1、d-1）、金纳多组（剂量为45.5mgd-1）;采用Allen s法复制中度SCI模型，造模成功后观察1周;连续给药2周后，取各组脊髓组织，采用实时逆转录聚合酶链反应（RT PCR）法检测各组脊髓组织PAF R mRNA表达水平。结果模型组大鼠脊髓组织PAF R mRNA表达显著降低（P0.01）;补阳还五汤组及金纳多组均可抑制脊髓组织PAF R mRNA表达，与模型组比较差异有显著性意义（P0.01），而两给药组之间比较无显著性差异（P0.05）。结论补阳还五汤对损伤脊髓的保护作用可能与其能减少PAF R数目，抑制PAF R活性，从而阻断PAF发挥损伤效应有关。 【关键词】 补阳还五汤/药理
2、学 脊髓损伤/中药疗法 基因表达调控 疾病模型 动物 大鼠补阳还五汤已广泛用于神经损伤后的保护与修复治疗，如脑梗死、外伤性截瘫、周围神经损伤等1。血小板活化因子（platelet activating factor，PAF）是体内一种重要的脂质类生物信息分子和重要的炎性细胞因子，脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）后PAF含量明显升高，通过与其特异性受体（receptor，R）结合，引发脊髓的继发性病理损伤2-3。本文采用实时逆转录聚合酶链反应（RT PCR）方法，观察了补阳还五汤治疗大鼠SCI后，脊髓组织内血小板活化因子受体（PAF R）mRNA表达水平的变化，旨在探讨补
3、阳还五汤对引发脊髓继发性损伤的靶点之一-PAF的阻断作用机制。现将结果报道如下。1 材料与方法1.1 药物 补阳还五汤由广东一方制药有限公司提供的中药配方颗粒严格遵照原方配比而成，含生黄芪120g，当归尾6g，赤芍4.5g，地龙、川芎、桃仁、红花各3g，实验大鼠按照3倍临床等效剂量40g/kg灌胃给药。金纳多（银杏叶提取物）为德国威玛舒培博士药厂产品（批号：8781006），实验大鼠按照3倍临床等效剂量45.5mg/kg给药。1.2 仪器及试剂 Ultrospec 4300紫外可见分光光度计为瑞士安法玛西亚公司产品;ABI 7300 PCR扩增仪为美国应用生物系统（ABI）公司产品;大鼠PAF
4、受体基因引物和探针由广州市达晖生物科技有限公司设计合成，引物序列为：（上游） 5 TGAGCATTATGAGCCATACAGTGT 3 ，引物长度24bp，解链温度（melting temperature,Tm）59.1;（下游）5 TGATGACCATGTTGCAGTAGAAGA 3 ，引物长度24bp，Tm 58.9;产物长度为107 bp cDNA。探针序列：FAM TCCTTGTCGTCC ACATCTTCATCACCTCCTG TAMRA，探针长度31bp，Tm 69;RNA的提取及逆转录试剂由上海生工提供;DNA扩增试剂及标准品由广州市达晖生物科技有限公司提供;其他试剂均为国产分析
5、纯。1.3 实验动物及造模 SPF级Wistar大鼠76只，雌雄各半，体质量（19510）g ，由南方医科大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（粤）2006 0015/2006B023/2006A052;在南方医科大学实验动物中心实验室进行实验，温度（235），湿度（6015）标准环境动物设施合格证号：SYXK（粤）2006 0074。以100mg/L水合氯醛3.5g/kg腹腔注射麻醉大鼠，背部剪毛，将动物俯卧固定于手术台上，100mg/L的活力碘消毒，以T12棘突为中心取背部正中切口，长约3cm，显露T11 L1棘突及椎板。用特制的手术钳咬除T11下半、T12全椎板及L1上半椎板，以脊髓
6、为中心显露直径约2.8mm圆形区，在硬膜表面垫一弯曲度与脊髓表面一致的塑料垫片。采用Allen s打击法4，用直径约2.4mm重5g的圆柱状重锤从10cm高处，沿细玻璃导管垂直下落，打击垫片致T12脊髓急性挫伤，致伤力为510gcf（gramcmforce），逐层缝合伤口。造模完成后，每天肌注青霉素钠2万U，1次/d，单笼管理饮食，每8h按摩膀胱排尿，并用碘伏消毒伤口，直至膀胱功能恢复。模型大鼠观察1周，伤情稳定后，模型组进行随机化分组。1.4 动物分组及给药 76只Wistar大鼠先按性别分层，然后根据体质量采用随机数字表法分组，其中正常组16只，其他实验大鼠采用Allen s打击法制作中度
7、SCI模型。造模完成后观察1周，待伤情稳定后，参照改良的Tarlov评分标准4，选择后肢运动功能障碍评分为23分的模型大鼠48只，随机分为模型组、补阳还五汤组、金纳多组，各组分别给予蒸馏水、补阳还五汤（剂量为40gd-1）、金纳多水溶液（剂量为45.5mgd-1），正常组给予蒸馏水;给药体积均为20mL/kg，用药2周结束实验。1.5 脊髓组织PAF R mRNA表达测定 给药结束后，迅速切取脊髓损伤段上下约1cm大小的脊髓组织，置于Eppendorf管中，-70冰箱保存。采用RT PCR法检测脊髓组织PAF R mRNA表达水平。1.5.1 总RNA的提取 电子天平称取脊髓组织50mg，严格
8、按照RNA提取说明书提取总RNA，-20冰箱保存。紫外可见分光光度计观察D260/D280的比值，检测样品中RNA纯度;普通琼脂糖凝胶电泳后紫外灯观察28s条带与18s条带亮度比，检测RNA的完整性。1.5.2 mRNA的逆转录及cDNA的荧光定量扩增 严格按照说明书进行操作。PCR反应总体积为50L，反应条件：93预变性2min，循环参数：93变性45s，55退火延伸1min，10个循环（未采集荧光）;93变性45s，55退火延伸1min，30个循环（采集荧光）。1.6 统计学方法 应用SPSS 10.0 软件进行分析，采用单因素方差分析，多重比较用SNK q检验。2 结果2.1 总RNA纯
9、度及mRNA的完整性鉴定 根据测定要求，在mRNA分析前，需对所有样品进行总RNA纯度及mRNA的完整性鉴定，达到规定要求后才能进行下一步测定。本研究采用紫外可见分光光度计对总RNA的纯度进行鉴定，D260/D280比值在1.82.0之间;经琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下观察可见28s条带及18s条带，两条带亮度比约为2：1，总RNA的纯度及完整性满足实验要求，电泳鉴定图如图1所示。2.2 各组大鼠脊髓组织PAF R mRNA表达量比较 表1结果显示，SCI模型大鼠PAF R mRNA表达显著降低（P0.01）,补阳还五汤组与金纳多组均可抑制脊髓组织PAF R mRNA表达，与模型组比较差异有显著
10、性意义（P0.01）,两给药组之间比较无显著性差异（P0.05）。 3 讨论补阳还五汤出自晚清王清任医林改错，是益气活血之名方，由生黄芪、当归尾、川芎、赤芍、地龙、桃仁、红花组成，具有益气活血通络之效。临床发现其具有中枢神经保护作用，现已广泛应用于中风后遗症、脑血管疾病等中枢神经系统损伤后的治疗1。PAF被认为是SCI后继发性病理损伤的重要损害因子之一，体外实验已证明5补阳还五汤可抑制PAF R活性。SCI后，PAF释放成倍增加，可引起强烈的炎症反应，并可通过促进花生四烯酸代谢为血栓素B2、前列腺素和白三烯，三者可引发炎症的级联放大反应6;PAF可通过收缩血管、诱导血小板聚集和形成血栓等作用，
11、使脊髓微血管闭塞和痉挛，导致脊髓损伤部位延迟性缺血;PAF还可作为一种生物活性磷脂参与神经细胞兴奋性毒性凋亡7。PAF是通过与其特异性受体结合而发挥生物效应，故减少其受体数目、抑制其受体活性，是阻断PAF发挥损伤效应的关键环节之一。PAF R广泛存在于中枢神经系统组织细胞的表面，主要表达于小胶质细胞及神经元的表面;病理情况下，受体处于何种状态取决于配体浓度和配体增加的速度;快速给予配体时，可迅速激活受体;但配体长时间作用后受体发生去敏感化，引起受体数目、亲和力下调及受体活性的改变8。有学者发现脊髓组织内含有高、低两种亲和性不同的PAF R，脊髓病理损伤过程中，损伤区神经细胞膜上PAF高、低亲和
12、性受体对PAF的亲和性均明显增加，而PAF R数目却明显减少，这种变化可能由于SCI初期内源性PAF显著增多，迅速与其受体结合，使大量静息状态的受体被激活，诱导增强了PAF与其受体的结合能力，亲和力增加;PAF R在PAF持续高水平作用下，通过蛋白激酶C途径激活磷酸依赖性蛋白激酶C，蛋白激酶C将PAF R不可逆地磷酸化，从而发生受体失敏，表现为下调;同时，脊髓神经细胞产生受体介导性内吞，PAF R在溶酶体内降解，也导致受体数量减少9-10。从基因调控角度分析，增多的PAF与相应受体特异结合后，将微环境变化的信息通过胞内信号转导传递到细胞核内，激活一类细胞核内蛋白因子，即反式作用因子，其结构上含
13、有与DNA结合的结构域，可以特异性识别并结合DNA序列，阻遏PAF R基因的表达，从而减少神经细胞膜PAF R数目，受体数目逐渐被向下调节11。本研究结果发现，模型组脊髓组织PAF R mRNA表达量显著低于正常组，与Zhang等12在中枢神经系统缺血再灌注损伤中观察的结果一致，并且与SCI后神经细胞膜PAF R数目减少具有一致性8。以上结果的产生一方面可能是因脊髓原发性损伤造成组织内神经元和神经胶质细胞数目减少，而PAF R主要表达于两者表面，故同体积组织块内PAF R mRNA总体表达量减少;另一方面可能与基因转录抑制因子的调控作用抑制了基因转录，显著下调PAF R mRNA表达有关。金纳
14、多与补阳还五汤可在此基础上，继续降低SCI脊髓组织PAF R mRNA的表达量。其机理可能为金纳多中的有效活性成分银杏萜内酯是天然的PAF R特异性拮抗剂。而补阳还五汤是由黄芪、当归尾、赤药等中药配伍组成的复方制剂，方中各单味药中的活性成分如川芎中的川芎嗪13、红花中的红花黄色素14、当归中的阿魏酸15、赤芍中的赤芍甙16等，可多途径阻断PAF的合成代谢及受体活性而发挥生物拮抗效应。补阳还五汤除具有降低PAF含量及PAF R活性与表达的作用外，还具有抑制其他炎性细胞因子如白介素 1、肿瘤坏死因子 、内皮素等促进PAF生成的作用，其拮抗PAF的作用是以其所含多种活性成分通过多途径、多靶点的拮抗机
15、制而产生的整体调节作用;两者可能通过与PAF竞争结合位点，抑制PAF与其受体结合，使PAF被降解;并发出抑制性信号，减少PAF R mRNA的表达量，进而减少PAF R数目，阻断PAF对脊髓组织的后续损害效应，这与受体调节机制中特异性受体拮抗剂能够降低相应受体mRNA的表达，并下调受体数目的文献报道一致17。补阳还五汤抑制PAF R mRNA表达的具体作用机制有待进一步探讨。【参考文献】 1王先敏,纪宁.补阳还五汤的现代研究及临床应用概况J.新疆中医药,2001,19（3）:80. 2肖建如,赵定麟,曾华武,等.脊髓损伤后脊髓神经细胞膜PAF受体特性的变化J.中国应用生理学杂志,1996,12
16、（3）:259. 3肖建如,赵定麟,曾华武,等.脊髓损伤组织血小板活化因子变化与脊髓水肿的关系J.中华创伤杂志,l995,11（6）:332. 4Wrathall J R，Pettegrew R K，Harvey F.Spinal cord contusion in the rat：production of graded，reproducible，injury groupsJ.Exp Neurol，1985，88（1）:108. 5张继平，张玉萍，文凤妮，等.补阳还五汤对家兔血小板活化因子受体活性的影响J.中医杂志,1998,39（10）:621. 6方思伟,李麟仙,王子灿.沙土鼠及大鼠局部
17、脑缺血血小板活化因子的变化J.中国病理生理杂志，1999，15（5）:392. 7Brewer C,Bonin F,Bullock P,et al.Platelet activating factor induced apoptosis is inhibited by ectopic expression of the platelet activating factor G protein coupled receptorJ.J Neurochem，2002，82（6）:1502. 8白文婷,陈立杰.大鼠脑缺血再灌注PAF、PAF受体基因表达的变化J.卒中与神经疾病，2005，12（2）:8
18、4. 9肖建如,赵定麟.脊髓损伤后脊髓神经细胞膜PAF受体特性的变化J.中国应用生理学杂志，1996，12（3）：259. 10Xiao J,Zhao D,Jia L.Effect of platelet activating factor receptor at spinal cord neurocyte membrane on secondary damage after spinal cord injuryJ.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，1996，6（2）:120. 11冯作化.医学分子生物学M.北京:人民卫生出版社,2005:110-113. 12Zhang X,Pa
19、n X L,Liu X T,et al.Down regulation of platelet activating factor receptor gene expression during focal reversible cerebral ischemia in ratsJ.Neurochem Res，2007，32（3）:451. 13吴洪华,杨成,石增立,等.川芎嗪对缺氧缺血性脑损伤炎症细胞因子作用的实验研究J.滨州医学院学报，2007，30（3）:161. 14王玉芹,杨树东.红花黄色素对PAF介导的中性粒细胞功能的影响J.北京中医药大学学报，2000，23（4）:21. 15孙云,卞如濂.血小板活化因子诱发豚鼠气道高反应性及阿魏酸钠对其的影响J.中国药理学通报，1996，12（6）:518. 16魏晓,朱德增,龚燕芳,等.芍药甙对急性坏死性胰腺炎大鼠NF Bp65及细胞因子表达的影响J.胰腺病学，2007，7（3）:184. 17席宏杰,刘晶,岳子勇,等.MK 801对吗啡戒断大鼠中枢NMDA14受体mRNA表达的影响J.国际麻醉学与复苏杂志，2006，27（4）:218.
