补阳还五汤对脊髓损伤大鼠脊髓组织血小板活化因子受体mRNA表达的影响Word下载.docx
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d-1)、金纳多组(剂量为45.5mg·
d-1);
采用Allens法复制中度SCI模型,造模成功后观察1周;
连续给药2周后,取各组脊髓组织,采用实时逆转录聚合酶链反应(RTPCR)法检测各组脊髓组织PAFRmRNA表达水平。
[结果]模型组大鼠脊髓组织PAFRmRNA表达显著降低(P0.01);
补阳还五汤组及金纳多组均可抑制脊髓组织PAFRmRNA表达,与模型组比较差异有显著性意义(P0.01),而两给药组之间比较无显著性差异(P0.05)。
[结论]补阳还五汤对损伤脊髓的保护作用可能与其能减少PAFR数目,抑制PAFR活性,从而阻断PAF发挥损伤效应有关。
【关键词】补阳还五汤/药理学脊髓损伤/中药疗法基因表达调控疾病模型动物大鼠 补阳还五汤已广泛用于神经损伤后的保护与修复治疗,如脑梗死、外伤性截瘫、周围神经损伤等[1]。
血小板活化因子(plateletactivatingfactor,PAF)是体内一种重要的脂质类生物信息分子和重要的炎性细胞因子,脊髓损伤(spinalcordinjury,SCI)后PAF含量明显升高,通过与其特异性受体(receptor,R)结合,引发脊髓的继发性病理损伤[2-3]。
本文采用实时逆转录聚合酶链反应(RTPCR)方法,观察了补阳还五汤治疗大鼠SCI后,脊髓组织内血小板活化因子受体(PAFR)mRNA表达水平的变化,旨在探讨补阳还五汤对引发脊髓继发性损伤的靶点之一--PAF的阻断作用机制。
现将结果报道如下。
1材料与方法 1.1药物补阳还五汤由广东一方制药有限公司提供的中药配方颗粒严格遵照原方配比而成,含生黄芪120g,当归尾6g,赤芍4.5g,地龙、川芎、桃仁、红花各3g,实验大鼠按照3倍临床等效剂量40g/kg灌胃给药。
金纳多(银杏叶提取物)为德国威玛舒培博士药厂产品(批号:
8781006),实验大鼠按照3倍临床等效剂量45.5mg/kg给药。
1.2仪器及试剂Ultrospec4300紫外可见分光光度计为瑞士安法玛西亚公司产品;
ABI7300PCR扩增仪为美国应用生物系统(ABI)公司产品;
大鼠PAF受体基因引物和探针由广州市达晖生物科技有限公司设计合成,引物序列为:
(上游)5TGAGCATTATGAGCCATACAGTGT3,引物长度24bp,解链温度(meltingtemperature,Tm)59.1℃;
(下游)5TGATGACCATGTTGCAGTAGAAGA3,引物长度24bp,Tm58.9℃;
产物长度为107bpcDNA。
探针序列:
FAMTCCTTGTCGTCCACATCTTCATCACCTCCTGTAMRA,探针长度31bp,Tm69℃;
RNA的提取及逆转录试剂由上海生工提供;
DNA扩增试剂及标准品由广州市达晖生物科技有限公司提供;
其他试剂均为国产分析纯。
1.3实验动物及造模SPF级Wistar大鼠76只,雌雄各半,体质量(195±
10)g,由南方医科大学实验动物中心提供,合格证号:
SCXK(粤)20060015/2006B023/2006A052;
在南方医科大学实验动物中心实验室进行实验,温度(23±
5)℃,湿度(60±
15)℃标准环境[动物设施合格证号:
SYXK(粤)20060074]。
以100mg/L水合氯醛3.5g/kg腹腔注射麻醉大鼠,背部剪毛,将动物俯卧固定于手术台上,100mg/L的活力碘消毒,以T12棘突为中心取背部正中切口,长约3cm,显露T11L1棘突及椎板。
用特制的手术钳咬除T11下半、T12全椎板及L1上半椎板,以脊髓为中心显露直径约2.8mm圆形区,在硬膜表面垫一弯曲度与脊髓表面一致的塑料垫片。
采用Allens打击法[4],用直径约2.4mm重5g的圆柱状重锤从10cm高处,沿细玻璃导管垂直下落,打击垫片致T12脊髓急性挫伤,致伤力为5×
10gcf(gram·
cm·
force),逐层缝合伤口。
造模完成后,每天肌注青霉素钠2万U,1次/d,单笼管理饮食,每8h按摩膀胱排尿,并用碘伏消毒伤口,直至膀胱功能恢复。
模型大鼠观察1周,伤情稳定后,模型组进行随机化分组。
1.4动物分组及给药76只Wistar大鼠先按性别分层,然后根据体质量采用随机数字表法分组,其中正常组16只,其他实验大鼠采用Allens打击法制作中度SCI模型。
造模完成后观察1周,待伤情稳定后,参照改良的Tarlov评分标准[4],选择后肢运动功能障碍评分为2~3分的模型大鼠48只,随机分为模型组、补阳还五汤组、金纳多组,各组分别给予蒸馏水、补阳还五汤(剂量为40g·
d-1)、金纳多水溶液(剂量为45.5mg·
d-1),正常组给予蒸馏水;
给药体积均为20mL/kg,用药2周结束实验。
1.5脊髓组织PAFRmRNA表达测定给药结束后,迅速切取脊髓损伤段上下约1cm大小的脊髓组织,置于Eppendorf管中,-70℃冰箱保存。
采用RTPCR法检测脊髓组织PAFRmRNA表达水平。
1.5.1总RNA的提取电子天平称取脊髓组织50mg,严格按照RNA提取说明书提取总RNA,-20℃冰箱保存。
紫外可见分光光度计观察D260/D280的比值,检测样品中RNA纯度;
普通琼脂糖凝胶电泳后紫外灯观察28s条带与18s条带亮度比,检测RNA的完整性。
1.5.2mRNA的逆转录及cDNA的荧光定量扩增严格按照说明书进行操作。
PCR反应总体积为50μL,反应条件:
93℃预变性2min,循环参数:
93℃变性45s,55℃退火延伸1min,10个循环(未采集荧光);
93℃变性45s,55℃退火延伸1min,30个循环(采集荧光)。
1.6统计学方法应用SPSS10.0软件进行分析,采用单因素方差分析,多重比较用SNKq检验。
2结果 2.1总RNA纯度及mRNA的完整性鉴定根据测定要求,在mRNA分析前,需对所有样品进行总RNA纯度及mRNA的完整性鉴定,达到规定要求后才能进行下一步测定。
本研究采用紫外可见分光光度计对总RNA的纯度进行鉴定,D260/D280比值在1.8~2.0之间;
经琼脂糖凝胶电泳后,紫外灯下观察可见28s条带及18s条带,两条带亮度比约为2:
1,总RNA的纯度及完整性满足实验要求,电泳鉴定图如图1所示。
2.2各组大鼠脊髓组织PAFRmRNA表达量比较表1结果显示,SCI模型大鼠PAFRmRNA表达显著降低(P0.01),补阳还五汤组与金纳多组均可抑制脊髓组织PAFRmRNA表达,与模型组比较差异有显著性意义(P0.01),两给药组之间比较无显著性差异(P0.05)。
3讨论 补阳还五汤出自晚清·
王清任《医林改错》,是益气活血之名方,由生黄芪、当归尾、川芎、赤芍、地龙、桃仁、红花组成,具有益气活血通络之效。
临床发现其具有中枢神经保护作用,现已广泛应用于中风后遗症、脑血管疾病等中枢神经系统损伤后的治疗[1]。
PAF被认为是SCI后继发性病理损伤的重要损害因子之一,体外实验已证明[5]补阳还五汤可抑制PAFR活性。
SCI后,PAF释放成倍增加,可引起强烈的炎症反应,并可通过促进花生四烯酸代谢为血栓素B2、前列腺素和白三烯,三者可引发炎症的级联放大反应[6];
PAF可通过收缩血管、诱导血小板聚集和形成血栓等作用,使脊髓微血管闭塞和痉挛,导致脊髓损伤部位延迟性缺血;
PAF还可作为一种生物活性磷脂参与神经细胞兴奋性毒性凋亡[7]。
PAF是通过与其特异性受体结合而发挥生物效应,故减少其受体数目、抑制其受体活性,是阻断PAF发挥损伤效应的关键环节之一。
PAFR广泛存在于中枢神经系统组织细胞的表面,主要表达于小胶质细胞及神经元的表面;
病理情况下,受体处于何种状态取决于配体浓度和配体增加的速度;
快速给予配体时,可迅速激活受体;
但配体长时间作用后受体发生去敏感化,引起受体数目、亲和力下调及受体活性的改变[8]。
有学者发现脊髓组织内含有高、低两种亲和性不同的PAFR,脊髓病理损伤过程中,损伤区神经细胞膜上PAF高、低亲和性受体对PAF的亲和性均明显增加,而PAFR数目却明显减少,这种变化可能由于SCI初期内源性PAF显著增多,迅速与其受体结合,使大量静息状态的受体被激活,诱导增强了PAF与其受体的结合能力,亲和力增加;
PAFR在PAF持续高水平作用下,通过蛋白激酶C途径激活磷酸依赖性蛋白激酶C,蛋白激酶C将PAFR不可逆地磷酸化,从而发生受体失敏,表现为下调;
同时,脊髓神经细胞产生受体介导性内吞,PAFR在溶酶体内降解,也导致受体数量减少[9-10]。
从基因调控角度分析,增多的PAF与相应受体特异结合后,将微环境变化的信息通过胞内信号转导传递到细胞核内,激活一类细胞核内蛋白因子,即反式作用因子,其结构上含有与DNA结合的结构域,可以特异性识别并结合DNA序列,阻遏PAFR基因的表达,从而减少神经细胞膜PAFR数目,受体数目逐渐被向下调节[11]。
本研究结果发现,模型组脊髓组织PAFRmRNA表达量显著低于正常组,与Zhang等[12]在中枢神经系统缺血再灌注损伤中观察的结果一致,并且与SCI后神经细胞膜PAFR数目减少具有一致性[8]。
以上结果的产生一方面可能是因脊髓原发性损伤造成组织内神经元和神经胶质细胞数目减少,而PAFR主要表达于两者表面,故同体积组织块内PAFRmRNA总体表达量减少;
另一方面可能与基因转录抑制因子的调控作用抑制了基因转录,显著下调PAFRmRNA表达有关。
金纳多与补阳还五汤可在此基础上,继续降低SCI脊髓组织PAFRmRNA的表达量。
其机理可能为金纳多中的有效活性成分银杏萜内酯是天然的PAFR特异性拮抗剂。
而补阳还五汤是由黄芪、当归尾、赤药等中药配伍组成的复方制剂,方中各单味药中的活性成分如川芎中的川芎嗪[13]、红花中的红花黄色素[14]、当归中的阿魏酸[15]、赤芍中的赤芍甙[16]等,可多途径阻断PAF的合成代谢及受体活性而发挥生物拮抗效应。
补阳还五汤除具有降低PAF含量及PAFR活性与表达的作用外,还具有抑制其他炎性细胞因子如白介素1、肿瘤坏死因子α、内皮素等促进PAF生成的作用,其拮抗PAF的作用是以其所含多种活性成分通过多途径、多靶点的拮抗机制而产生的整体调节作用;
两者可能通过与PAF竞争结合位点,抑制PAF与其受体结合,使PAF被降解;
并发出抑制性信号,减少PAFRmRNA的表达量,进而减少PAFR数目,阻断PAF对脊髓组织的后续损害效应,这与受体调节机制中特异性受体拮抗剂能够降低相应受体mRNA的表达,并下调受体数目的文献报道一致[17]。
补阳还五汤抑制PAFRmRNA表达的具体作用机制有待进一步探讨。
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