1、我国广东地区SARS冠状病毒分离株病原学的基础研究第一军医大学热带军队卫生学系第一军医大学热带军队卫生学系中山大学中山医学院中山大学中山医学院 我国广东地区我国广东地区SARS-CoV的病原学研究的病原学研究 SARS-SARS-SARS-SARS-CoVCoVCoVCoV的分离培养与鉴定的分离培养与鉴定的分离培养与鉴定的分离培养与鉴定 套式套式套式套式RT-PCRRT-PCRRT-PCRRT-PCR检测方法建立检测方法建立检测方法建立检测方法建立 SARS-SARS-SARS-SARS-CoVCoVCoVCoV细胞培养模型建立及应用细胞培养模型建立及应用细胞培养模型建立及应用细胞培养模型建立
2、及应用 SARS-SARS-SARS-SARS-CoVCoVCoVCoV抗体产生动力学的研究抗体产生动力学的研究抗体产生动力学的研究抗体产生动力学的研究 一一一一.广东地区广东地区广东地区广东地区SARS-SARS-CoVCoV的分离培养与鉴定的分离培养与鉴定的分离培养与鉴定的分离培养与鉴定第一阶段：第一阶段：第一阶段：第一阶段：对已知的重大传染病的排查对已知的重大传染病的排查对已知的重大传染病的排查对已知的重大传染病的排查第二阶段：第二阶段：第二阶段：第二阶段：衣原体感染的研究衣原体感染的研究衣原体感染的研究衣原体感染的研究第三阶段：第三阶段：第三阶段：第三阶段：SARS-SARS-CoVC
3、oV 的的的的研究研究研究研究第一阶段：第一阶段：对重大传染病的排查对重大传染病的排查排除：排除：炭疽、鼠疫、军团病、禽流感、炭疽、鼠疫、军团病、禽流感、流感、流感、金葡菌感染、厌氧菌感染金葡菌感染、厌氧菌感染 腺病毒、汉坦病毒感染腺病毒、汉坦病毒感染 衣原体感染衣原体感染 肺炎支原体感染肺炎支原体感染 立克次体、真菌感染等立克次体、真菌感染等Patient 1Patient 1Patient 1Patient 1 第二阶段：第二阶段：第二阶段：第二阶段：衣原体感染的研究衣原体感染的研究在尸检病人肺组织中发现衣原体样颗粒在尸检病人肺组织中发现衣原体样颗粒在尸检病人肺组织中发现衣原体样颗粒在尸检
4、病人肺组织中发现衣原体样颗粒证明证明证明证明SARSSARS病人可以有衣原体感染病人可以有衣原体感染病人可以有衣原体感染病人可以有衣原体感染Patient 2Patient 2Patient 2Patient 2第三阶段第三阶段第三阶段第三阶段:SARS-SARS-CoVCoV 的研究的研究的研究的研究1.1.1.1.SARS-SARS-SARS-SARS-CoVCoVCoVCoV 的分离培养与鉴定的分离培养与鉴定的分离培养与鉴定的分离培养与鉴定 容许性细胞容许性细胞容许性细胞容许性细胞 Vero E6Vero E6Vero E6Vero E6、Vero Vero Vero Vero、MDCK
5、 MDCK MDCK MDCK、人胚肺细胞人胚肺细胞人胚肺细胞人胚肺细胞 形态学鉴定形态学鉴定形态学鉴定形态学鉴定 鉴定方法鉴定方法鉴定方法鉴定方法 免疫学鉴定免疫学鉴定免疫学鉴定免疫学鉴定 RT-PCRRT-PCRRT-PCRRT-PCR 序列测定序列测定序列测定序列测定 毒株编号毒株编号毒株编号毒株编号 ：GD322GD322GD322GD322、GDA14GDA14GDA14GDA14免免免免疫疫疫疫荧荧荧荧光光光光试试试试验验验验 超薄切片电镜显示超薄切片电镜显示超薄切片电镜显示超薄切片电镜显示VeroE6VeroE6细胞内的细胞内的细胞内的细胞内的SARSSARS冠状病毒冠状病毒冠状
6、病毒冠状病毒1.1.Bar=100nm2.Bar=80nmBar=100nm2.Bar=80nmM:DNAMarkerDL2000M:DNAMarkerDL2000（TaKaTaTaKaTa）Lane1Lane1阴性对照阴性对照阴性对照阴性对照Lane2GD322Lane2GD322培养上清扩增产物培养上清扩增产物培养上清扩增产物培养上清扩增产物Lane3Lane3咽拭子标本扩增产物咽拭子标本扩增产物咽拭子标本扩增产物咽拭子标本扩增产物M 1 2 3M 1 2 32000100075500250100SARSSARSSARSSARS序列测定结果（序列测定结果（序列测定结果（序列测定结果（181
7、38-1832718138-1832718138-1832718138-18327）二、套式二、套式RT-PCRRT-PCR检测方法的建立检测方法的建立引引引引物物物物：外外外外引引引引物物物物位位位位于于于于SARSSARS冠冠冠冠状状状状病病病病毒毒毒毒Tor2Tor2株株株株18138-1832718138-18327位。内引物位于位。内引物位于位。内引物位于位。内引物位于Tor2Tor2株株株株18186-1829418186-18294位。位。位。位。标标标标本本本本处处处处理理理理及及及及RNARNA的的的的提提提提取取取取：使使使使用用用用QIAampQIAamp ViralVi
8、ral RNARNAMiniMiniKitKit，从从从从160160ll尸尸尸尸解解解解肺肺肺肺组组组组织织织织处处处处理理理理液液液液、咽咽咽咽拭拭拭拭子子子子、嗽嗽嗽嗽口口口口水或病毒培养上清中提取水或病毒培养上清中提取水或病毒培养上清中提取水或病毒培养上清中提取RNARNA。RT-PCRRT-PCR：逆逆逆逆转转转转录录录录和和和和第第第第一一一一次次次次PCRPCR使使使使用用用用QIAGENQIAGENOneStepOneStep RT-PCRKitRT-PCRKit。PCRPCR条件条件条件条件1 1 反反反反应应应应条条条条件件件件为为为为45454545，30303030mi
9、nminminmin；95959595，3min3min3min3min。/9510s/9510s/9510s/9510s；60606060，10s10s10s10s（drop drop drop drop 1111）；72727272，30s30s30s30s。共共共共10101010次次次次循循循循环环环环。/95/95/95/95，10101010s s s s；56565656，10s10s10s10s；72727272，30s30s30s30s。共共共共40404040次循环。次循环。次循环。次循环。/72/72/72/72，7 7 7 7minminminmin。取取取取RT-PC
10、RRT-PCRRT-PCRRT-PCR产产产产物物物物，稀稀稀稀释释释释100100100100倍倍倍倍。取取取取稀稀稀稀释释释释PCRPCRPCRPCR产产产产物物物物3 3 3 3llll，10PCR 10PCR 10PCR 10PCR 缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液3 3 3 3llll，引引引引物物物物BNIinSBNIinSBNIinSBNIinS和和和和BNIinASBNIinASBNIinASBNIinAS各各各各1 1 1 1llll，TaKaRaTaKaRaTaKaRaTaKaRa TaqTaqTaqTaqTMTMTMTM聚聚聚聚合合合合酶酶酶酶1 1 1 1U U U U，101
11、01010M M M M dNTPsdNTPsdNTPsdNTPs 1 1 1 1llll，补补补补水水水水至至至至总总总总体体体体积积积积30 30 30 30 l l l l进进进进行行行行PCRPCRPCRPCR扩扩扩扩增增增增。反反反反 应应应应 参参参参 数数数数 为为为为：95959595，3 3 3 3minminminmin。/9510s/9510s/9510s/9510s；60606060，10s10s10s10s（drop drop drop drop 1111）；72727272，20s20s20s20s。共共共共10101010次次次次循循循循环环环环。/95/95/9
12、5/95，10101010s s s s；56565656，10s10s10s10s；72727272，20s20s20s20s。共共共共20202020次循环。次循环。次循环。次循环。/72/72/72/72，7 7 7 7minminminmin。PCRPCR条件条件条件条件2 2 第第第第一一一一次次次次PCRPCRPCRPCR的的的的退退退退火火火火温温温温度度度度改改改改为为为为45454545度度度度，第第第第2 2 2 2次次次次PCRPCRPCRPCR的的的的退退退退火火火火温温温温度度度度改改改改为为为为50505050度，均不采用降落度，均不采用降落度，均不采用降落度，均不
13、采用降落PCRPCRPCRPCR的方法，其余同条件的方法，其余同条件的方法，其余同条件的方法，其余同条件1 1 1 1。M12345678MDNAMarkerDL2000(TaKaTa)Lane1尸解肺组织外引物扩增产物尸解肺组织外引物扩增产物Lane2尸解肺组织内引物扩增产物尸解肺组织内引物扩增产物Lane3咽拭子标本外引物扩增产物咽拭子标本外引物扩增产物Lane4咽拭子标本内引物扩增产物咽拭子标本内引物扩增产物Lane5嗽口水标本外引物扩增产物嗽口水标本外引物扩增产物Lane6嗽口水标本内引物扩增产物嗽口水标本内引物扩增产物Lane7培养物上清外引物扩增产物培养物上清外引物扩增产物Lane
14、8培养物上清内引物扩增产物培养物上清内引物扩增产物20002000200020001000100010001000750750750750500500500500250250250250100100100100SARSSARSSARSSARS序列测定结果（序列测定结果（序列测定结果（序列测定结果（18186-1829418186-1829418186-1829418186-18294）三、三、SARS-COVSARS-COV细胞培养模型的建立和初步应用细胞培养模型的建立和初步应用Vero E6 Vero E6 Vero E6 Vero E6 正常细胞（正常细胞（正常细胞（正常细胞（a)a)a)
15、a)与感染与感染与感染与感染SARS-SARS-SARS-SARS-CoVCoVCoVCoV GD322GD322GD322GD322株后病变细胞株后病变细胞株后病变细胞株后病变细胞(b)b)b)b)1.1.1.1.SARS-COVSARS-COV细胞培养模型细胞培养模型 56 2056 20minmin 60 30min 60 30min 100 10min 100 10min 紫外线紫外线 2020minmin 杀灭病毒杀灭病毒杀灭病毒杀灭病毒2 2 2 2物理因素对物理因素对物理因素对物理因素对SARSSARSSARSSARS病毒的影响病毒的影响病毒的影响病毒的影响 室温室温 2424h
16、 h 37 24h 37 24h 病毒仍具感染性病毒仍具感染性 4 724 72h h 重组人复合干扰素重组人复合干扰素重组人复合干扰素重组人复合干扰素对对对对Vero E6Vero E6Vero E6Vero E6的的的的细胞毒性细胞毒性细胞毒性细胞毒性浓度浓度浓度浓度各瓶细胞死亡率（各瓶细胞死亡率（各瓶细胞死亡率（各瓶细胞死亡率（1010-2-2）X X sPsP值值值值（u/mlu/ml）85.03.54.13.64.45.64.3785.03.54.13.64.45.64.37 0.830.830.050.0546.44.34.64.55.26.15.1846.44.34.64.55.26.15.18 0.890.890.050.0523.25.34.77.13.76.85.1323.25.34.77.13.76.85.13 1.581.580.050.0514.46.06.34.44.25.05.0414.46.06.34.44.25.05.04 0.870.870.050.050.53.55.86.45.24.33.84.830.53.55.86.45.24.33.84.8
