1、第18章 基因工程第十八章 基因工程概论重点：限制性内切酶的类型和用途； 各种载体的特点和用途；文库的构建方法；转基因的概念及常见的转基因技术。难点：各种载体的特点和用途；文库的构建方法。基因工程：是指从分子水平上对基因进 行体外操作，将外源基因加工后插 入到质粒和病毒等载体中，转化受 体细胞并使目的基因得以扩增和表 达，从而实现人们定向改造生物， 得到人们所需的生物性状或基因工 程产品的技术。第一节 基因工程的基本原理一、基因工程的主要程序二、限制性核酸内切酶三、载体一、基因工程的主要程序1、目的基因的制备2、重组DNA分子的构建3、重组DNA分子转移受体细胞4、转化子的筛选5、目的基因表达
2、与功能的鉴定二、限制性核酸内切酶1、限制性核酸内切酶：识别并切割特异 的双链DNA序列的一种内切核酸酶。限制性内切酶的命名：根据其来自的生物名称，用英文字母和数字表示；EcoR I来自大肠杆菌（Escherichia coli）；Hind 来自嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）。2、限制性内切酶的类别： 根据特性可分为型、型和型，目前应用最广泛的是型限制性内切酶。型限制性内切酶的特点： 1）识别4-8bp的特定碱基顺序，如回文对称序列（palindrome，从两个方向阅读其序列相同的序列）。且识别位点和切割位点一致。2）切割产生平末端或粘性末端。3）所产生的互补粘性末端可
3、以配对并被DNA连接酶高效连接。 同裂酶：是指识别相同的位点的不同限制性内切酶。切割位点可以相同也可以不同。如Sma和Xma，它们均识别CCCGGG，但前者切割产生钝末端，后者切割产生粘性末端。 同尾酶：是指能切割产生相同末端的不同限制性内切酶。一般是指能产生相同粘性末端的限制酶。识别序列可以相同也可以不同，但基因工程中识别序列不同的同尾酶的应用性最大。下图为部分常用的限制性内切酶：二、载体 将外源DNA或基因携带入宿主细胞的工具称为载体。 载体应具备的条件： 具有复制原点，能自我复制； 具有单个或多个克隆位点(multiple cloning site，MCS)，即有多种限制酶的切点；选择时
4、的遗传标记(如抗生素抗性基因），以此来筛选重组载体。载体的种类： 质粒载体 噬菌体载体 粘粒载体 噬粒载体 克隆载体 人工染色体载体 穿梭载体 表达载体1、质粒载体（1）质粒的基本特性 质粒是细菌细胞内独立于细菌染色体的能自我复制的环状双链DNA分子。在大肠杆菌中使用的大多数载体都带有一个来源于pMB1质粒或ColE1质粒的复制起始位点。质粒拷贝数分为严谨型与松驰型。严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限，大约 1 至几个；松驰型质粒拷贝数较多，可达几百。 质粒的不相容性 两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性。不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。两个不相容性
5、质粒在同一个细胞中复制时，在分配到子细胞的过程中会竞争，随机挑选，微小的差异最终被放大，从而导致在子细胞中只含有其中一种质粒。 质粒载体是最常见的载体，也是使用最方便的载体。它应用了质粒的复制、拷贝数及不相容性等性质。质粒载体有抗性基因等选择标记和-互补、插入失活等筛选标记。常见的质粒载体有： pBR322、 pUC18/19等。质粒载体能克隆小于6kb的外源DNA片段。（2）质粒载体的类型1）pBR322 pBR322 质粒的大小为 4361bp，含有30多个单一位点，具有四环素抗性基因（tetr）和氨苄青霉素抗性基因（ampr）。目前使用广泛的质粒载体几乎都是由此发展而来的。外源基因可插入
6、到这两个抗生素抗性基因当中，从而造成插入失活。2）pUC18和pUC19 pUC18和pUC19大小只有 2686bp，其结构组成紧凑，几乎不含多余的DNA片段。由pBR322改造而来，它保持了pBR322的复制起点、氨苄青霉素抗性基因（序列有突变），增加了大肠杆菌乳糖操纵子的启动子和lacZ基因部分片段。其中lacZ基因内部增加了多克隆位点（MSC）。这两种载体的MSC排列方向正好相反。2、噬菌体载体： 噬菌体基因组全长为48502bp。噬菌体DNA中间约2/3的序列为中间基因簇，两端为DNA左、右臂。左臂的基因产物用于噬菌体DNA的包装和噬菌体颗粒的形成。右臂的基因产物包含噬菌体复制和裂解
7、宿主菌所必须的基因。而中间基因簇可被外源DNA替代而不影响侵染细菌能力。噬菌体载体的类型（1）插入型载体 通过特定的酶切位点允许外源 DNA 片段插入的载体称为插入型载体（insertion vectors）。由于噬菌体对所包装的DNA有大小的限制，因此一般插入型载体设计为可插入6kb外源DNA片段，最大11kb。例如 gt11。（2）置换型载体 允许外源DNA片段替换非必须 DNA 片段的载体，称为置换型载体（replacement vectors）。一般情况下，置换型载体克隆外源片段的大小范围是 9-23kb，故该载体主要用来构建基因组文库。 填充片段噬菌体载体的克隆原理 噬菌体载体克隆外
8、源DNA片段的原理为载体和外源DNA片段经过酶切以后，连接形成的重组DNA能增殖，但由于分子量太大，不能通过转化方法进入大肠杆菌。通过提取噬菌体的蛋白质外壳，可在体外将重组噬菌体DNA进行包装，形成噬菌体颗粒。这样的噬菌体颗粒侵染大肠杆菌后，可将被包装的重组噬菌体 DNA注射到宿主菌中。通过裂解生长，可增殖重组噬菌体。3、粘粒载体(cosmid)： 粘粒实际是质粒的衍生物，是带有cos序列的质粒。cos序列是噬菌体DNA 中将DNA包装到噬菌体颗粒中所需的 DNA 序列。粘粒的组成包括质粒复制起点（colE1），抗性标记（ampr），cos位点，因而能象质粒一样转化和增殖。它的大小一般在5-7
9、kb左右，用来克隆大片段 DNA，克隆的最大DNA片段可达45kb。 cos位点 在噬菌体颗粒内，基因组DNA呈线性，其两端的5末端带有12个碱基的互补单链（粘性末端），12个碱基的序列为 5-GGGCGGCGACCT-3。当DNA进入细菌细胞后，便迅速通过粘性末端配对形成双链环状的DNA分子，这种黏性末端结合形成双链的区域称为cos位点。 粘粒载体的克隆原理 粘粒克隆的主要原理类似于噬菌体载体。在外源片段与载体酶切后，连接成多联体。在体外包装时，噬菌体A蛋白的末端酶功能将切割两个cos位点，并将两个同方向cos位点之间的片段包装到噬菌体颗粒中去。不同的是，外源片段克隆在粘粒载体中是以大肠杆菌
10、菌落的形式表现出来的，而不是噬菌斑。4、噬粒载体（phagemid） M13噬菌体颗粒是丝状的，只感染雄性大肠杆菌。其基因组为单链DNA，由 6407的碱基组成，共有11个编码基因。较大的间隔位于基因和基因以及基因和基因之间。 在宿主细胞内，感染性的单链噬菌体DNA（正链）在宿主酶的作用下转变成环状双链DNA，这种双链DNA称为复制型 DNA（replicative form DNA），即 RF DNA。 噬菌粒实际上是带有丝状噬菌体大间隔区的质粒载体。 重组载体可以象质粒一样用常规方法进行增殖。而带有这种载体的细菌被 M13（或F1）丝状噬菌体感染后，噬粒载体可启动滚环复制，产生单链的拷贝，
11、最终包装在子代噬菌体颗粒中。通过纯化噬菌体颗粒，可制备单链DNA，用于DNA序列测定。由于载体足够小，可得到长达10kb的外源DNA区段的单链。 pUC118和pUC119是由 pUC18/19 增加了带有M13噬菌体DNA合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列。大小为3162bp，是功能比较完善的噬菌粒载体。5、人工染色体载体（1）细菌人工染色体(BAC)： 是基于大肠杆菌的F质粒构建的低拷贝的质粒载体。每个环状DNA分子中携带一个抗生素抗性标记，一个来源于F因子的严谨型控制的复制子oriS，repE编码复制蛋白以及三个确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因（parA、par
12、B和parC）。 大多数BAC文库中克隆的平均大小约 120kb，然而个别的BAC重组子中含有的基因组DNA最大可达300kb。、（2）酵母人工染色体(YAC)： YAC具有自主复制序列、克隆位点和可在细菌和酵母菌中选择的标记基因；还具有酵母菌染色体一些特点；可接受100300kb的外源DNA片段。YAC已成为人类基因组计划和图位克隆基因的重要工具；并促进了人类人工染色体(human artificial chromosome，HAC)的研究。pYAC4特点： 两个可在酵母菌中利用的选择基因，URA3和TRP1(色氨酸合成基因)； 酵母菌着丝粒序列(CEN4)； 一个自主复制序列(ARS1)；
13、 两个嗜热四膜虫末端重复序列(TEL)保持重组YAC为线状结构； Amp抗性及细菌质粒复制原点； 一个EcoR I 克隆位点，位于酵母菌Sup4tRNA基因内。 YAC 载体的工作原理 YAC 载体主要是用来构建大片段DNA文库，特别用来构建高等真核生物的基因组文库，并不用作常规的基因克隆。 在克隆外源DNA时，用BamHI和EcoRI双酶切，得到二个人工染色体臂，与EcoRI酶切的外源DNA片段连接，构成重组的酵母人工染色体，用于转化酵母菌。6、穿梭载体（shuttle vectors）： 指能在两种不同生物中复制的载体。如能在原核生物(如E.coli)、真核细胞(如酵母)中复制的载体。 穿
14、梭载体需具有细菌质粒复制原点、真核生物自主复制序列(ARS)以及两者的选择标记。 穿梭载体在细菌中用于克隆、扩增基因，在酵母中用于基因表达分析。7、表达载体（1）大肠杆菌表达载体 表达载体是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），使目的基因能够表达的载体。如表达载体pKK223-3的基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点，其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。 当蛋白质表达以后，有效的分离纯化或分泌就成为获得目标蛋白的关键因素。通过融合蛋白的形式表达，并利用载
15、体编码的蛋白或多肽的特殊性质可对目标蛋白进行分离和纯化。用作分离的载体蛋白被称为标签蛋白或标签多肽，常用的有谷胱甘肽转移酶（GST）、六聚组氨酸肽、蛋白质 A和纤维素结合位点等。（2）真核生物表达载体 pCMVp-NEO-BAN载体： 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。 增强型绿色荧光蛋白表达载体（pEGFP） 特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40
16、origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。第二节 文库的构建一、基因组文库的构建二、cDNA文库的构建一、基因组文库的构建1、基因组文库的构建 基因组文库：指将某生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，与合适的载体体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性重组子。 文库中所有克隆所携带的DNA片段重新组合起来可以覆盖整个基因组。 基因组 DNA 文库的构建程序包含 5 个部分： 载体的制备； 高纯度大分子量基因组DNA（HMW DNA）的提取； HMW DNA的部分酶切与脉冲电泳分级分离； 载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主
17、细胞； 重组克隆的挑取和保存。二、cDNA文库的构建 cDNA文库中的外源DNA片段是互补DNA（complementary DNA, cDNA）。cDNA 是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的双链cDNA 。cDNA文库代表生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内转录水平上的基因的群体，并不能包括该生物的全部基因。 cDNA 文库的构建共分四步： 第一，细胞总RNA的提取和mRNA分离； 第二，第一链cDNA合成； 第三，第二链cDNA合成； 第四，双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖。cDNA 文库构建流程第三节 目的基因的克隆一、目的基因的
18、分离二、DNA片段与载体的连接三、重组DNA分子转化受体细胞四、对转化子筛选和鉴定一、目的基因的分离1、用探针寻找目的基因 为寻找目的基因，我们可以用其它生物的类似基因作为探针。例如，如果我们要在人类基因组文库中搜寻生长激素基因，可以用纯化的鼠的生长激素基因序列作为探针。 如果我们分离到目的基因的表达产物，也可以通过其氨基酸序列反推核苷酸序列，从而人工合成探针。2、染色体步移法定位基因 对于一些表达产物未知的目的基因，我们可以先通过杂交或系谱图将相关的基因定位在染色体上。如果已经分离到目的基因的相邻基因，我们可以通过染色体步移法来寻找目的基因。染色体步移法是基于基因组文库是由一系列重叠的DNA
19、片段所组成的。二、DNA片段和载体的连接 DNA片段和载体相连接的方法主要有四种：1、粘性末端连接 每一种限制性核酸内切酶作用于DNA分子上的特定的识别顺序，许多酶作用的结果产生具有粘性末端的两个DNA片段。把所要克隆的DNA和载体DNA用同一种限制酶处理后再经DNA连接酶处理，就可以把它们连接起来。2、平末端连接 某些限制性内切酶作用的结果产生不含粘性末端的平整末端。用机械剪切方法取得的DNA片段的末端也是平整的。在某些连接酶的作用下同样可以把两个这样的DNA片段连接起来。3、同聚末端连接 在脱氧核苷酸转移酶（也称末端转移酶）的作用下可以在DNA的3羟基端合成低聚多核苷酸。如果把所需要的DN
20、A片段接上低聚腺嘌呤核苷酸，而把载体分子接上低聚胸腺嘧啶核苷酸，那么由于两者之间能形成互补氢键，同样可以通过DNA连接酶的作用而完成DNA片段和载体间的连接。4、人工接头分子连接 在两个平整末端DNA片段的一端接上用人工合成的寡聚核苷酸接头片段，这里面包含有某一限制酶的识别位点。经这一限制酶处理便可以得到具有粘性末端的两个DNA片段，进一步便可以用DNA连接酶把这样两个DNA分子连接起来。 三、重组DNA分子转化受体细胞 1、转化 用质粒作载体所常用的方法。转化可分为电转化和CaCl2转化法。 电转化法的原理是利用瞬间高压在细胞上打孔，利于外源质粒进入。CaCl2转化法的原理是利用冰冷的CaC
21、l2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的感受态，易于摄取外源的DNA。 2、转导 用噬菌体作载体所用的方法，这里所用的噬菌体DNA被包上了它的外壳，不过这外壳并不是在噬菌体感染过程中包上，而是在离体情况下包上的，所以称为离体包装。 3、注射 如果宿主是比较大的动植物细胞则可以用注射方法把重组DNA分子导入。四、转化子筛选和鉴定 鉴定转化子中是否含有外源DNA片段常用的方法有： 互补； 杂交筛选； 插入失活； 小量提取质粒酶切检测。1、互补的原理 许多常用载体(pUC系列)上都带有-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和N端146个氨基酸的编码序列。该编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有
22、破坏lacZ的阅读框架,不影响其正常功能。这种载体适用于可编码-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。 虽然宿主和质粒编码的片段都没有活性，但在二者融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的-半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫-互补。 蓝白斑筛选的机理 由-互补产生的Lac+细菌较易识别，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(异丙基硫代-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到载体的多克隆位点上后会导致读码框架改变, 表达蛋白失活, 产生的氨基酸片段失去-互补能力, 因此在同
23、样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。 2、杂交筛选 检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因。菌落原位杂交 对分散在若干个琼脂平板上的少数菌落（100-200）进行克隆筛选时，可采用本方法。将这些菌落归并到一个琼脂主平板以及已置于第二个琼脂平板表面的一张硝酸纤维素滤膜上。经培养一段时间后，对菌落进行原位裂解。主平板应贮存于4直至得到筛选结果。斑点杂交 将样品点在支持膜上进行分子杂交的方法。如将核酸点在能与核酸结合的膜（硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚偏氟乙烯膜等）上，经80烘烤或紫外光照等处理使核酸固定在膜上，然后与标记探针进行分子杂交，用放射自显影或非放射性显色检测
24、。可做定性或半定量分析。 原位杂交 是指将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交,从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。原位杂交可以在细胞标本或组织标本上进行。另有荧光原位杂交。Southern印迹杂交 由英国Southern (1975)发明，将琼脂糖中的DNA转移到尼龙膜进行DNA分子杂交分析的方法。筛选基因库得到阳性克隆将限制性酶酶切Southern杂交结合绘制限制性酶图谱。 Northern印迹杂交 与Sorthern杂交的原理和程序相同。用于分析克隆的基因在某一细胞或组织的转录水平，检测mRNA的存在。 Western 杂交分析： 用于蛋白质的分析。Weste
25、rn 杂交技术是一种蛋白质的固定和分析技术，是将已用聚丙烯酰胺凝胶或其它凝胶或电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维滤膜上，固定在滤膜上的蛋白质成分仍保留抗原活性及与其它大分子特异性结合的能力，所以能与特异性抗体或核酸结合，其程序与Sonthern Blot相似，故称为Western Blot,第一抗体与膜上特异抗原结合后，再用标记的二抗(同位素或非同位素的酶)来检测，此方法可检测1ng抗原蛋白。3、插入失活插入失活的原理 含有两个或两个以上抗生素抗性基因的载体，外源DNA片段插入其中一个基因，并导致该基因的失活，就可以用两个含不同抗生素的平板，互相对照，筛选含重组DNA的菌落，这就是插入失活效应。4
26、、小量提取质粒酶切检测 根据已知的外源DNA序列的限制性酶切图谱，选择一两种限制性内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（DNA带数和长度），从而判断是否有外源DNA插入。第四节 转基因技术一、植物转基因技术二、动物转基因技术 转基因技术是将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术。利用转基因技术可以改变动植物性状，培育新品种。也可以利用其它生物体培育出期望的生物制品，用于医药、食品等方面。一、植物转基因技术 遗传转化的方法按其是否需要通过组织培养、再生植株可分成两大类，第一类需要通过组织培养再生植株，常用的方法有农杆
27、菌介导转化法、基因枪法；另一类方法不需要通过组织培养，目前比较成熟的主要有花粉管通道法，花粉管通道法是我国科学家提出的。农杆菌介导转化法农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，植物细胞被侵染后形成肿瘤，能够诱发冠瘿瘤的称为发癌农杆菌，诱发毛状根的称为发根农杆菌。其中根癌农杆菌在转基因技术中的应用相对较多。根癌农杆菌的Ti质粒上有一段转移DNA（T-DNA），具有向植物细胞传递外源基因的能力，而细菌本身并不进入受体细胞。Ti质粒具有4个主要功能区域： 1）T-DNA区：它是在农杆菌侵染细胞时, 从质粒上切割下来转移到植物基因组中的一段，
28、其携带的基因与肿瘤的形成有关, 但与T-DNA本身的转移与整合无关。T-DNA上最重要的是T-区两端左右边界各为25bp的重复序列。这左右2个边界(LB和RB)是T-DNA转移所必需的，只要其存在, T-DNA可以将携带的任何基因转移并整合到植物基因组中。2）毒性区(vir区)：位于T-DNA以外的一个30-40kb的区域内, 该区段编码的基因虽然并不整合进植物基因组中, 但对T-DNA的转移和整合非常重要。3）接合转移区：该区段存在与细菌间接合转移有关基因tra, 调控质粒在农杆菌间转移。4）复制起始区：该区段调控Ti质粒的自我复制。 农杆菌转化植物细胞涉及一系列复杂的反应，主要包括：受伤的
29、植物细胞为修复创伤部位，释放一些糖类、酚类等信号分子。在信号分子的诱导下，农杆菌向受伤组织集中，并吸附在细胞表面。转移DNA上的毒粒基因被激活并表达，同时形成转移DNA的中间体。转移DNA进入植物细胞，并整合到植物细胞基因组中。Ti质粒的缺陷 1）Ti质粒上存在的一些对于T-DNA转移无用的基因使其片段过大（一般200kb左右），在基因工程中难以操作； 2）天然Ti质粒上存在着许多限制内切酶酶切位点, 难以进行DNA重组操作； 3）T-DNA上致瘤基因产物干扰宿主内源激素平衡, 导致肿瘤, 阻碍细胞分化和植物再生； 4）Ti质粒没有大肠杆菌复制起点, 不能在大肠杆菌中复制, 限制了Ti质粒的应
30、用。农杆菌Ti质粒的改造及载体构建1）共整合载体 去除T-DNA区中的致瘤基因，造成T-DNA大段缺失（形成卸甲的质粒）, 并在T-DNA上插人外源基因并不影响T-DNA的转移和整合功能。根据Ti质粒的这一特性， 最初开发的载体为共整合载体，其Ti质粒上编码致瘤基因的序列被一段pBR322载体的DNA所取代，但保留T-DNA的2个边界序列。 外源基因首先被克隆到pBR322中, 然后把载有外源基因的pBR322重组载体（亦称衍生中间载体）通过一定的方法（电击法、冻融法或三亲交配）导人农杆菌。由于改造的质粒与导人的中间载体具有部分同源的pBR322序列而发生同源重组, 外源基因因此整合到卸甲的T
31、i质粒的T-DNA区段, 形成一个共整合载体。这样, 目的基因就成了T-DNA的一部分, 可以被农杆菌转移到植物中。2）双元载体 虽然vir区域对T-DNA的转移必不可少, 但这一区域并不一定与T-DNA连在一起, 可以分别位于不同的复制子质粒上, 甚至可以放在细菌的染色体中, 而不影响T-DNA的转移。根据这一原理, 双元载体系统由2个分别含有T-DNA和vir区的相容性突变Ti质粒构成, 即微型Ti质粒和辅助Ti质粒。 微型Ti质粒是含有T-DNA边界, 缺失vir基因的质粒，同时还具有广谱质粒复制位点, 选择标记基因和多克隆位点，方便分子克隆操作。这种载体既含有大肠杆菌的复制位点, 也有农杆菌的复制位点, 既能在大肠杆菌中复制, 也能在农杆菌中复制，也称大肠杆菌一农杆菌穿梭质粒, 但载体上不带vir。 转化农杆菌之前, 所有的克隆操作步骤都可以在大肠杆菌中
