1、BAP的诱导分离纯化及其功能的检测 生物化学大实验结题报告BAP的诱导、分离纯化及其功能的检测学生姓名： 学 号： 年 级： 专 业： 指导教师： 完成时间： BAP的诱导、分离纯化及其功能的检测摘 要：BAP能催化核酸分子脱掉5磷酸基团，是分子生物学中常用的底物专一性低的磷酸单酯酶。将BAP克隆在含有lac启动子的表达载体中，在培养基中加入诱导物IPTG（异丙基硫代-D-半乳糖）可使得阻遏蛋白不能与操纵基因结合，让其在E-coli中大量转录并表达。对细菌进行超声波破碎以后用亲和层析柱对其进行分离纯化，对其表达的蛋白进行SDS-PAGE检测和Western-blotting，用作特性分析。最后
2、通过与BAP标准样品的比较计算出其活力。关键词：BAP；分离纯化；SDS-PAGE；Western-blotting细菌性碱性磷酸酶属于同源二聚体蛋白，分子量为56KDa。每个单体由449个氨基酸组成，完整的AKP分子呈现典型的/的拓扑结构，同时每个单体均具有一个活性中心。细菌性碱性磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。而该脱去磷酸基团的过程被称为去磷酸化或脱磷酸化。其最适pH是8.0。本实验技术路线：重组蛋白的诱导表达重组蛋白的亲和层析纯化重组蛋白的分子筛排阻层析纯化SDS-PAG
3、E电泳及Western-blot鉴定重组蛋白重组蛋白活性的检测。1材料与方法1.1 菌种及实验用相关试剂大肠杆菌工程菌株BL21(DE3)，由生化实验室提供。葡聚糖G-75干粉、 Tris-HCl、NaCl、标准蛋白、IPTG（异丙基硫代-D-半乳糖）、starting buffer、咪唑、Marker、PVDF膜、TBS、吐温、一抗、酶标二抗，均由生化实验室提供。其它生化试剂和常规试剂均为分析纯。1.2 装柱及标准样品的分子筛层析 把柱子固定在夹子上，打开上面的盖，用取液器匀速加入介质。保证介质均匀沉淀，且要缓慢加入，防止产生气泡。待介质完全沉降打开柱的上盖，剪一与柱内径大小一致的圆形滤纸片
4、放入柱中，沉淀于介质表面。液体接近界面时加入3ml超纯水，同时在层析杯中加入100ml超纯水，连接泵洗柱15min，同时配制平衡液400mL（80mmol Tris-HCl,pH 8.0; 8mmol NaCl）。待液体接近界面时，在柱中加入3ml平衡液（其余平衡液加到层析杯中），调节流速，控制滴速为3ml/10min（一分钟约6-7滴）。平衡柱过中午。 缓慢向柱中加入样品1ml（牛血清蛋白(68kd)、糜蛋白酶(25kd) 二者比例为2:1，溶于200mmol Tris-HCl，pH 8.0; 20mmol NaCl）打开层析柱上端及下端的连接管，使样品靠重力流出。当样品接近界面时，在柱中加
5、入3ml 上样缓冲液，连接泵，调T=100 A(0.5A)=0，开启记录仪，同时配制100ml 0.1M Nacl。待两个峰都出来后，把层析杯中的液体换为0.1M Nacl洗柱20min，再用超纯水洗柱30min，封柱，关机。1.3 BAP的诱导表达首先进行预培养在5mlLB培养基中加入Amp 5l和10l菌液。在摇床上37130转过夜预培养。取2.5ml菌液加入50mlLB培养基（含有50l Amp），1:20扩培。37恒温摇床，190rpm培养40min。当OD600值达到0.5-0.7时，进行诱导表达，即加入工作浓度为1mM的IPTG(500ul)进行外源基因的诱导表达。于室温诱导5小时
6、。留样1ml ，其余放入冰箱于4度保存。1.4 超声波破碎诱导后的菌体，5000rpm离心15min，弃上清。加入1/10体积的破碎缓冲液洗涤。5000rpm离心15min 去上清，加入破碎缓冲液及终浓度为50l/5ml的溶菌酶。 30温浴15min。然后分装于小离心管中，每管0.5ml。 在冰浴条件下，60%功率超声处理4min。每五管一组，放于冰浴中连续处理，每管4秒，再重复，直到处理4min为止。再用40%功率超声处理4min。超声要求a将菌液处理至清亮；b始终保持低温环境；c避免出现黑色沉淀。将超声处理后的样品于4 2000rpm离心10min，沉淀为细胞碎片弃去。上清再于4 1200
7、0rpm离心10min。上清为可溶性蛋白，沉淀为包涵体。包涵体留样1ml，可溶性蛋白留样100l。1.5 亲和层析 每柱中装1.5ml的介质、乙醇混合液。打开底下的帽，待液体滴至界面时加超纯水洗5遍，然后加约4ml的starting buffer，5遍平衡柱。待液体接近界面时，用取液器将全部可溶性蛋白样品加入亲和柱。上柱2次。待样品流到界面时，用含10mM咪唑的淋洗液洗10柱体积。用3ml含有300mM咪唑的洗脱液洗脱，并且用epp管收集每管500l。留样100l，其余的洗脱样品用于分子筛层析。1.6 BAP的分子筛排阻层析 亲和层析的样品第2、3、4管分别取400l混匀于1.5ml离心管中上
8、柱，重力使之渗入柱子。样品接近界面时，加入1ml起始缓冲液。打开泵开始收集（加样时即打开读纸器），在峰顶处留样测定酶活。关读纸机。然后用20ml 0.1M Nacl的处理柱子。洗柱，用超纯水洗30min左右。1.7 SDS-PAGE检测和Western-blotting检测目的蛋白样品处理包涵体处理：在留样的沉淀中加入500l 8M的尿素，摇匀。取20l于1.5ml离心管中，再加入50l上样缓冲液，于100沸水中煮沸5min。菌体处理：将留样的1ml菌体于12000rpm离心1min，用滤纸吸干残液，用100l上样缓冲液重悬菌体，100沸水中煮沸5min。亲和层析样品处理：取亲和层析样品，2和
9、3号管各20l于1.5ml离心管中，再加入20l上样缓冲液，于100沸水中煮沸5min。待样品冷却后12000rpm离心5min。清洗电泳槽，玻璃板，胶条等电泳装置，然后用滤纸轻轻吸水晾干。组装玻璃板（凹面向外），封胶条要贴紧玻璃板，胶条下端要平直，并且胶条始终要自然弹性范围不要用力拽。准备一个小烧杯，配制12%的分离胶，混匀后立即用取液器加入玻璃板中，加至红线处。再加入1ml的超纯水，静置30min。待胶凝固后倾斜倒出超纯水。用滤纸吸干残液。配制5%浓缩胶，混匀后立即加入插上梳子的玻璃板面，直至没过柱子与玻璃板凹面相平。静置30min。待浓缩胶凝固后垂直拔下梳子，取出玻璃板，除去胶条，使玻璃
10、板凹面向内重新组装，然后向内外槽加入电极缓冲液。按顺序依次点样，两块胶一块做SDS染色（普通Marker），另一块做western杂交（点预染Marker）。Marker要提前处理。将电泳装置与电泳电源连接。调电压60V。待溴酚蓝前沿进入分离胶后，换成90V电压，直到溴酚蓝前沿跑出胶，再过半小时，关闭电源停止电泳。电泳完毕后，卸下玻璃板，小心撬开。用手术刀切去浓缩胶。将点有普通Marker的胶浸泡在染色液中。染色脱色水洗（过夜）。预染Marker的胶进行转膜处理。清洗转移电泳槽等装置。蒸馏水漂洗点有预染Marker的胶。然后浸泡在转移缓冲液中。戴上手套用镊子夹住PVDF膜。先在甲醇中精确处理1
11、5秒。然后放入蒸馏水槽中漂洗一下，最后放于盛有转移缓冲液的盆中平衡15min。同时将4片滤纸2块海绵浸泡在转移缓冲液中。尽量用玻璃棒赶去海绵中的气泡（否则易短路）。按照阴极黑板海绵垫2层滤纸凝胶PVDF膜2层滤纸海绵垫阳极红板的顺序装。80mA恒流下在转移电泳槽中冰浴电泳2.5小时。取出PVDF膜放于干燥滤纸上片刻，但不要吸干膜。灭菌去离子水中冲洗。将PVDF膜放入玻璃平皿中加入封闭液（10mlTBS，10ml，0.25g脱脂奶粉），在摇床上封闭2小时。取出PVDF膜，在1XTBS中漂洗2次后放入平皿中加入10ml一抗封闭液（10ml 1TBS，5l吐温，5l一抗，0.5g奶粉），在脱色摇床上
12、摇10min，然后4过夜孵育。取出膜后在1 TBS中漂洗2次。每次10min。放入10ml二抗封闭液中。孵育2小时。取一片DAB溶于37预热的10m超纯水。用玻璃棒搅拌至完全溶解。加入20l 30%的双氧水摇匀。倒入平皿中。将平皿放于抽屉暗处显色5min。取出膜用灭菌去离子水漂洗终止反应，然后用清水冲洗。1.8蛋白质浓度的测定取可溶性蛋白质、亲和层析样品2、3各50ul分别放于离心管中（两份），加灭菌超纯水稀释到500ul测定OD260及OD280的分光光度值。1.9酶活力测定 取5只1.5mlEP管标号15，向1#管中加入1ml超纯水。2#加50l总蛋白。3#管加50l分子筛峰处样，4#分别
13、加入50l亲和层析3号样。5#中加入1lBAP和1ml灭菌处理过的超纯水（先加水，后加BAP标准品）。2#、3#、4#管分别加超纯水稀释至1ml。 取5只试管，洗净后标号15每个试管中加入2ml底物溶液，再把相应编号的EP管中的溶液加入试管中。用力混匀。试管恒温37水浴反应5min。在每支试管中加入250l 1M NaOH溶液终止反应。在可见分光光度计测量OD410，计算3次平均值。计算酶活力。2 实验结果2.1 分子筛层析蛋白峰值图谱 使用自动蛋白核酸分离层析仪连接纸机记录标准蛋白（牛血清蛋白(68kD)、糜蛋白酶(25kD) 2:1混合液）及亲和层析的样品第2、3、4管混合样的出峰图谱。标
14、准蛋白分离情况不太好，主要是因为纸带没有固定好，有些不平整，走纸也就走的不匀速，可能还有杂蛋白存在的影响；亲和层析混合样峰值较预期结果偏低。2.2 SDS-PAGE电泳鉴定包涵体条带亲和层析样品条带总蛋白条带普通Maker条带以普通Marker为对照对已经过处理的总蛋白、包涵体、亲和层析样品进行SDS-PAGE电泳分析。电泳结果显示，各样品特异性较好；目的蛋白处于第8和第9条带之间，与普通Marker条带对比图对比可知，该目的蛋白的kD大概为48，符合预期结果。2.3 Western-blot鉴定以预染Marker为对照对已经过处理的总蛋白、包涵体、亲和层析样品进行Western-blot分析
15、。PVDF膜结果显示不是特别清晰，原因为转膜效果不够好，可能是由于海绵或滤纸过大，导致PVDF膜短路；但仍能看到目的样品所处的条带，其处于第5和第6条带之间（由于放置时间较久和转膜效果不理想，有些条带不是很清晰），与预染Marker条带对比图对比可知，该目的蛋白的kD大概为48，符合预期结果。2.4酶活力计算及分析1、数据记录使用可见光分光光度计分别检测1#管-1ml超纯水；2#-50l总蛋白 +950l超纯水；3#-50l亲和层析2号样+950l超纯水，4#-50l亲和层析3号样+950l超纯水。5#-1lBAP和1ml灭菌处理过的超纯水（先加水，后加BAP标准品），OD值。表一 样品OD4
16、10值 次数样品123平均值10.0000.0000.0000.00021.6541.6531.6531.65332.0952.094+2.0952.09543.0003.0003.0003.00052.1202.1202.1202.1202、数据处理（1）酶活力单位数：0.45U（标准品的活力单位） OD410 样品 稀释倍数OD410 标准品稀释倍数3#2号亲和层析样酶活力单位数为：0.45U=8.8910-3 U4#3号亲和层析样酶活力单位数为：0.45U=8.8910-3U（2）蛋白浓度：表二 样品OD280、OD260值 样品 OD值1#（稀释500倍）2#（稀释500倍）3#（稀释
17、500倍）OD2800.6460.0520.030OD2601.2500.0780.060蛋白浓度（mg/ml）=1.45OD280（稀释倍数）0.74OD260（稀释倍数）。离子交换层析后，蛋白浓度很低，OD260可能为负值。可溶性蛋白: 1.450.6465000.741.250500=0.117mg/ml2号亲和层析样:1.450.0525000.740.078500=0.746mg/ml3号亲和层析样:1.450.0305000.740.060500=0.648mg/ml（3）mg蛋白：mg蛋白= 蛋白浓度（mg/ml）蛋白体积可溶性蛋白: 0.117 mg/ml0.5ml=0.005
18、9 mg2号亲和层析样: 0.746 mg/ml0.5ml=0.37 mg3号亲和层析样：0.648 mg/ml0.5ml=0.324 mg（4）酶的比活力：酶的比活力=酶活力单位数/mg蛋白2号亲和层析样: 8.8910-3 U0.37mg=0.024 U / mg3号亲和层析样: 8.8910-3 U0.324 mg=0.0274 U /mg3 分析与讨论本次试验过程所得各号管测得数值均与预期值较相近，结果整体较好。但也存在不足，由于分子筛排阻层析中两种标准蛋白洗脱峰位置只出现一个，我们无法计算两种标准蛋白的洗脱体积，所以此项实验中我们不能得出目的蛋白质的分子量，这可能与胶的质量有关，也可能因为平衡液的滴加速度较快，也会影响蛋白的洗脱效果；电泳后转模效果不够好，可能是由于海绵或滤纸过大，导致PVDF膜短路。这些需要我们在以后的试验中注意和避免。本次试验条理清晰，目的明确，但工程菌株BL21的BAP基因克隆的实验没有接触，克隆技术是分子实验的基本实验之一，如果能在本实验中掌握，必定将会更加意义深刻。通过本次试验，我更深层次理解了蛋白是诱导表达的操纵子学说，分离纯化的亲和层析的中间产物学说，以及SDS-PAGE电泳及Western-blot鉴定技术的原理、优点及其应用。同时更在一定程度上认识了科学实验的过程设计。
