在非血清存在条件下转染时，游离P123的添加不改变P123-PPI的转染效率（图6A）。随着N/P比的
23、增加，P123-PPI的转染效率逐步提高，N/P 20时达到平台状态。当N/P比低于20时，血清的加入明显降低转染效率；当N/P比高于20时，血清的加入对转染效率影响不明显（图6B）。典型的N/P比10时P123-PPI与PPI在非血清存在条件下的转染效率比较的荧光显微镜图谱见图7。无论N/P比是10还是20，无血清条件下转染时，P123的加入均降低了转染效率，而P123加入的量与降低程度无相关性（图8）；在血清存在条件下转染时，P123的加入均显著提高转染效率，当P123的量在1倍和3倍质量比时，提高程度最明显，当P123的量在9倍和18倍质量比时，对转染效率的提高程度有所降低（图8）。4.
24、 讨论本文研究了普朗尼克P123修饰PPI后作为非病毒基因载体的合成、表征和体外转染效率。该思路是基于PEG等亲水性高分子修饰阳离子聚合物而来的，PEG修饰虽然能大大提高载体系统的稳定性，但同时又有严重的缺陷13。 P123属于一类聚合物表面活性剂，能够和生物膜相互作用，增加生物活性物质向细胞内的转运14。因此，将P123与PPI接枝在一起，以提高复合物与细胞膜的相互作用。在血清存在与否的条件下，游离P123的加入对复合物转染效率的影响不同。当于无血清介质中转染时，游离P123不提高甚至降低复合物的转染效率，可能原因是P123的加入一定程度上屏蔽了P123-PPI/DNA复合物的正电性，或者即
25、使对P123-PPI/DNA复合物的正电性无影响，P123结合于P123-PPI/DNA复合物的表面，形成空间位阻，不P123-PPI/DNA复合物与细胞膜的结合、内吞，进而导致质粒DNA的摄取减少，转染效率下降；当于含血清介质中转染时，游离P123显著提高复合物的转染效率，且对转染效率的提高程度与所加P123的量显著相关，分析原因是：血清中含有大量的白蛋白，白蛋白在生理条件下呈负电性，可以和正电性的复合物相互之间静电作用形成大的聚集体，细胞对这些聚集体的一次摄取，相当于一次摄取了很多个纳米粒，故有利于转染效率的提高；另一方面，P123增大细胞膜的流动性，有利于细胞对外源物质的摄取。P123的
26、CMC值是0.04，从理论上讲，当体系中P123的浓度恰好是0.04%时，P123能最大程度地增大细胞膜的流动性。在我们的制备体系中，1倍和3倍P123量时体系中的P123浓度分别是0.045和0.135，相当于CMC值或稍高于CMC值，故能最大程度地增加细胞膜的流动性，促进基因的转染。P123-PPI压缩、包裹质粒DNA后，能够保护质粒不受血清的解离或血清中酶的降解作用，同时，也能抵抗一定浓度肝素钠的解离作用，这些证据显示应用于体内转染时，P123-PPI/DNA复合物可能抵抗血清的解离作用，在血液循环系统中有较高的稳定性。酶保护分析实验中，当N/P大于5时，P123-PPI能够保护质粒DN
27、A不被核酸酶降解为单核苷酸，但是超螺旋的质粒被切刻为线性质粒，从理论上讲，这对该载体系统是不利的，但是由于体外实验该载体系统已经显示了较高的转染效率，同时，酶保护分析的体外实验并无法完全模拟体内的酶环境，所以载体系统的体内转染效率如何需要体内实验的直接验证。参考文献1 Pedroso de Lima MC, Neves S, Filipe A, et al. Cationic Liposomes for Gene Delivery. From Biophysics to Biological Applications J. Curr Med Chem, 2003,10(14): 1221-12
28、31. 2 Simes, Srgio; Filipe, Ana; Faneca, Henrique, et al. Cationic liposomes for gene delivery J. Expert Opin Drug Deliv, 2005, 2(2): 237-254.3 Grayson SM, Frchet JM. Convergent dendrons and dendrimers: from synthesis to applications J. Chem Rev, 2001, 101(12):3819-68.4 Bernd H, Zinselmeyer, Simon P
29、, et al. The Lower-Generation Polypropylenimine Dendrimers Are Effective Gene-Transfer Agents J. Pharm Res, 2002, 19(7): 960-967.5 Andreas G. Schatzleina, Bernd H. Zinselmeye. Preferential liver gene expression with polypropylenimine dendrimers J. J Controlled Release, 2005, 101: 247-258. 6 Bronich,
30、 T. K., Kabanov, A. V., and Marky, L. A. A thermodynamic characterization of the interaction of a cationic copolymer with DNA J. J Phys Chem, 2001, 105, 6042-6050.7 Braun, S., Thioudellet, C., Rodriguez, P., et al. Immune rejection of human dystrophin following intramuscular injections of naked DNA
31、in mdx mice J. Gene Ther, 2000, 7: 1447-1457.8 Lemieux, P., Guerin, N., Paradis, G., et al. A combination of poloxamers increases gene expression of plasmid DNA in skeletal muscle J. Gene Ther, 2000, 7, 986-991.9 Astafieva, I., Maksimova, I., Lukanidin, E., et al. Enhancement of the polycation-media
32、ted DNA uptake and cell transfection with Pluronic P85 block copolymer J. FEBS Lett, 1996, 389: 278-280.10 Kuo, J. H. Effect of Pluronic-block copolymers on the reduction of serum-mediated inhibition of gene transfer of polyethyleneimine-DNA complexes J. Biotechnol Appl Biochem, 2003, 37:267-271.11 Serguei V. Vinogradov, Elena V. Batrakova, Shu Li, et al. Mixed Polymer Micelles of Amphiphilic and Cationic Co
