1、低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒技术审评规范低密度脂蛋白胆固醇测定试剂（盒）技术审评规范（2014版）一、前言本审评规范旨在指导注册申请人对低密度脂蛋白胆固醇测定试剂（盒）注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。本审评规范是对低密度脂蛋白胆固醇测定试剂（盒）的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。本审评规范是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用
2、，但需要提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本审评规范。本审评规范是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本审评规范相关内容也将适时进行调整。二、适用范围 低密度脂蛋白胆固醇测定试剂（盒）用于体外定量测定人血清和/或血浆中的低密度脂蛋白胆固醇的含量。从方法学考虑，本文主要指采用分光光度法原理，利用全自动、半自动生化分析仪或分光光度计，在医学实验室进行低密度脂蛋白胆固醇定量检验所使用的临床化学体外诊断试剂。本规范不适用于干式低密度脂蛋白胆固醇测定试剂（盒）。依据体外诊断试剂注册管理办法（试行）（以下简称办法）
3、低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒管理类别为类，分类代号为6840。三、基本要求（一）综述资料综述资料主要包括产品预期用途、临床意义、产品描述、有关生物安全性的说明、研究结果的总结评价以及同类产品上市情况介绍等内容，应符合办法和体外诊断试剂注册申报资料基本要求（国食药监械2007609号）的相关要求。下面着重介绍与低密度脂蛋白胆固醇测定试剂（盒）预期用途有关的临床背景情况。低密度脂蛋白（LDL）是富含胆固醇（CHO）的脂蛋白，是动脉粥样硬化的危险性因素之一，LDL经过化学修饰后，其中的apoB-100变性，通过清道夫受体（scavenger receptor）被吞噬细胞摄取，形成泡沫细胞并停留在血管
4、壁内，导致大量CHO沉积，促使动脉壁形成动脉粥样硬化斑块（atheromatous plaque），故LDL为致埃及粥样硬化的因子。临床上以LDL-C的含量来反映LDL水平。LDL-C水平增高：判断发生冠心病的危险性：LDL是动脉粥样硬化的危险因子，LDL-C水平增高与冠心病发病呈正相关，因此，LDL-C可用于判断发生冠心病的危险性。其他：遗传性高脂蛋白血症、甲状腺功能减退症、肾病综合征、阻塞性黄疸、肥胖症以及应用雄激素、-受体阴滞剂、糖皮质激素等LDL-C也增高。LDL-C水平减低：LDL-C减低常见于无-脂蛋白血症、甲状腺功能亢进症、吸收不良、肝硬化，以及低脂包含和运动等。LDL-C检测的
5、适应症：临床上主要用于高胆固醇血症、冠心病和动脉粥样硬化的辅助诊断。注：若注册申报产品声称临床意义超出此内容范围，应提供相关文献或临床研究依据。（二）产品说明书 说明书承载了产品预期用途、试验方法、检测结果解释以及注意事项等重要信息，是指导实验室工作人员正确操作、临床医生针对检验结果给出合理医学解释的重要依据。因此，产品说明书是体外诊断试剂注册申报最重要的文件之一。产品说明书的格式应符合体外诊断试剂说明书编写审评规范的要求，结合体外诊断试剂说明书编写指导原则的要求，下面对低密度脂蛋白胆固醇测定试剂（盒）说明书的重点内容进行详细说明，以指导注册申报人员更合理地完成说明书编制。1.【产品名称】（1
6、）试剂（盒）名称由三部分组成：被测物名称、用途、方法或原理。例如：低密度脂蛋白胆固醇测定试剂（盒）（直接法选择抑制法）。（2）英文名称（如有）应当正确、完整、直译，不宜只写缩写。【包装规格】（1）不得多于标准中所列的包装规格；（2）注明装量或可测试的样本数，如测试/盒、mL。【预期用途】应至少包括以下几部分内容：（1）说明试剂盒用于体外定量测定人血清和/或血浆中低密度脂蛋白胆固醇的含量。（2）与预期用途相关的临床适应症背景情况，如临床适应症的发生率、易感人群等，相关的临床或实验室诊断方法等。【检验原理】本规范适用于对人血清和/或血浆中的低密度脂蛋白胆固醇进行定量检测的试剂（盒），以下介绍几种典
7、型反应原理：（1）聚乙烯硫酸沉淀法：样本中的聚乙烯硫酸盐-聚乙二醇甲醚（PVS）选择性的沉淀LDL，离心后上层液中含高密度脂蛋白（HDL）、极低密度脂蛋白（VLDL）和乳糜微粒（CM），用胆固醇酶法测定试剂分别测定上层液和血清总胆固醇含量，二者之差即为LDL-C含量。（2）直接法-表面活性剂清除法：反应分两步进行：第一步：R1中聚阴离子与LDL形成复合物，在表面活性剂1作用下，不与胆固醇酶试剂反应。而其它脂蛋白（CM，VLDL-C，HDL-C）则被酶试剂水解产生过氧化氢，在缺乏偶联剂时被消耗而不显色。 第二步：R2中表面活性剂2使LDL释放胆固醇，在胆固醇酶试剂与偶联剂作用下参与Trinder
8、反应而显色，吸光度与标本中低密度脂蛋白胆固醇浓度成正比。（3）直接法-保护性试剂法：在反应第一步，LDL在两性表面活性剂（保护剂）作用下被选择性保护，而非LDL脂蛋白（CM，VLDL-C，HDL-C）被胆固醇酶法试剂处理。第二步中，LDL 中胆固醇被释放，在酶试剂与偶联剂作用下参与Trinder反应而显色，吸光度与标本中低密度脂蛋白胆固醇浓度成正比。【主要组成成份】（1）说明试剂盒包含组分的名称、数量、比例或浓度等信息，如果对于正确的操作很重要，应提供其生物学来源、活性及其他特性；明确说明不同批号试剂盒中各组分是否可以互换。（2）试剂盒内如包含校准品和/或质控品，应说明其主要组成成分及其生物学
9、来源，校准品应注明其定值及溯源性，溯源性至少应写明溯源到的最高级别，包括：标准物质的发布单位及编号，质控品应有合适的靶值范围。【储存条件及有效期】（1）对试剂盒的效期稳定性、复溶稳定性、开瓶稳定性等信息做详细介绍。包括环境温湿度、避光条件等。（2）不同组分保存条件及有效期不同时，应分别说明，产品总有效期以其中效期最短的为准。注：保存条件不应有模糊表述，如“室温”。稳定期限应以月或日为单位。【适用仪器】（1）说明可适用的仪器，并提供与仪器有关的必要信息以便用户能够作出最好的选择。（2）应写明具体适用仪器的型号，不能泛指某一系列仪器。【样本要求】重点明确以下内容： （1）样本采集前对患者的要求：如
10、采集时间、采集顺序等，是否受临床症状、用药情况等因素的影响。（2）样本采集：说明采集方法及样本类型，如有血浆样本，应注明对抗凝剂的要求。（3）样本处理及保存：样本处理方法、保存条件及期限、运输条件等。冷藏/冷冻样本检测前是否须恢复室温，冻融次数。对储存样本的添加剂要求等。（4）应明确当测定值超出线性上限时的稀释方法，并给出稀释最大倍数说明。【检验方法】详细说明试验操作的各个步骤，包括：（1）试验具体操作步骤。（2）试剂配制方法、注意事项。（3）试验条件：温度、时间、仪器波长等以及试验过程中的注意事项。（4）校准：校准品的使用方法、注意事项、校准曲线的绘制。应注明推荐的仪器校准周期。（5）质量控
11、制：质控品的使用方法、对质控结果的必要解释以及推荐的质控周期等，如质控不合格应提供相关的解决方案。【参考值（参考范围）】（1）应注明常用样本类型的正常参考值（范围），如：3.12mmol/L(120mg/dL)。并简要说明参考值确定的方法。（2）简单介绍设定该参考值（范围）所选健康人群的区域特征，建议注明以下字样“由于地理、人种、性别及年龄等差异，建议各实验室建立自己的参考值（范围）”。【检验结果的解释】说明可能对试验结果产生影响的因素；说明在何种情况下需要进行确认试验。【检验方法局限性】（1）说明检测结果仅供临床参考，不能单独作为确诊或排除病例的依据。（2）说明该检验方法由于哪些原因会使测量
12、结果产生偏离，或测量结果还不能完全满足临床需要。如：干扰（胆红素、血红蛋白、甘油三酯等）等。【产品主要性能指标】封多于标准中所列的包装规格。_产品性能指标应符合企业标准要求。说明该产品主要性能指标，应至少包括：外观、装量、试剂空白吸光度、试剂空白吸光度变化率、分析灵敏度、线性范围、重复性、批间差等。【注意事项】应至少包括以下内容：（1）本试剂盒的检测结果仅供临床参考，对患者的临床诊治应结合其症状/体征、病史、其他实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。（2）使用不同生产商的试剂对同一份样本进行检测可能会存在差异。（3）对所有样本和反应废弃物都应视为传染源对待，提示操作者采取必要的防护措施。【参考文
13、献】注明引用参考文献，其书写应清楚、易查询且格式规范统一。【生产企业】包括企业名称、地址（注册地址和生产地址不同的应分别列出）、邮政编码、电话和传真号码、网址等。【其他】如医疗器械生产企业许可证编号、医疗器械注册证书编号、产品标准编号、说明书批准日期及修订日期等。（三）拟定产品标准及编制说明拟定产品标准应符合体外诊断试剂注册管理办法和体外诊断试剂注册申报资料基本要求的相关规定。如已有相应的国家/行业标准发布，则企业标准的要求不得低于其相关要求。下面就标准中涉及的产品适用的相关标准、主要性能指标、标识标签说明书以及检验规则等相关内容做一简要叙述。 产品适用的相关标准GB/T 191-2008 包
14、装储运图示标志GB/T 214152008 体外诊断医疗器械 生物样品中量的测量 校准品和控制物质赋值的计量学溯源性 GB/T 26124-2011 临床化学体外诊断试剂（盒）YY/T 0316-2008 医疗器械 风险管理对医疗器械的应用YY/T 0466.12009医疗器械 用于医疗器械标签、标记和提供信息的符号 第1部分：通用要求主要性能指标：（1）外观a)试剂盒各组分应齐全、完整，液体无渗漏；b)包装标签文字符号应清晰。（2）装量液体试剂的净含量应不少于标示量。（3）试剂空白吸光度用指定空白样品测试试剂（盒），在说明书规定的测试条件下，记录反应结束(T)后的吸光度（A），测试结果即为试
15、剂空白吸光度测定值，应不大于0.05。（4）分析灵敏度用试剂（盒）测试低密度脂蛋白胆固醇已知浓度在（2.004.00）mmol/L的样本，记录在试剂（盒）规定参数下的吸光度差值。换算为1.00mmol/L的吸光度差值，吸光度差值（A）应0.03。（5）线性用接近线性区间下限的低浓度样本稀释接近线性区间上限的高浓度样本，混合成6个稀释浓度（xi）。用试剂（盒）分别测试以上样本，每个稀释浓度测试3次，分别求出每个稀释浓度检测结果的均值（yi）。以稀释浓度（xi）为自变量，以检测结果均值（yi）为因变量求出线性回归方程。按公式（1）计算线性回归的相关系数（r）。 （1）稀释浓度（xi）代入求出线性回
16、归方程，计算yi的估计值及yi与估计值的相对偏差或绝对偏差。试剂（盒）至少在0.30，10.00mmol/L的线性范围内分析性能应符合如下要求：线性相关系数（r）应不小于0.995；0.30，10.00mmol/L区间内，线性偏差应不超过0.30mmol/L或不超过10。（6）重复性 批内重复性：测试浓度在（2.500.50）mmol/L和（5.001.00）mmol/L的血清样品或质控样品，各重复测试10次，分别计算测量值的平均值（ ）和标准差（s）。所得结果的变异系数（CV）应不大于3%。批内瓶间差（干粉或冻干试剂适用）用(2.500.50) mmol/L的血清样品或质控样品测试同一批号的
17、10个待检试剂（盒），并计算10个测量值的平均值（1）和标准差（s1）。用(2.500.50) mmol/L的血清样品或质控样品对该批号的1个待检试剂（盒）重复测试10次，计算结果的均值（2）和标准差（s2）。按公式（2）、（3）计算瓶间差的变异系数（CV）。 （2） （3）当s1s2时，令CV=0每个浓度下试剂（盒）批内瓶间差均应不大于3%。（7）批间差：用（2.500.50）mmol/L的血清样品或质控样品分别测试3个不同批号的试剂（盒），每个批号测试3次，分别计算每批3次测定的均值(i=1,2,3)，按公式（4）、（5）计算相对极差（R）。 （4） （5）式中：中的最大值； 中的最小值。
18、试剂（盒）批间相对极差（R）应不大于10%。（8）准确度相对偏差试剂（盒）测试可用于评价常规方法的有证参考物质(CRM)或其它公认的参考物质3次，测试结果记为（Xi），按公式（6）分别计算相对偏差B，如果3次结果的相对偏差应不超过10%，即判为合格。如果大于等于2次的结果不符合，即判为不合格。如果有1次结果不符合要求，则应重新连续测试20次，并分别按照公式（6）计算相对偏差，如果大于等于19次测试结果的相对偏差应不超过10%，即判为合格。B%(XiT)T100% （6）式中：Xi为测试值；T为标准物质标示值，或各浓度人血清定值。比对试验用不少于40个在检测浓度范围内不同浓度的临床样品，以生产企
19、业指定的分析系统作为比对方法，每份样品按待测试剂（盒）操作方法及比对方法分别检测。用线性回归方法计算两组结果的相关系数（r）及每个浓度点的相对偏差。相关系数 r0.995，0.30，10.00mmol/L区间内，线性偏差应不超过0.30mmol/L或不超过10。注：1.型式试验时，按以上优先顺序，采用上述方法之一测试试剂（盒）的准确度。2.出厂检验时，生产企业可以选择以上检验方式，也可以使用具有溯源性的企业（工作）校准品或正确度质控物质进行准确度实验。（9）效期稳定性效期稳定性：试剂（盒）在规定的贮存条件下保存至有效期末，产品的性能应至少符合试剂空白吸光度、分析灵敏度、线性、准确度和重复性的要
20、求。复溶稳定性（干粉或冻干试剂适用）：干粉试剂开瓶后（复溶后）在规定的贮存条件下保存至预期时间内，产品的性能应至少符合线性、准确度和重复性。（10）校准品和质控品（如适用）溯源及赋值说明：低密度脂蛋白胆固醇已有国家及国际标准物质，试剂盒配套校准品和质控品，应参照GB/T 214152008 体外诊断医疗器械 生物样品中量的测量 校准品和控制物质赋值的计量学溯源性的要求溯源至国家或国际标准物质，并提供校准品溯源性说明及质控品赋值说明。性能要求：外观、装量、质控品赋值有效性、干粉或冻干品应包含批内瓶间差、复溶稳定性。 试剂（盒）说明书、标签、包装标识试剂（盒）说明书详见“产品说明书”相关要求。外包
21、装标签生产企业名称和地址。 试剂（盒）名称。批号。如试剂（盒）包含不同批号的组件，外包装的批号应能保证每个组件的批号可从生产企业的生产记录中溯源。规格型号。应包含体积或复溶后的体积。预期用途。如试剂（盒）名称不能反映试剂（盒）的预期用途，应提供简要的预期用途说明。 体外诊断用途。储存和处置条件。应提供在未开封状态下可保证试剂（盒）的稳定状态的必要储存条件；应规定影响稳定性的其他条件（如适用）；应规定产品处置时所采取的所有其他特殊措施（如适用）。失效期。应明示在规定储存条件下的失效期；失效期应以年、月，适当时以日表示；如仅给出年月，失效期应为指定月最后一天；外包装标签上明示的失效期应为最早到期组
22、件的失效期。警告和预防措施。如体外诊断试剂（盒）被认为有危险性（例如：化学，放射性或生物危害性），外包装应标有适当的警示危险的文字或符号，YY/T 0316的要求适用；对于化学危害，如试剂（盒）没有随带含有适当的危险和安全性说明的使用说明，则应在外包装的标签上进行说明。初始包装标签如初始包装同时也是外包装，则外包装标签的要求也适用。生产企业名称或等同的商标或标志。产品名称。批号。规格型号。体外诊断用途。储存和处置条件（参见外包装标签要求）。失效期（参见外包装标签要求）。警告和预防措施（参见外包装标签要求）。应明示试剂预期为一次性使用。出厂检验原则每批试剂（盒）出厂检验至少进行以下几项内容：外观
23、、装量、试剂空白吸光度、准确度、重复性、赋值有效性（如适用）。（四）注册检验根据办法要求，首次申请注册的第二类产品应该在国家食品药品监督管理总局认可的、具有相应承检范围的医疗器械检测机构进行三个生产批次样品的注册检测。对于已经有国家/国际标准品的检测项目，在注册检测时应采用相应的国家/国际标准品进行。（五）主要原材料研究资料（如需提供）主要原材料（包括酶、底物及其他主要原料）的选择、制备、质量标准及实验验证研究资料；质控品、校准品的原料选择、制备、定值过程及试验资料；校准品的溯源性文件，包括具体溯源链、实验方法、数据及统计分析等详细资料。（六）主要生产工艺及反应体系的研究资料（如需提供）1.主
24、要生产工艺介绍，可以图表方式表示；2.反应原理介绍；3.确定反应所需物质用量（校准品、样本、酶、底物等）的研究资料；4.确定反应最适条件研究；5.其他：如基质效应等。（七）分析性能评估资料企业应提交在产品研制阶段对试剂盒进行的所有性能验证的研究资料，包括具体研究方法、试验数据、统计方法等详细资料。申请人应按以下要求提供体外诊断试剂性能评估资料：申请人名称；性能评估方法、要求；性能评估所使用试剂（包括校准品、质控品）的名称、批号、有效期；应提供使用的仪器型号、序列号（SN）；性能评估的时间、地点、检验人员；性能评估的具体数据及分析判定；性能评估审批人签字、审批时间。对于本试剂盒，建议着重对以下分
25、析性能进行研究：准确度对测量准确度的评价依次包括：与国家标准品（和/或国际标准品）的偏差分析、方法学比对等方法，企业可根据实际情况选择合理方法进行研究。（1） 与国家（国际）标准品的比对研究该研究项目已有相应国家（国际）标准品，优先使用国家（国际）标准品进行验证，重点观察对相应标准品检测结果的偏差情况。（2） 方法学比对在国家（国际）标准品无法获得的前提下，可采用普遍认为质量较好的已上市同类试剂作为参比方法，与拟申报试剂同时检测一批临床样品，从测定结果间的差异了解拟申报试剂与参比方法间的偏倚。如偏倚很小或在允许的误差范围内，说明两检测系统对病人标本测定结果基本相符，对同一份临床样本的医学解释，
26、拟申报试剂与参比方法相比不会产生差异结果。在实施方法学比对前，应分别对拟申报试剂和参比试剂进行初步评估，只有在确认两者都分别符合各自相关的质量标准后方可进行比对试验。方法学比对时应注意质量控制、样本类型、浓度分布范围并对结果进行合理的统计学分析。试剂空白吸光度用指定空白样品测试试剂（盒），在说明书规定参数下，记录测试反应完成(T)后的吸光度（A），测试结果即为试剂空白吸光度测定值，试剂空白吸光度应0.03。批内重复性测量重复性的评估应包括两个浓度水平的样本进行，建议测试浓度为（2.500.50）mmol/L和（5.001.00）mmol/L样本，两个浓度都应在试剂盒的测量范围内。批间差用（2.
27、500.50）mmol/L的血清样品或质控样品分别测试3个不同批号的试剂（盒），每个批号测试3次，分别计算每批3次测定的均值，计算相对极差（R）应不大于10%。线性范围建立试剂线性范围所用的样本基质应尽可能与临床实际检测的样本相似，理想的样本为分析物浓度达到预期测定上限的混合人血清，且应充分考虑多倍稀释对样本基质的影响。建立定量产品的线性范围时，需在预期测定范围内选择至少7-11个浓度水平。例如，将预期测定范围加宽至130%，在此范围内选择更多的浓度水平，然后依据实验结果逐渐减少数据点（最终不得少于7个水平）直至表现出线性关系，可发现最宽的线性范围。干扰试验对样本中常见的干扰物质进行检测，如胆
28、红素、血红蛋白、甘油三酯等。方法为对模拟添加样本分别进行验证，样本量选择应体现一定的统计学意义，说明样本的制备方法及干扰实验的评价标准，确定可接受的干扰物质极限浓度。校准品溯源及质控品赋值应参照GB/T 214152008 体外诊断医疗器械 生物样品中量的测量 校准品和控制物质赋值的计量学溯源性的要求，提供企业（工作）校准品及试剂盒配套校准品定值及不确定度计算记录，提供质控品赋值及其靶值范围确定的记录。其他需注意问题对于适用多个机型的产品，应提供如产品说明书【适用机型】项中所列的所有型号仪器的性能评估资料。试剂盒的样本类型如包括血清和血浆样本，则应对二者进行相关性研究以确认二者检测结果是否完全
29、一致或存在某种相关性（如系数关系）。对于血浆样本，企业应对不同的抗凝剂进行研究以确认最适的抗凝条件以及是否会干扰检测结果。（八）参考值（参考范围）确定资料应提交建立参考值（范围）所采用样本来源及详细的试验资料。应明确参考人群的筛选标准，研究各组（如性别、年龄等）例数不应低于120例。若引用针对中国人群参考值范围研究的相关文献，应明确说明出处，并进行验证。 参考值研究结果应在说明书【参考值（参考范围）】项中进行相应说明。（九）稳定性研究资料稳定性研究主要包括效期稳定性、高温加速破坏稳定性、运输稳定性、机载稳定性及开瓶（复溶）稳定性等，企业可根据实际需要选择合理的稳定性研究方案。稳定性研究资料应包
30、括研究方法的确定依据、具体方法及过程。对于实时稳定性研究，应提供至少3批样品在实际储存条件下保存至成品有效期后的研究资料。应对样本在不同储存条件下的稳定性期限进行研究，并在说明书中样本要求处明示。（注：若有相关文献中已明确说明，亦可作为依据。）（十）临床试验研究试剂（盒）按照办法及体外诊断试剂临床研究技术指导原则、北京市第二类体外诊断试剂临床试验指导原则进行临床试验。1 研究方法2 选择境内已批准上市的性能不低于拟申报产品的同类产品作为参比试剂，采用拟申报产品（以下称考核试剂）与之进行对比试验研究，证明本品与已上市产品等效。临床研究单位的选择应选择至少两家省级卫生医疗机构，临床研究单位实验操作人员应有足够的时间熟悉检测系统的各环节（试剂、质控及操作程序等），熟悉评价方案。在整
