BAP的诱导分离纯化及其功能的检测.docx
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BAP的诱导分离纯化及其功能的检测
生物化学大实验结题报告
BAP的诱导、分离纯化及其功能的检测
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BAP的诱导、分离纯化及其功能的检测
摘要:
BAP能催化核酸分子脱掉5′磷酸基团,是分子生物学中常用的底物专一性低的磷酸单酯酶。
将BAP克隆在含有lac启动子的表达载体中,在培养基中加入诱导物IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖)可使得阻遏蛋白不能与操纵基因结合,让其在E-coli中大量转录并表达。
对细菌进行超声波破碎以后用亲和层析柱对其进行分离纯化,对其表达的蛋白进行SDS-PAGE检测和Western-blotting,用作特性分析。
最后通过与BAP标准样品的比较计算出其活力。
关键词:
BAP;分离纯化;SDS-PAGE;Western-blotting
细菌性碱性磷酸酶属于同源二聚体蛋白,分子量为56KDa。
每个单体由449个氨基酸组成,完整的AKP分子呈现典型的α/β的拓扑结构,同时每个单体均具有一个活性中心。
细菌性碱性磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶,即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去,并生成磷酸根离子和自由的羟基,这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。
而该脱去磷酸基团的过程被称为去磷酸化或脱磷酸化。
其最适pH是8.0。
本实验技术路线:
重组蛋白的诱导表达→重组蛋白的亲和层析纯化重组蛋白的分子筛排阻层析纯化→SDS-PAGE电泳及Western-blot鉴定重组蛋白→重组蛋白活性的检测。
1 材料与方法
1.1菌种及实验用相关试剂
大肠杆菌工程菌株BL21(DE3),由生化实验室提供。
葡聚糖G-75干粉、Tris-HCl、NaCl、标准蛋白、IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖)、startingbuffer、咪唑、Marker、PVDF膜、TBS、吐温、一抗、酶标二抗,均由生化实验室提供。
其它生化试剂和常规试剂均为分析纯。
1.2装柱及标准样品的分子筛层析
把柱子固定在夹子上,打开上面的盖,用取液器匀速加入介质。
保证介质均匀沉淀,且要缓慢加入,防止产生气泡。
待介质完全沉降打开柱的上盖,剪一与柱内径大小一致的圆形滤纸片放入柱中,沉淀于介质表面。
液体接近界面时加入3ml超纯水,同时在层析杯中加入100ml超纯水,连接泵洗柱15min,同时配制平衡液400mL(80mmolTris-HCl,pH8.0;8mmolNaCl)。
待液体接近界面时,在柱中加入3ml平衡液(其余平衡液加到层析杯中),调节流速,控制滴速为3ml/10min(一分钟约6-7滴)。
平衡柱过中午。
缓慢向柱中加入样品1ml(牛血清蛋白(68kd)、糜蛋白酶(25kd)二者比例为2:
1,溶于200mmolTris-HCl,pH8.0;20mmolNaCl)打开层析柱上端及下端的连接管,使样品靠重力流出。
当样品接近界面时,在柱中加入3ml上样缓冲液,连接泵,调T=100A(0.5A)=0,开启记录仪,同时配制100ml0.1MNacl。
待两个峰都出来后,把层析杯中的液体换为0.1MNacl洗柱20min,再用超纯水洗柱30min,封柱,关机。
1.3BAP的诱导表达
首先进行预培养在5mlLB培养基中加入Amp5μl和10μl菌液。
在摇床上37℃130转过夜预培养。
取2.5ml菌液加入50mlLB培养基(含有50μlAmp),1:
20扩培。
37℃恒温摇床,190rpm培养40min。
当OD600值达到0.5-0.7时,进行诱导表达,即加入工作浓度为1mM的IPTG(500ul)进行外源基因的诱导表达。
于室温诱导5小时。
留样1ml,其余放入冰箱于4度保存。
1.4超声波破碎
诱导后的菌体,5000rpm离心15min,弃上清。
加入1/10体积的破碎缓冲液洗涤。
5000rpm离心15min去上清,加入破碎缓冲液及终浓度为50μl/5ml的溶菌酶。
30℃温浴15min。
然后分装于小离心管中,每管0.5ml。
在冰浴条件下,60%功率超声处理4min。
每五管一组,放于冰浴中连续处理,每管4秒,再重复,直到处理4min为止。
再用40%功率超声处理4min。
超声要求a将菌液处理至清亮;b始终保持低温环境;c避免出现黑色沉淀。
将超声处理后的样品于4℃2000rpm离心10min,沉淀为细胞碎片弃去。
上清再于4℃12000rpm离心10min。
上清为可溶性蛋白,沉淀为包涵体。
包涵体留样1ml,可溶性蛋白留样100μl。
1.5亲和层析
每柱中装1.5ml的介质、乙醇混合液。
打开底下的帽,待液体滴至界面时加超纯水洗5遍,然后加约4ml的startingbuffer,5遍平衡柱。
待液体接近界面时,用取液器将全部可溶性蛋白样品加入亲和柱。
上柱2次。
待样品流到界面时,用含10mM咪唑的淋洗液洗10柱体积。
用3ml含有300mM咪唑的洗脱液洗脱,并且用epp管收集每管500μl。
留样100μl,其余的洗脱样品用于分子筛层析。
1.6BAP的分子筛排阻层析
亲和层析的样品第2、3、4管分别取400µl混匀于1.5ml离心管中上柱,重力使之渗入柱子。
样品接近界面时,加入1ml起始缓冲液。
打开泵开始收集(加样时即打开读纸器),在峰顶处留样测定酶活。
关读纸机。
然后用20ml0.1MNacl的处理柱子。
洗柱,用超纯水洗30min左右。
1.7SDS-PAGE检测和Western-blotting检测目的蛋白
样品处理
包涵体处理:
在留样的沉淀中加入500μl8M的尿素,摇匀。
取20μl于1.5ml离心管中,再加入50μl上样缓冲液,于100℃沸水中煮沸5min。
菌体处理:
将留样的1ml菌体于12000rpm离心1min,用滤纸吸干残液,用100μl上样缓冲液重悬菌体,100℃沸水中煮沸5min。
亲和层析样品处理:
取亲和层析样品,2和3号管各20μl于1.5ml离心管中,再加入20μl上样缓冲液,于100℃沸水中煮沸5min。
待样品冷却后12000rpm离心5min。
清洗电泳槽,玻璃板,胶条等电泳装置,然后用滤纸轻轻吸水晾干。
组装玻璃板(凹面向外),封胶条要贴紧玻璃板,胶条下端要平直,并且胶条始终要自然弹性范围不要用力拽。
准备一个小烧杯,配制12%的分离胶,混匀后立即用取液器加入玻璃板中,加至红线处。
再加入1ml的超纯水,静置30min。
待胶凝固后倾斜倒出超纯水。
用滤纸吸干残液。
配制5%浓缩胶,混匀后立即加入插上梳子的玻璃板面,直至没过柱子与玻璃板凹面相平。
静置30min。
待浓缩胶凝固后垂直拔下梳子,取出玻璃板,除去胶条,使玻璃板凹面向内重新组装,然后向内外槽加入电极缓冲液。
按顺序依次点样,两块胶一块做SDS染色(普通Marker),另一块做western杂交(点预染Marker)。
Marker要提前处理。
将电泳装置与电泳电源连接。
调电压60V。
待溴酚蓝前沿进入分离胶后,换成90V电压,直到溴酚蓝前沿跑出胶,再过半小时,关闭电源停止电泳。
电泳完毕后,卸下玻璃板,小心撬开。
用手术刀切去浓缩胶。
将点有普通Marker的胶浸泡在染色液中。
染色→脱色→水洗(过夜)。
预染Marker的胶进行转膜处理。
清洗转移电泳槽等装置。
蒸馏水漂洗点有预染Marker的胶。
然后浸泡在转移缓冲液中。
戴上手套用镊子夹住PVDF膜。
先在甲醇中精确处理15秒。
然后放入蒸馏水槽中漂洗一下,最后放于盛有转移缓冲液的盆中平衡15min。
同时将4片滤纸2块海绵浸泡在转移缓冲液中。
尽量用玻璃棒赶去海绵中的气泡(否则易短路)。
按照阴极黑板—海绵垫—2层滤纸—凝胶—PVDF膜—2层滤纸—海绵垫—阳极红板的顺序装。
80mA恒流下在转移电泳槽中冰浴电泳2.5小时。
取出PVDF膜放于干燥滤纸上片刻,但不要吸干膜。
灭菌去离子水中冲洗。
将PVDF膜放入玻璃平皿中加入封闭液(10mlTBS,10ml,0.25g脱脂奶粉),在摇床上封闭2小时。
取出PVDF膜,在1XTBS中漂洗2次后放入平皿中加入10ml一抗封闭液(10ml1×TBS,5μl吐温,5μl一抗,0.5g奶粉),在脱色摇床上摇10min,然后4℃过夜孵育。
取出膜后在1×TBS中漂洗2次。
每次10min。
放入10ml二抗封闭液中。
孵育2小时。
取一片DAB溶于37℃预热的10m超纯水。
用玻璃棒搅拌至完全溶解。
加入20μl30%的双氧水摇匀。
倒入平皿中。
将平皿放于抽屉暗处显色5min。
取出膜用灭菌去离子水漂洗终止反应,然后用清水冲洗。
1.8蛋白质浓度的测定
取可溶性蛋白质、亲和层析样品2、3各50ul分别放于离心管中(两份),加灭菌超纯水稀释到500ul测定OD260及OD280的分光光度值。
1.9酶活力测定
取5只1.5mlEP管标号1—5,向1#管中加入1ml超纯水。
2#加50μl总蛋白。
3#管加50μl分子筛峰处样,4#分别加入50μl亲和层析3号样。
5#中加入1μlBAP和1ml灭菌处理过的超纯水(先加水,后加BAP标准品)。
2#、3#、4#管分别加超纯水稀释至1ml。
取5只试管,洗净后标号1—5每个试管中加入2ml底物溶液,再把相应编号的EP管中的溶液加入试管中。
用力混匀。
试管恒温37℃水浴反应5min。
在每支试管中加入250μl1MNaOH溶液终止反应。
在可见分光光度计测量OD410,计算3次平均值。
计算酶活力。
2实验结果
2.1分子筛层析蛋白峰值图谱
使用自动蛋白核酸分离层析仪连接纸机记录标准蛋白(牛血清蛋白(68kD)、糜蛋白酶(25kD)2:
1混合液)及亲和层析的样品第2、3、4管混合样的出峰图谱。
标准蛋白分离情况不太好,主要是因为纸带没有固定好,有些不平整,走纸也就走的不匀速,可能还有杂蛋白存在的影响;亲和层析混合样峰值较预期结果偏低。
2.2SDS-PAGE电泳鉴定
包涵体条带
亲和层析样品条带
总蛋白条带
普通Maker条带
以普通Marker为对照对已经过处理的总蛋白、包涵体、亲和层析样品进行SDS-PAGE电泳分析。
电泳结果显示,各样品特异性较好;目的蛋白处于第8和第9条带之间,与普通Marker条带对比图对比可知,该目的蛋白的kD大概为48,符合预期结果。
2.3Western-blot鉴定
以预染Marker为对照对已经过处理的总蛋白、包涵体、亲和层析样品进行Western-blot分析。
PVDF膜结果显示不是特别清晰,原因为转膜效果不够好,可能是由于海绵或滤纸过大,导致PVDF膜短路;但仍能看到目的样品所处的条带,其处于第5和第6条带之间(由于放置时间较久和转膜效果不理想,有些条带不是很清晰),与预染Marker条带对比图对比可知,该目的蛋白的kD大概为48,符合预期结果。
2.4酶活力计算及分析
1、数据记录
使用可见光分光光度计分别检测1#管-1ml超纯水;2#-50μl总蛋白+950μl超纯水;3#-50μl亲和层析2号样+950μl超纯水,4#-50μl亲和层析3号样+950μl超纯水。
5#-1μlBAP和1ml灭菌处理过的超纯水(先加水,后加BAP标准品),OD值。
表一样品OD410值
次数
样品
1
2
3
平均值
1
0.000
0.000
0.000
0.000
2
1.654
1.653
1.653
1.653
3
2.095
2.094+
2.095
2.095
4
3.000
3.000
3.000
3.000
5
2.120
2.120
2.120
2.120
2、数据处理
(1)酶活力单位数:
×0.45U(标准品的活力单位)
OD410样品×稀释倍数
OD410标准品×稀释倍数
3#2号亲和层析样酶活力单位数为:
×0.45U=8.89×10-3U
4#3号亲和层析样酶活力单位数为:
×0.45U=8.89×10-3U
(2)蛋白浓度:
表二样品OD280、OD260值
样品
OD值
1#
(稀释500倍)
2#
(稀释500倍)
3#
(稀释500倍)
OD280
0.646
0.052
0.030
OD260
1.250
0.078
0.060
蛋白浓度(mg/ml)=1.45OD280(×稀释倍数)—0.74OD260(×稀释倍数)。
离子交换层析后,蛋白浓度很低,OD260可能为负值。
可溶性蛋白:
1.45×0.646×500—0.74×1.250×500=0.117mg/ml
2号亲和层析样:
1.45×0.052×500—0.74×0.078×500=0.746mg/ml
3号亲和层析样:
1.45×0.030×500—0.74×0.060×500=0.648mg/ml
(3)mg蛋白:
mg蛋白=蛋白浓度(mg/ml)×蛋白体积
可溶性蛋白:
0.117mg/ml×0.5ml=0.0059mg
2号亲和层析样:
0.746mg/ml×0.5ml=0.37mg
3号亲和层析样:
0.648mg/ml×0.5ml=0.324mg
(4)酶的比活力:
酶的比活力=酶活力单位数/mg蛋白
2号亲和层析样:
8.89×10-3U÷0.37mg=0.024U/mg
3号亲和层析样:
8.89×10-3U÷0.324mg=0.0274U/mg
3分析与讨论
本次试验过程所得各号管测得数值均与预期值较相近,结果整体较好。
但也存在不足,由于分子筛排阻层析中两种标准蛋白洗脱峰位置只出现一个,我们无法计算两种标准蛋白的洗脱体积,所以此项实验中我们不能得出目的蛋白质的分子量,这可能与胶的质量有关,也可能因为平衡液的滴加速度较快,也会影响蛋白的洗脱效果;电泳后转模效果不够好,可能是由于海绵或滤纸过大,导致PVDF膜短路。
这些需要我们在以后的试验中注意和避免。
本次试验条理清晰,目的明确,但工程菌株BL21的BAP基因克隆的实验没有接触,克隆技术是分子实验的基本实验之一,如果能在本实验中掌握,必定将会更加意义深刻。
通过本次试验,我更深层次理解了蛋白是诱导表达的操纵子学说,分离纯化的亲和层析的中间产物学说,以及SDS-PAGE电泳及Western-blot鉴定技术的原理、优点及其应用。
同时更在一定程度上认识了科学实验的过程设计。
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