1、分子标记辅助选择育种 分子标记辅助选择育种传统的育种主要依赖于植株的表现型选择(Phenotypiealselection)。环境条件、基因间互作、基因型与环境互作等多种因素会影响表型选择效率。例如抗病性的鉴定就受发病的条件、植株生理状况、评价标准等影响；品质、产量等数量性状的选择、鉴定工作更困难。一个优良品种的培育往往需花费78年甚至十几年时间。如何提高选择效率，是育种工作的关键。育种家在长期的育种实践中不断探索运用遗传标记来提高育种的选择效率与育种预见性。遗传标记包括形态学标记、细胞学标记、生化标记与分子标记。棉花的芽黄、番茄的叶型、抗TMV的矮黄标记、水稻的紫色叶鞘等形态性状标记，在育种
2、工作中曾得到一定的应用。以非整倍体、缺失、倒位、易位等染色体数目、结构变异为基础的细胞学标记，在小麦等作物的基因定位、连锁图谱构建、染色体工程以及外缘基因鉴定中起到重要的作用，但许多作物难以获得这类标记。生化标记主要是利用基因的表达产物如同工酶与贮藏蛋白，在一定程度上反映基因型差异。它们在小麦、玉米等作物遗传育种中得到应用。但是它们多态性低，且受植株发育阶段与环境条件及温度、电泳条件等影响，难以满足遗传育种工作需要。以DNA多态性为基础的分子标记，目前已在作物遗传图谱构建、重要农艺性状基因的标记定位、种质资源的遗传多样性分析与品种指纹图谱及纯度鉴定等方面得到广泛应用，尤其是分子标记辅助选择(m
3、olecular marker-assistedselection，MAS)育种更受到人们的重视。第一节 分子标记的类型和作用原理一、分子标记的类型和特点按技术特性，分子标记可分为三大类。第一类是以分子杂交为基础的DNA标记技术，主要有限制性片段长度多态性标记(Restriction fragment lengthpolymorphisms，RFLP标记)；第二类是以聚合酶链式反应(Polymerasechain reaction，PCR反应)为基础的各种DNA指纹技术。PCR是Mullis等(1985)首创的在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的体外酶促反应
4、，合成特异DNA片段的一种方法。PCR技术的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合。PCR反应分变性(denaturation)、复性(annealling)、延伸(extension)三步(图171)。变性指的是通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA的过程；复性(又称退火)是指当温度降低时，单链DNA回复形成双链的过程，由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA大大高于模板DNA，容易使引物和其互补的模板在局部形成杂交链；延伸是指在DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷三磷酸底物及Mg2+存在的条件下，在聚合酶催化下进行以引物为起始点的5-3的DNA链延伸。以上三步
5、为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，经2530个循环后，介于两个引物之间的特异DNA片段得到大量的复制，数量可达2106-7拷贝。按照PCR所需引物类型又可分为：单引物PCR标记，其多态性来源于单个随机引物作用下扩增产物长度或序列的变异，包括随机扩增多态性DNA标记(Random别amplification polymorphism DNA，RAPD)、简单重复序列中间区域标记(1nter-simple sequence repeatspolymorphisms，ISSR)等技术；双引物选择性扩增的PCR标记，主要通过引物3端碱基的变化获得多态性，这种标记主要指扩增片段长度多态
6、性标记(Amplified fragment lengthpolymorphisms，AFLP)；需要通过克隆、测序来构建特殊双引物的PCR标记如简单序列重复标记(Simple sequence repeats，SSR)、序列特征化扩增区域(Segion，简称SCAR技术)和序标位(Sequencetagged sites，简称STS)等。第三类是一些新型的分子标记，如单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)，由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基的转换、颠换以及单碱基的插入缺失等。表达序列标签(Expressed seque
7、nces tags，EST)是在cDNA文库中随机挑选克隆，并进行单边测序(Singlepasssequence)而产生的300500bp的核苷酸片段。应用于分子标记辅助育种的标记主要有RFLP、RAPD、SSR、AFLP、STS等。它们的遗传、表现特点总结于表171。分子标记是以DNA多态性为基础，因而具有以下优点：表现稳定，多态性直接以DNA形式表现，无组织器官、发育时期特异性，不受环境条件、基因互作影响；数量多，理论上遍及整个基因组；多态性高，自然界存在许多等位变异，无需专门人为创造特殊遗传材料，这为大量重要性状基因紧密连锁的标记筛选创造了条件；对目标性状表达无不良影响，与不良性状无必然
8、连锁；部分标记遗传方式为共显性，可鉴别纯合体与杂合体；成本不是太高，一般实验室均可进行。对于特定探针或引物可引进或根据发表的特定序列自行合成。二、分子标记的原理和遗传特性(一)RFLP发现最早，目前应用最为广泛的一种分子标记。这一类标记在20世纪70年代已被发现。1980年，人类首先将其用于构建连锁图。目前，该技术已广泛用于动植物连锁图的构建、重要农艺性状基因的分子标记等。1RFLP标记的原理植物基因组DNA上的碱基替换、插人、缺失或重复等，造成某种限制性内切酶(restriction enzymes，简称RE)酶切位点的增加或丧失是产生限制性片段长度多态性的原因。对每一个DNARE组合而言，
9、所产生的片段是特异性的，它可作为某一DNA所特有的“指纹”。某一生物基因组DNA经限制性内切酶消化后，能产生数百万条DNA片段，通过琼脂糖电泳可将这些片段按大小顺序分离，然后将它们按原来的顺序和位置转移至易于操作的尼龙膜或硝酸纤维素膜上，用放射性同位素(如32P)或非放射性物质(如生物素、地高辛等)标记的DNA作为探针，与膜上的DNA进行杂交(即Southern杂交)，若某一位置上的DNA酶切片段与探针序列相似，或者说同源程度较高，则标记好的探针就结合在这个位置上。放射自显影或酶学检测后，即可显示出不同材料对该探针的限制性片段多态性情况(图172)。对于线粒体和叶绿体等相对较小的DNA分子，通
10、过合适的限制性内切酶酶切，电泳分析后有可能直接检测出DNA片段的差异，就不需Southern杂交。RFLP分析的探针，必须是单拷贝或寡拷贝的，否则，杂交结果不能显示清晰可辨的带型，表现为弥散状，不易进行观察分析。RFLP探针主要有三种来源，即cDNA克隆、植物基因组克隆(Random Genome克隆，简称RG克隆)和PCR克隆。2RFLP标记的特点RFLP标记具有共显性的特点。共显性(co-dominant)标记指的是双亲的两个以上分子量不同的多态性片段均在F，中表现。它已被广泛用于多种生物的遗传分析，特别是构建植物遗传图谱。RFLP标记所需DNA量大(515鹏)，检测步骤繁琐，需要的仪器、
11、设备较多，周期长，检测少数几个探针时成本较高，用作探针的DNA克隆其制备与存放较麻烦；检测中要利用放射性同位素(通常为少)，易造成污染。尽管非放射性物质标记方法可用，但价格高，杂交信号相对较弱，灵敏度也较同位素标记低。目前，RFLP标记直接用于育种成本高，人们正致力于将RFLP标记转化为PCR标记，便于育种上利用。(二)RAPD标记1RAPD标记的原理Williams等(1990)以DNA聚合酶链式反应为基础而提出的。所谓RAPD标记是用随机排列的寡聚脱氧核苷酸单链引物(长度为10个核苷酸)通过PCR扩增染色体组中的DNA所获得的长度不同的多态性DNA片段。RAPD标记的原理同PCR技术，但又
12、有别于常规的PCR反应。主要表现在以下3个方面：引物。常规的PCR反应所用的是一对引物，长度通常为20bp(碱基对)左右；RAPD所用的引物为一个，长度仅10bp。反应条件。常规的PCR复性温度较高，一般为5560，而RAPD的复性温度仅为36左右。扩增产物。常规PCR产物为特异扩增，而RAPD产物为随机扩增。这样，RAPD反应在最初反应周期中，由于短的随机单引物，低的退火温度，一方面保证了核苷酸引物与模板的稳定配对，另一方面因引物中碱基的随机排列而又允许适当的错配，从而扩大引物在基因组DNA中配对的随机性，提高了基因组DNA分析的效率。原理上与RAPD相似的还有APPCR(Arbitrari
13、ly primedpolymeraechain reaction)。APPCR指在PCR反应中使用的引物长度与一般PCR反应中的引物相当，但在反应开始阶段退火温度较低，允许大量错配，因此可引发随机的扩增。一般在APPCR反应中应用放射性标记，其产物在聚丙烯酰胺凝胶上分离，然后通过放射自显影，检测其多态性。2RAPD标记的特点如果基因组在特定引物结合区域发生DNA片段插人、缺失或碱基突变，就可能导致特定引物结合位点分布发生相应变化，导致PCR产物增加、缺少或分子量大小的变化。若PCR产物增加或缺少，则产生显性的RAPD标记；若PCR产物发生分子量变化则产生共显性的RAPD标记，通过电泳分析即可检
14、测出基因组DNA在这些区域的多态性。RAPD标记一般表现为显性遗传，极少数表现为共显性遗传。显性标记指的是F1的多态性片段与亲本之一完全一样，这样在杂交组合后代中扩增产物的记录可记为“有无”，即把每一随机扩增多态性片段作为分子图谱的一个位点。RAPD引物长一般为10个碱基，人工合成成本低，一套引物可用于不同作物，建立一套不同作物标准指纹图谱。RAPD可以方便用于种质资源指纹档案建立，种内遗传多样性分析和品种纯度鉴定。因此RAPD也是一种潜力很大的分子标记。由于使用DNA扩增仪，操作自动化程度高，分析量大，且免去了RFLP中的探针制备、同位素标记、Southern印迹等步骤，分析速度很快。RAP
15、D分析所需DNA样品量少(一般510ng)，对DNA质量要求较RFLP低。同时，RAPD标记还可转化为RFLP探针，SCAR及STS等表现为共显性和显性的分子标记。RAPD最大缺点是重复性较差。RAPD标记的实验条件摸索和引物的选择是十分关键而艰巨的工作。为此研究人员应对不同物种做大量的探索工作，以确定每一物种的最佳反应程序包括模板DNA、引物、Mg2+浓度等。只要实验条件标准化，可以提高RAPD标记的再现性。3SCAR标记在RAPD技术的基础上，1993年，Paran等提出了一种将RAPD标记转化成特异序列扩增区域标记，即SCAR标记。它的基本原理是：目标DNA经RAPD分析后，将RAPD多
16、态片段克隆一对克隆片段两端测序一根据测序结果设计长为1824bp的引物，一般引物前10个碱基应包括原来的RAPD扩增所用的引物。多态性片段克隆之前首先应从凝胶上回收该片段，由于Taq酶可使PCR产物3，末端带上A尾巴，人工设计的克隆载体5，末端有一个突出的T碱基，这样可使PCR产物高效地克隆到载体上。将连接产物转化大肠杆菌，涂平板，挑选重组克隆，测序分析、设计引物，PCR扩增，检测是否还能扩增出原来的多态性条带。这种转化成功的标记就称为SCAR标记。由于SCAR标记所用引物长，特异性扩增重复性好，可有效的用于分子育种。(三)AFLP它是荷兰Keygene公司科学家Marc Pieterl993
17、年创造发明的一种DNA分子标记。该技术是对限制性酶切片段的选择性扩增，又称基于PCR的RFLP。鉴于AFLP标记的多态性强，一次可检测到100150个扩增产物，因而非常适合绘制品种指纹图谱及遗传多样性的研究。1AFLP标记的原理首先对基因组的DNA进行双酶切，其中一种为酶切频率较高的限制性内切酶(frequent cutter)，另一种为酶切频率较低的酶(rare cutter)。用酶切频率较高的限制性内切酶消化基因组DNA是为了产生易于扩增的，且可在测序胶上能较好分离出大小合适的短DNA片段；用后者消化基因组DNA是限制用于扩增的模板DNA片段的数量。AFLP扩增数量是由酶切频率较低的限制内
18、切酶在基因组中的酶切位点数量决定的。将酶切片段和含有与其黏性末端相同的人工接头连接，连接后的接头序列及临近内切酶识别位点就作为以后PCR反应的引物结合位点，通过选择在末端上分别添加13个选择性碱基的不同引物，选择性地识别具有特异配对顺序的酶切片段与之结合，从而实现特异性扩增，最后用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物。AFLP的原理示意图见图173。AFLP分析的基本步骤可以概括为：(1)将基因组DNA同时用2种限制性核酸内切酶进行双酶切后，形成分子量大小不等的随机限制性片段，在这些DNA片段两端连接上特定的寡核苷酸接头(oligonucleotide adapters)。(2)通过接头序列和P
19、CR引物3末端的识别，对限制性片段进行选择扩增。一般PCR引物用同位素32P或33P标记。(3)聚丙烯酰胺凝胶电泳分离特异扩增限制性片段。(4)将电泳后的凝胶转移吸附到滤纸上，经干胶仪进行干胶处理。(5)在X光片上感光，数日后冲洗胶片并进行结果分析。为了避免AFLP分析中的同位素操作，目前已发展了AFLP荧光标记、银染等新的检测扩增产物的手段。2.AFLP标记的特点AFLP技术结合了RFLP稳定性和PCR技术高效性的优点，不需要预先知道DNA序列的信息，因而可以用于任何动植物的基因组研究。AFLP多态性远远超过其他分子标记，利用放射性同位素在变性的聚丙烯酰胺凝胶上电泳可检测到50100条AFL
20、P扩增产物，一次PCR反应可以同时检测多个遗传位点，被认为是指纹图谱技术中多态性最丰富的一项技术。AFLP标记多数具有共显性表达、无复等位效应等优点，表现孟德尔方式遗传。该技术受专利保护，目前用于分析的试剂盒价格较贵，分析成本高；对DNA的纯度及内切酶质量要求也比较高，这也是它的不足之处。(四)SSR1987年，Nakamura发现生物基因组内有一种短的重复次数不同的核心序列，他们在生物体内多态性水平极高，一般称为可变数目串联重复序列，简称VNTR(Variable量numbertanderepeat)。VNTR标记包括小卫星(minisatellites)和微卫星(mierosatellit
21、es)标记两种。微卫星标记，即SSR标记，是一类由16个碱基组成的基序(motif)串联重复而成的DNA序列，其长度一般较短，广泛分布于基因组的不同位置(图174A)。如(CA)n、(AT)n、(GGC)n、(GATA)n等重复，其中n代表重复次数，其大小在1060之间。这类序列的重复长度具有高度变异性。对SSR的研究最早始于动物基因组，特别是人类和哺乳动物基因组研究。目前植物SSR研究也非常活跃。根据基因数据库检索及基因文库杂交筛选，已明确在植物核基因组中，各种SSR数量从大到小依次为(AT)n、An、Tn、(AG)n、(CT)n、(AAT)n、(ATT)n、(GTT)n、(AGC)n、(G
22、CT)n、(AAG)n、(CTT)n、(AATT)n、(TTAA)n、(AAAT)n、(ATTI)n、(AC)n、(GT)n等。1SSR标记的原理尽管微卫星DNA分布于整个基因组的不同位置上，但其两端的序列多是相对保守的单拷贝序列。根据微卫星DNA两端的单拷贝序列设计一对特异引物，利用PCR技术，扩增每个位点的微卫星DNA序列，通过电泳分析核心序列的长度多态性。一般地，同一类微卫星DNA可分布于整个基因组的不同位置上，通过其重复次数的不同以及重叠程度的不完全而造成每个座位的多态性。SSR标记多态性丰富，重复性好，其标记呈共显性，分散分布于基因组中。建立SSR标记必须克隆足够数量的SSR并进行测
23、序，设计相应的PCR引物。其一般程序(图174A)如下：建立基因组DNA的质粒文库；根据欲得到的SSR类型设计并合成寡聚核苷酸探针，通过菌落杂交筛选所需重组克隆。如欲获得(AT)I(TA)nSSR则可合成G(AT)n作探针，通过菌落原位杂交从文库中筛选阳性克隆；对阳性克隆DNA插人序列测序；根据SSR两侧序列设计并合成引物；以待研究的植物DNA为模板，用合成的引物进行PCR扩增反应；高浓度琼脂糖凝胶、非变性或变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其多态性。目前，SSR标记技术已被广泛用于遗传图谱构建、品种指纹图谱绘制及品种纯度检测，以及目标性状基因标记等领域。特别在人类和哺乳动物的分子连锁图谱中，已成为取
24、代RFLP标记的第二代分子标记。2SSR标记的特点SSR的检测是依据其两侧特定的引物进行PCR扩增，因此是基于全基因组DNA扩增其微卫星区域。检测到的一般是一个单一的复等位基因位点。SSR标记为共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子；重复性高，稳定可靠。为了提高分辨率，通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳它可检测出单拷贝差异。它兼具PCR反应的优点，所需DNA样品量少，对DNA质量要求不太高。使用SSR技术的前提是需要知道重复序列两翼的DNA序列。这可以在其他种的DNA数据库中查询，但更多的是必须针对每个染色体座位的微卫星，从其基因组文库中发现可用的克隆，进行测序，以其两端的单拷贝序列设计引物，因此微卫星标
25、记的开发成本高。3ISSR标记在SSR标记的基础上开发的ISSR(inter-simple sequence repeatpolymorphicDNA)分子标记是用两个相邻SSR区域内的引物去扩增它们中间单拷贝序列，通过电泳检测其扩增产物的多态性。引物设计采用二个核苷酸、三个核苷酸或四个核苷酸序列为基元(motifs)，以其不同重复次数再加上几个非重复的锚定碱基组成随机引物，从而保证引物与基因组DNA中SSR的5或3末端结合，通过PCR反应扩增两个SSR之间的DNA片段。如(AC)nX，(TG)nX，(ATG)nX，(CTC)nX，(GAA)nX等(X代表非重复的锚定碱基)。Naganka等(
26、1997)已在小麦的ISSR标记研究中发现ISSR标记可获得数倍于RAPD标记的信息量。由于ISSR标记不像RFLP标记一样步骤繁琐，且不需同位素标记，因此，针对重复序列含量高的物种，利用ISSR法可与RFLP，RAPD等分子标记相媲美。它对填充遗传连锁图上大的不饱和区段，富集有用的理想标记具有重要意义。(五)其他标记1CAPs(cleaved amplification polymorphism sequencetagged sites)CAPs技术又称为PCRRFLP。用特异设计的PCR引物扩增目标材料时，由于特定位点的碱基突变、插入或缺失数很小，以至无多态性出现，往往需要对相应PCR扩增
27、片段进行酶切处理，以检测其多态性(Akopyanz等，1992)。其基本步骤是：先利用特定引物进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物用限制性内切酶酶切，酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳将DNA片段分开，溴化乙锭(EB)染色，观察其多态性。与RFLP技术一样，CAPs技术检测的多态性其实是酶切片段大小的差异。Talbert等(1994)在小麦中将RFLP标记转化为STS标记过程中，有些STS标记无多态，但酶切后又出现多态性。CAPs作为一种分子标记，有以下几个优点：引物与限制酶组合非常多，增加了揭示多态性的机会，而且操作简便，可用琼脂糖电泳分析。在真核生物中，CAPs标记呈共显性。所需DNA量少。结果稳
28、定可靠。操作简便、快捷、自动化程度高。CAPs标记最成功的应用是构建拟南芥遗传图谱。Konieczny等(1993)将RFLP探针两端测序，合成PCR引物，在拟南芥基因组DNA中进行扩增，之后用一系列4碱基识别序列的限制性内切酶酶切扩增产物，产生了很多CAPs标记，并且只用了28个巧植株，就将这些CAPs标记定位在各染色体上并构建了遗传图谱。I-tittalmani(1995)等找到了一个抗稻瘟病基因Pi2(t)的CAPs标记。总之，CAPs标记在二倍体植物研究中可发挥巨大的作用，是PCR标记的有力补充。但在多倍体植物中的应用有一定局性。另外，CAPs标记需使用内切酶，这又增加了研究成本，限制
29、了该技术的广泛应用。2STS(Sequencetagged sites)STS是序列标签位点或序标位的简称。它是指基因组中长度为200500bp，且核苷酸顷序已知的单拷贝序列，可采用PCR技术将其专一扩增出来。1989年，华盛顿大学的Olson等人利用STS单拷贝序列作为染色体特异的界标(Landmark)，即利用不同STS的排列顺序和它们之间的间隔距离构成STS图谱，作为该物种的染色体框架图(Framework map)，它对基因组研究和新基因的克隆以及遗传图谱向物理图谱的转化研究具有重要意义。STS引物的获得主要来自RFLP单拷贝的探针序列，微卫星序列。其中，最富信息和多态性的STS标记应
30、该是扩增含有微卫星重复顺序的DNA区域所获得的STS标记。迄今为止，STS引物的设计主要依据单拷贝的RFLP探针，根据已知RFLP探针两端序列，设计合适的引物，进行PCR扩增。与RFLP相比，STS标记最大的优势在于不需要保存探针克隆等活体物质，只需从有关数据库中调出其相关信息即可。最近，随着人类基因组研究的深入，表达序列标定(expressed sequence tags，ESTs)应运而生。由于它直接与一个表达基因相关，很易于转变成STS。STS标记表现共显性遗传，很容易在不同组合的遗传图谱间进行标记的转移，且是沟通植物遗传图谱和物理图谱的中介，它的实用价值很具吸引力。但是，与SSR标记一
31、样，STS标记的开发依赖于序列分析及引物合成，目前仍显成本太高。目前，国际上已开始收集STS信息，并建立起相应的信息库，以便于各国同行随时调用。第二节 重要农艺性状基因连锁标记的筛选技术MAS育种不仅可以通过与目标基因紧密连锁的分子标记在早世代对目的性状进行选择，同时，也可以利用分子标记对轮回亲本的背景进行选择。目标基因的标记筛选(genetaggmg)是进行MAS育种的基础。用于MAS育种的分子标记需具备3个条件：分子标记与目标基因紧密连锁(最好lcM或更小，或共分离)；标记适用性强，重复性好，而且能经济简便地检测大量个体(当前以PCR为基础)；不同遗传背景选择有效。遗传背景的MAS则需要有某一亲本基因型的分子标记研究基础。一、遗传图谱的构建与重要农艺性状基因的标记通过建立分子遗传图谱，可同时对许多重要农艺性状基因进行标记。许多农作物上已构建了以分子标记为基础的遗传图谱。这些图谱在重要农艺性状基因的标记和定位、基因的图位克隆、比较作图以及MAS育种等方面都是非常有意义的。但是由于分子标记数目的限制，目前作图亲本的选用首先考虑亲本间的多态性水平，育种目标性状考虑较少，这样使遗传图谱的构建与重要农艺性状基因的标记筛选割裂开来。因此，根据育种目标选用两个特殊栽培品种作为亲本来构建作物的品种品种图谱，将作物图谱构建和寻找与农艺性状基因紧密连锁的分子标记有机结合起来。遗传作图
