1、总论南京中医药大学中药化学实验（双语）中药化学实验编委名单主编：皮文霞，李祥编委：尹莲，陈佩东，陈勇， 邱蓉丽，王洪兰南京中医药大学药学院中药化学教研室一、总论（3）中药化学成分预试验（3）二、各论（7）实验一、黄藤中巴马汀的提取分离鉴定（7）实验二、大黄中大黄素的提取分离鉴定（11）实验三、槐米中芦丁的提取分离鉴 （15）实验四、陈皮挥发油的提取鉴定（20）一、General.（22）The pre-test of chinese medicine chemical composition.（22）Experiment I Extraction, Isolation Hydrogenatio
2、n of Palmatine in Daemonorops margaritae（26）Experiment II Extraction, Isolation&Identification of Free Anthraquinone in Rhei Radix et Rhizoma.（30）Experiment Extraction, Isolation and Identification of Rutin.（34）Experiment Extraction and Identification of Essential Oil in Citri Reticulatae Percarpium
3、（39）一、总论 中药化学的研究是从有效成分或生物活性化合物的提取、分离工作开始。在提取之前，应对所用材料的基元（种、属、学名）、产地、药用部位等进行考查，并系统查阅文献，以充分利用、了解前人的经验，以便少走弯路。 目的物为已知成分或已知化学结构类型，这种情况工作比较简单，查阅有关资料，再根据本人的实验条件加以选用。 未知成分的提取，只能是就预先确定的目标，在适当的活性测试体系指导下，进行活性成分或有效部位的跟踪分离。 中药中所含的化学成分较为复杂，在提取分离某种中药成分之前，一般可先进行简单的预试验，初步了解其中可能含有哪些类型的成分，以便对今后的提取分离工作提供一定的参考。预试方法一般可分
4、为二大类：一类是单项预试验，即根据需要，重点检查某类成分，如寻找含生物碱类成分，仅需要进行生物碱的定性反应，以检查生物碱的存在与否；另一类是系统预试验，即选用简单的定性方法对中药中各类成分进行较为全面的试验。预试验的结果只能作为参考，因为有些定性反应常为几类成分所共有，有时又可由于成分间的相互干扰或由于定性反应本身的局限性（如反应的灵敏度较差），故还须再进行薄层层析或纸层析，才能进一步作出较为恰当的判断。中药化学成分的预试验 系统预试法应用一些简单的定性试验，对中药中所含各类化学成分作全面的检查。 单项预试验根据需要，有重点的检查某类成分或某类药效成分。 方法：试管反应+薄层层析检查（1）预试
5、溶液的制备1、水提取液糖、多糖、有机酸、皂苷、酚类、鞣质、氨基酸、多肽、蛋白质等。2、乙醇提取液酚类、鞣质、有机酸、香豆素、强心苷、黄酮、蒽醌、甾体等。3、5%酸-乙醇提取液生物碱4、石油醚提取液甾体、萜类、脂肪油等。（2）各类成分的检查1、生物碱（1）沉淀反应碘化汞钾试剂 白色或浅黄色沉淀 碘化铋钾试剂 橘红色沉淀 碘-碘化钾试剂 浅棕或暗棕色沉淀 硅钨酸试剂 浅黄或黄棕色沉淀 磷钨酸试剂 浅黄色沉淀 磷钼酸试剂 白色或淡黄色沉淀 苦味酸试剂 黄色结晶或非晶形沉淀 鞣酸试剂 棕黄色沉淀 氯化金试剂 黄色结晶 氯化铂试剂 白色结晶 雷氏铵盐 红色无定形沉淀（2）薄层层析检查：吸附剂碱性氧化铝（
6、级，干法铺板） 硅胶G（稀碱湿法铺板） 展开剂氯仿；甲醇 显色UV；碘化铋钾2、氨基酸、多肽、蛋白质（1）加热沉淀试验：加热煮沸 浑浊或沉淀 （蛋白质） +5%H2SO4（不加热） 浑浊或沉淀 （2）双缩脲反应：+40%NaOH，1%CuSO4 紫色、红色、或紫红色（多肽、蛋白质）（3）茚三酮反应：+0.2%茚三酮试液 蓝或蓝紫色（氨基酸、多肽、蛋白质）（4）吲哚醌反应：+吲哚醌试液 各种颜色（氨基酸）（5）Millon反应：+Hg，H2NO2 红色（蛋白质分子中有酪氨酸组成）（6）Hopkins-Cole反应：+乙醛酸，浓硫酸 各色（蛋白质分子中有色氨酸组成）（7）氨基酸的薄层层析检查：吸附
7、剂硅胶G 展开剂n-BuOH，n-BuOH：HAc：H2O 显色剂0.25%茚三酮试液 紫红色斑点3、有机酸（1）PH试纸检查（2）溴酚兰试液：喷洒 蓝色背景黄色斑点（3）薄层层析检查：吸附剂硅胶G或酸性氧化铝 展开剂C6H6：EtOH 显色剂0.1%溴酚兰试液 黄色4、酚类和鞣质（1）FeCI3试剂：+1%FeCI3试液 蓝、暗绿或蓝紫色（2）三氯化铁-铁氰化钾试剂：喷洒 蓝色斑点（3）香草醛-盐酸试剂：喷洒 红色（间苯二酚、间苯三酚）（4）重氮盐试剂：+对硝基苯胺、亚硝酸钠 红色（5）薄层层析检查：吸附剂硅胶G或纤维素 展开剂n-BuOH：HAc：H2O；15%HAc 显色剂0.1%FeC
8、I3试液 1%三氯化铁-1%铁氰化钾试液 蓝、绿或黑色5、糖和苷（1）菲林试剂：+硫酸铜、酒石酸钾钠砖红色沉淀（还原糖）（2）Molish反应：+-萘酚-浓硫酸 紫红色环（3）银镜反应：+0.1N硝酸银、5N氨水 银褐色（还原糖）（4）薄层层析检查：吸附剂硅胶G或纤维素 展开剂n-BuOH：HAc：H2O；15%HAc 显色剂苯胺-邻苯二甲酸6、皂苷（1）泡沫试验：振摇 大量持续性泡沫（2）溶血试验：+2%红血球悬浮液 溶血（3）Lieberman-Burchard反应：+醋酐-浓硫酸 紫红色（三萜皂苷） 黄-红-紫-绿（甾体皂苷）7、甾体（1）Lieberman-Burchard反应：+醋酐
9、-浓硫酸 黄-红-紫-绿（2）氯仿-浓硫酸反应：+氯仿-浓硫酸 氯仿层 红或青色 硫酸层 绿色荧光（3）五氯化锑或三氯化锑反应：+SbCI3或SbCI5 红色（4）薄层层析检查：吸附剂中性氧化铝或硅胶G 展开剂C6H6-MeOH；CHCI3-MeOH 显色剂10%磷钼酸 蓝-蓝紫色 5%三氯化锑试液 红、棕红或绿色8、黄酮（1）盐酸-镁粉反应：+HCI-Mg 红色（2）三氯化铝反应：+AICI3 黄色（3）浓氨水反应：+NH3 亮黄或橙色（4）薄层层析检查：吸附剂聚酰胺或硅胶G 展开剂MeOH-H2O；EtOH-H2O 显色剂UV 亮黄色或黄绿色荧光 1%三氯化铝试液 亮黄色9、香豆素、内酯（
10、1）开闭环反应：+1%NaOH 澄清 +2%HCI 浑浊（2）异羟肟酸铁反应：+7%盐酸羟胺、10%KOH +稀HCI、1%FeCI3 红色（3）重氮盐试剂：+对硝基苯胺、亚硝酸钠 红色（4）薄层层析检查：吸附剂酸性硅胶G或硅胶G 展开剂甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5:4:1) 显色剂UV 蓝色荧光 异羟肟酸铁试液 红色10、强心苷（1）Kedde试剂：+3,5-二硝基苯甲酸试液 紫红色（2）Baljet试剂：+碱性苦味酸试液 橙或橙红色（3）Legal试剂：+亚硝酰铁氰化钠 紫红色（4）K-K反应：+FeCI3/冰HAc、浓H2SO4 上层绿蓝色 （2-去氧糖） 界面红棕色（5）薄层层析检查：吸附
11、剂硅胶G或中性氧化铝 展开剂n-BuOH：HAc：H2O（4:1:5） 显色剂碱性3,5-二硝基苯甲酸试液 紫红色 碱性苦味酸试液 橙红色11、蒽醌（1）碱液反应：+10%NaOH 红色 +H2O 红色不褪 +H+ 红色褪去（2）醋酸镁反应：+1%MgAc2 红色（3）薄层层析检查：吸附剂硅胶G 展开剂Pet：EtOAc 显色剂UV 黄色荧光 5%NaOH 红色12、挥发油、油脂 (1)油斑检查：油斑挥发 挥发油； 油斑不消失 油脂或类脂(2)磷钼酸反应：喷洒5%磷钼酸试液 蓝色（油脂、三萜、甾醇）实验一 黄藤中的掌叶防己碱的提取、氢化和鉴定（一）巴马汀的提取一、实验目的1、掌握渗漉提取方法2
12、、得到巴马汀粗品3、学习生物碱的定性鉴别方法二、实验原理黄藤中巴马汀（掌叶防己碱，Palmatine）的含量为4%，是季铵型生物碱，可溶于水、醇中，盐酸盐的溶解度低，有机酸盐的溶解度很高，因此，用1%的醋酸溶液渗漉提取巴马汀。用盐析的方法，使巴马汀在水中的溶解度降低而沉淀出来。 Palmatine三、实验方法 50g黄藤粉 25ml 1%HAc湿润 15min 500ml 1%HAc渗漉（1-2d/s） 渗漉液 10ml渗漉液 其余渗漉液 10%NaCl，搅拌溶解 6N NaOH 调PH 10 沉淀反应 静置，抽滤 巴马汀粗品 反应试剂：碘化铋钾 碘-碘化钾沉淀 鞣酸 硅钨酸 苦味酸四、注意事
13、项1、湿润目的：避免干药材吸水后溶胀，在渗漉筒中膨胀而使渗漉液难流出；方法：溶剂量为药材的1/2，放置15分钟;程度：湿润后的药材手握成团，放松后松散。2、装筒方法（1）两层小纱布湿润后盖于渗漉筒小孔上，避免紧、大；（2）湿润后的药粉均匀地倒入渗漉筒里，避免松紧不匀；（3）药粉上盖一层滤纸，压上瓶盖，以防药粉翻出，影响提取得率；（4）渗漉筒下端活塞打开，加提取溶剂至满，排除气泡；（5）将活塞关闭5-10分钟，浸泡药粉，再打开渗漉；（6）保持液面高于药粉。3、判断提取完毕的方法（1）渗漉液颜色很浅；（2）渗漉液沉淀反应呈阴性；（3）渗漉液为药粉体积的10倍时，基本渗漉完毕。4、盐析量：固体，为渗
14、漉液体积的10%量。5、调pH：调至pH10，由于有有机酸共存，放置后又回到pH9。6、抽滤：放置一天以上在抽滤，尽量将上清液倒去，否则影响抽滤时间。 7、干燥：抽滤物放入小干燥皿中，写上姓名、班级，统一干燥。8、称重，计算粗制率。五、思考题1、还可用什么方法提取黄藤中生物碱？请设计流程。2、渗漉用的酸水，除醋酸外，还可用什么酸水？3、分离黄藤中的季铵型生物碱，除盐析外还可用什么方法？请设计分离流程图。 （2）巴马汀粗品的制备一、实验目的1、 学习结晶方法2、 得到氯化巴马汀精品二、实验原理利用混合物中各种化合物对某种溶剂溶解度的差别，而使单一成分以结晶状态析出的方法。 巴马汀的盐酸盐在水和醇
15、中溶解度小，易析出黄色针状结晶（m.p.206）。三、实验方法 巴马汀粗品 40ml 80%EtOH，加热溶解15min 趁热抽滤 滤渣 滤液 20ml 80%EtOH 加热溶解，趁热抽滤 重复数次至滤液无色 滤液 6mol.LHCl调pH2，放置析晶，抽滤 氯化巴马汀四、注意事项1、 含巴马汀粗品的滤纸撕碎后同巴马汀放入圆底烧瓶中加热溶解；2、 80%EtOH溶剂量以巴马汀粗品量定，3g巴马汀粗品约75ml 80%EtOH，溶剂量多，则不易析晶；溶剂量多，则结晶杂质多。3、 滤液要趁热抽滤；4、 滤液调pH前若有析晶，需加热溶解；5、 待析晶溶液，应将瓶壁边有沉淀的部分溶解；6、 析晶时间应
16、为一天以上。五、促进析晶的方法1、 将瓶盖打开，挥去部分溶剂；2、 用玻棒擦瓶壁，加速析晶；3、 加晶种加速析晶；4、 延长放置时间或低温放置。六、思考题1、 为什么用HCl调pH值？2、 如何判断结晶的纯度？3、 滤液有析晶时调pH前，会出现什么结果？ （3）巴马汀氢化物的制备一、实验目的1、 学习方法；2、 得到四氢巴马汀二、实验原理 巴马汀 四氢巴马汀（延胡索乙素m.p.146-148）三、实验方法 1g氯化巴马汀 30ml 50%MeOH 加热溶解 溶液 0.81.0g NaBH4（边加边摇至无色或微黄）6mol/LHCl 调pH2，稍加热，分解多余NaBH4，再加NH4OH调pH9，
17、静置，抽滤 沉淀 加20ml 95%EtOH加热（回流）溶解，趁热抽滤 滤液 加12倍量的水，摇匀静置，抽滤 延胡索乙素 四、注意事项1、 NaBH4为强还原剂，避免长时间接触空气及用手接触；2、 加NaBH4时充分摇匀，使反应充分；3、 四氢巴马汀在碱液中易氧化成巴马汀。五、思考题1、 加入NaBH4后，颜色有黄色变无色、溶液变混浊的原因？2、 用6M HCl调反应液Ph2至无气泡产生的原因？此时的溶液呈什么现象？3、 用NH4OH调pH9原因、现象？4、 重结晶时，加入水的原因？ （4）鉴定一、实验目的1、学习生物碱的TLC检识方法2、巴马汀、四氢巴马汀的定性鉴别（TLC、m.p.）二、实
18、验原理用硅胶板进行巴马汀、四氢巴马汀的TLC检识，选用氨熏的方法避免生物碱在硅胶板上易拖尾的现象。三、实验方法 1、TLC点板 氨缸中放5min 展开槽展开 取出察看（可见光、荧光、显色剂）样品：巴马汀、四氢巴马汀的样品及对照品，用乙醇溶解展开剂：氯仿-甲醇（9:1）显色剂：碘化铋钾 2、m.p.：显微熔点仪，记录初始熔化时温度及完全熔化时温度。四、注意事项 1、氨水有刺激性，操作时注意； 2、熔点测定时，样品量要少。五、思考题 1、生物碱在硅胶板上展开为什么会拖尾？ 2、避免生物碱在硅胶板上拖尾的方法有哪些？ 3、如何选择生物碱TLC展开剂？ 4、本实验在可见光和荧光下检识有什么现象？为什么
19、？ 5、熔点测定时，样品量多会对测定结果又什么影响？ 6、从鉴定结果如何判断样品的纯度？ 实验二 大黄中大黄素的提取、分离和鉴定（1） 酸水解一、实验目的1、 酸水解的方法2、 得到大黄酸水解药渣二、实验原理大黄中蒽醌类化合物以结合态和游离态两种形式存在，为得到游离蒽醌类化合物，须先酸水解，使蒽醌类化合物以苷元的形式游离出来。 三、实验方法 10g大黄粉 20%H2SO4直火回流加热1小时，滤布过滤 滤渣 水洗至中性，干燥 滤饼四、注意事项 1、药粉在水洗中性过程中尽量避免损失；2、药渣干燥前要松散；3、水解液酸性强，避免用手直接接触。五、思考题1、酸水加热为什么要用回流装置？2、要得到大黄中
20、的蒽醌苷元，还有什么方法？（2） 总羟基蒽醌苷元的提取一、实验目的1、 学习连续回流提取法2、 得到大黄中总羟基蒽醌苷元提取物二、实验原理苷元为亲脂性成分，故用乙醚提取。三、实验方法 滤饼 置索氏提取器中，加150mlEt2O， 提2.5hr（至提取液近无色） Et2O液（大黄中总羟基蒽醌苷元）四、注意事项1、纸筒的包法：原则是药粉不漏出。2、提取器的装法 （1）纸筒的高度不超过侧管的高度； （2）药粉的高度不超过虹吸管的高度； （3）线头在管内，保持提取器闭封。3、溶剂的加法 50ml由提取器上端倒入，浸泡药粉；100ml倒入平底烧瓶中。4、温度的控制 溶剂蒸汽至冷凝管第二个球处，水浴温度约
21、60。5、实验室禁止明火，实验过程中保持通风，尽量避免乙醚挥出。6、平底烧瓶要干燥。五、思考题1、与回流提取相比，该方法的优点？2、还可选用哪些溶剂提取？3、若平底烧瓶中有水，将会有什么结果？4、为什么温度控制在溶剂蒸汽至冷凝管第二个球处？ （3）pH梯度萃取一、实验目的1、学习pH梯度萃取的方法和原理2、得到大黄素粗品二、实验原理依据大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的酸性强弱不同，采用强弱不同的碱水萃取，得到大黄素。三、实验方法1、分离方法 乙醚液（O） 120ml(40ml3)2.5%NaHCO3 乙醚液（1） NaHCO3液 120ml(40ml3)2.5%Na2CO3 乙
22、醚液（2） Na2CO3液 120ml(40ml3)2.5%Na2CO3 调pH3 沉淀Na2CO3液 乙醚层（3） 100ml（25ml4）0.5%NaOH NaOH 乙醚层（4）2、TLC跟踪检查 硅胶-CMC-Na 展开剂：Pet-EtOAc（7：3） 样品：乙醚液（0-4）四、注意事项1、分液漏斗使用前检查是否漏。2、乙醚提取液倒入分液漏斗中，若有沉淀留在瓶中，用待萃取的碱液洗后再倒入分液漏斗中，直至沉淀全部被溶解。3、产生乳化层，解决的方法是： （1）轻摇（2）长时间静置（3）用电吹风加热（4）玻棒搅动（5）抽滤4、待完全静置分层后放出水层。五、思考题1、萃取时碱水层的颜色？2、比较
23、五中蒽醌类化合物极性大小、酸性大小。3、在TLC中，五种蒽醌类成分Rf值得大小顺序？4、萃取大黄素时，碱水中若含少量乙醚，酸化后能得到沉淀吗？5、判断各种蒽醌类成分分离的依据是什么？6、你能设计出比该方法更完善的实验条件吗？写出实验方法及验证方案。 （4）柱色谱精制大黄素一、实验目的1、学习硅胶柱色谱分离方法2、得到大黄素精品二、实验原理依据大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚极性差异分离。三、实验方法1、装柱方法：100200目硅胶10g，用脱脂棉填柱子底端。要求：均匀，柱面平整紧密无气泡。干法装柱：小漏斗法，下端活塞打开，硅胶均匀地倒入柱中。湿法装柱：硅胶用洗脱剂拌均匀至无气泡，
24、下端活塞打开，倒入柱中。2、加样方法要求：原始色带小，均匀。干法上样：样品用少量丙酮溶解后，加少许（半牛角匙）硅胶拌匀，将丙酮挥尽后上于柱顶端。湿法上样：样品用少量（1ml）洗脱剂溶解，用吸管移入柱顶端。3、洗脱收集：加洗脱剂洗脱，待色带冲下时，用瓶子分段收集。分段标准：（1）色带颜色 （2）1015ml/瓶4、合并浓缩:TLC跟踪检查，合并大黄素液，回收至5ml左右。5、放置析晶四、注意事项1、玻璃器皿干燥，无水；2、装柱时，下端活塞应打开；3、洗脱剂不能低于柱平面。五、思考题1、比较湿法装柱与干法装柱的特点？2、比较湿法上样与干法上样的特点？ (5)鉴 定 一、实验目的 1、葸醌类化合物的
25、颜色反应 2、大黄素熔点的测定 二、实验内容 1、熔点：大黄素(256257) 2、颜色反应：比较大黄素与茜草素的颜色区别(纸片反应) 试剂：NaOH，O5MgAC2三、思考题 l、大黄素、茜草素定性反应后的颜色?结构与呈色的关系? 2、其它鉴别方法 实验三 槐类中芦丁的提取、分离与鉴定 (1)芦丁的提取一、实验目的 1、学习苷类化合物的提取方法 2、得到芦丁粗品二、实验原理 芦丁在热水中的溶解度为1:200，在冷水中的溶解度为1:10000，因此采用热水提取，冷水析出的方法提取得到芦丁。 3、实验方法 20g槐米，研碎 置400ml沸水中，煮1hr，过滤 滤液 滤渣 300ml水煮30min
26、，过滤 滤液 放置，抽滤，干燥 芦丁粗品 四、注意事项 l、开始用沸水提取 2、提取液要趁热过滤 3、提取时要不断补充水分五、思考题 1、苷类化合物提取时应注意什么？ 2、提取液为什么要趁热过滤?3、槐米中的芦丁还能用什么方法提取?各有什么特点?请设计方法验证。(2)芦丁的精制和酸水解一、实验目的 1、芦丁粗品重结晶，得到芦丁精品；2、芦丁酸水解，得到苷元棚皮素精品及糖水解液。二、实验原理 根据芦丁在热水中溶解度大、冷水中溶解度小的性质重结晶。 3、实验方法 芦丁粗品 其余芦丁 1g芦丁 水（1:200）加热溶解 2%H2SO4直火回流 趁热抽滤 加热30min，抽滤 滤液 放置析晶，抽滤 沉
27、淀 滤液（PC） 芦丁 水洗中性，95%EtOH重结晶 滤液 加2-3倍水，静置析晶，抽滤 槲皮素四、思考题 1、芦丁精制时为什么要按1: 200加水? 2、芦丁酸水解时溶液会呈现什么变化?为什么? 3、槲皮素重结晶时，为什么加2-3倍量水?（3)槲皮素五乙酰化物的制备一、实验目的 学习五乙酰化物的制备方法，得到槲皮素的五乙酸化物。二、实验原理试剂：无水吡啶、乙酸酐 3、实验方法 200mg槲皮素 4ml吡啶溶解，5ml乙酸酐 空气冷凝管回流加热30min 100ml冷水 搅拌至油滴消失，白色沉淀产生，抽滤 滤饼 95%乙醇重结晶 槲皮素五乙酰物四、注意事项 1、反应在无水条件下进行，玻璃仪器
28、干燥； 2、反应液迅速倒入冷水中搅拌； 3、注意溶剂的挥发性。五、思考题1、反应为什么在无水条件下进行?2、反应过程中会出现什么现象?为什么?3、加入冷水中的目的?4、还有什么试剂能用于槲皮素五乙酰化物的制备?请设计方案并验证。(4)糖鉴定一、实验目的 学习纸层析鉴定糖种类的方法，确定糖水解液中糖的种类。二、实验原理 1、用Ba(OH)2或BaCO3将酸水解液SO4去除，调PH7； 2、糖的极性差异，Rf值不同，与标准品对照鉴别。3、实验方法1、糖水解液的前处理 20ml上清液 加Ba(OH)2或BaCO3，调PH7，抽滤 滤液 直火加热浓缩 1ml浓缩液 2、PC（圆形滤纸法） 展开剂：n-BuOH-HAc-H20(4:1:1) 显色剂：苯胺-邻苯二甲酸，110oC加热至呈色 标准品：葡萄糖、鼠李糖四、注意事项 1、加Ba(OH)2或BaC03调PH值时，注意不要过量，Ba(OH)2或BaC03在溶液中有 溶解的过程； 2、PC时，注意滤纸不能有折痕，不能用圆珠笔标记。五、思考题 1、比较葡萄糖、鼠李糖Rf值的大小，为什么？2、鉴别苷类化合物的种类还有什么方法?(5）芦丁、槲皮素的鉴定一、实验目的 1、学习
